酪蛋白胶束与多元活性分子的相互作用及其复合物特性.pdf

8 2023,Vol.44,No.14 食品科学 食品化学酪蛋白胶束与多元活性分子的相互 作用及其复合物特性郑 杰1，杨 敏1,2,*，甄晨波1，秦娟娟1（1.甘肃农业大学理学院，甘肃 兰州 730070；2.甘肃农业大学农业资源化学与应用研究所，甘肃 兰州 730070）摘 要：以酪蛋白胶束（casein micelles，MC）为基质，以单一原花青素（proanthocyanidin，PC）、儿茶素（catechin，Cat）、叶绿素铜钠（chlorophyllin sodium copper salt，Chl）或其二元组合为配体，通过热处理或热处理联合超声处理制备二元、三元复合物，系统分析了单一PC、Cat、Chl或其二元组合物与MC的相互作用，解析MC对多元分子的同时结合能力，表征复合物结构、微观形貌及热稳定性，探究三元复合物的抗氧化性以及体外模拟消化特性。结果表明，单一PC、Cat、Chl通过疏水相互作用与MC形成二元复合物，其中MC对Chl表现出较高的亲和力。热处理条件下，当MC以疏水作用结合一个分子后，另一个分子则以范德华力、氢键结合于MC上，且298 K时第1个分子的结合提升了第2个分子与MC的结合常数和结合位点数。PC、Cat、Chl单一分子或其二元组合物的结合对MC空间结构及微观形貌无显著影响。热处理条件下，活性分子的结合增加了MC的热稳定性。就抗氧化性而言，热处理改善了三元复合物的2,2-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)阳离子自由基清除力，而热处理联合超声处理改善了1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除活性。此外，多元活性分子的同时负载改善了MC在模拟肠液中的消化性。本研究结果可为MC在多元活性分子负载中的应用提供一定参考。关键词：原花青素；儿茶素；叶绿素铜钠；酪蛋白胶束；相互作用；抗氧化性；消化性Interactions between Casein Micelles and Various Active Molecules and Properties of Their ComplexesZHENG Jie1,YANG Min1,2,*,ZHEN Chenbo1,QIN Juanjuan1(1.College of Science,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;2.Institute of Agricultural Resources Chemistry and Application,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)Abstract:In this study,binary and ternary complexes were prepared by heat treatment or combined heat and ultrasonic treatment using casein micelles(MC)as matrix and proanthocyanidin(PC),catechin(Cat)and chlorophyllin sodium copper salt(Chl)or their binary combinations as ligands.The interactions between PC,Cat,Chl or their binary combinations and MC were analyzed,and the binding capacity of MC to the various active molecules was evaluated.In addition,the structure,microscopic morphology and thermal stability of the complexes were characterized,and the antioxidant properties and in vitro digestibility of the ternary complexes were investigated as well.The results showed that PC,Cat and Chl formed binary complexes with MC through hydrophobic interactions,among which MC showed the highest affinity for Chl.Under heat treatment conditions,MC bound one molecule through hydrophobic interaction and another one by van der Waals forces and hydrogen bonds.At 298 K,the binding of the first molecule improved the binding constant and the number of binding sites of the second one.The binding of PC,Cat,Chl or their binary complexes had no significant effect on the spatial structure or microscopic morphology of MC.The thermal stability of MC was enhanced after the binding of bioactive molecules under heat treatment conditions.In terms of antioxidant properties,heat treatment promoted the 2,2-azino bis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonicacid)(ABTS)radical cation scavenging activity of the ternary complexes,while combined heat and ultrasonic treatment promoted their 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)radical scavenging activity.In addition,收稿日期：2022-09-27基金项目：国家自然科学基金地区科学基金项目（32060549）；甘肃省自然科学基金项目（22JR5RA861）；甘肃农业大学伏羲杰出人才培育计划项目（Gaufx-02J02）第一作者简介：郑杰（1997）（ORCID:0000-0002-8770-9404），男，硕士研究生，研究方向为食品化学。E-mail:*通信作者简介：杨敏（1981）（ORCID:0000-0001-9491-3385），女，教授，博士，研究方向为食品化学。E-mail:食品化学 食品科学 2023,Vol.44,No.14 9the loading of active molecules improved the digestibility of MC in simulated intestinal fluid.This study could provide a reference for the application of MC in the loading of bioactive molecules.Keywords:proanthocyanidin;catechin;chlorophyllin sodium copper salt;casein micelle;interaction;antioxidant properties;digestibilityDOI:10.7506/spkx1002-6630-20220927-285中图分类号：TS252.1 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2023）14-0008-12引文格式：郑杰,杨敏,甄晨波,等.酪蛋白胶束与多元活性分子的相互作用及其复合物特性J.食品科学,2023,44(14):8-19.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220927-285.http:/ZHENG Jie,YANG Min,ZHEN Chenbo,et al.Interactions between casein micelles and various active molecules and properties of their complexesJ.Food Science,2023,44(14):8-19.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220927-285.http:/原花青素（proanthocyanidin，PC，图1A）是自然界广泛存在的一种类黄酮化合物，是构成植物果实、花瓣等组织颜色的主要水溶性色素。PC由不同数量的儿茶素（catechin，Cat）或表儿茶素聚合而成。依据不同的聚合度，可将PC分为单体、低聚物和高聚物，其中二聚体分布最广。研究表明，PC具有抗氧化、抗过敏、降血糖等多种生理活性1。此外，PC还被作为天然色素，广泛应用于食品工业。Cat（图1B）为PC结构的组成单元，是从茶叶中提取的一种天然黄酮类化合物，不但具有较强的抗炎、抗菌、抗氧化作用，还具有预防心脑血管疾病、抑制癌细胞增殖等功效2-3。叶绿素铜钠（chlorophyllin sodium copper salt，Chl，图1C）为叶绿素的衍生化合物，是一种允许添加在食品中的水溶性天然色素，且具有抗炎、抗菌、清除自由基、促进细胞新陈代谢等生物活性4。上述分子是常见的食源活性分子，因具有优异的生物活性、来源广泛和食用安全等优点，受到众多研究者的青睐。然而，它们稳定性差，在加工过程中易受光、热、pH值、氧化剂、酶等因素的影响而发生降解或者结构改变。此外，PC、Cat、Chl还表现出脂溶性差、亲水性强的性质，使其在亲脂体系中的应用较少3,5-6。以上诸多因素都限制了其在医药、食品等领域的使用。针对上述问题，众多研究者以大分子作为基质，采用乳化、喷雾干燥、酸化等技术构建出乳液、微胶囊、凝胶等不同类型的载体，通过物理作用对活性分子进行保护，在既不影响活性分子天然结构、又不会产生新的可能具有潜在危害物质的同时提高其稳定性及生理活性。研究表明，人工合成的两性多肽负载PC后，显著改善了PC对碱、金属离子和高温的敏感性7。黑豆分离蛋白的负载提高了PC的热稳定性8。玉米醇溶蛋白/壳聚糖纳米颗粒负载显著提高了Cat衍生物的抗氧化活性，并实现了对其的控释9。大豆分离蛋白负载后，Chl的稳定性有效提升10。由此可见，大分子负载可有效改善活性分子的稳定性及生物活性。然而，已有报道中的大分子载体及其对活性分子的负载均需要通过多个步骤实现，致使负载工艺复杂、成本高。另外，现有研究主要集中于载体对一种活性分子的负载方面，其对多元分子的负载研究较少。因此，有必要寻求一种天然大分子基质，无需复杂的构建和负载工艺即可实现多个活性分子的负载。OOOHHOOHOHOHOOHOHHOHOOHAOOHHOOHOHOHBNNNNCuH3CH3CCOONaCOONaCOONaCH3CH3CH2CH3C图 1 PC（A）、Cat（B）、Chl（C）的分子结构Fig.1 Molecular structures of PC(A),Cat(B),and Chl(C)酪蛋白是动物乳中特有的一种含磷、钙的结合蛋白质，由4 种不同类型单体组成（s1s24 1 4 1）。4 种单体间通过非共价相互作用以及钙桥形成直径约为80400 nm的超分子胶束粒子，称为酪蛋白胶束（casein micelles，MC）；MC具有“内部疏水、外部亲水”的特殊空间结构，是天然纳米载体的首选基质之一11。MC具有活性分子的多个作用位点，由于其为多孔型纳米颗粒，活性分子不仅可以结合于MC表面的肽链上，还可以进入结构内部，与多肽链结合，且形成交联作用。课题组前期研究发现，MC对大黄素12、咖啡酸及10 2023,Vol.44,No.14 食品科学 食品化学咖啡酸苯乙酯13均表现出较强的结合作用；另外，也有研究指出，MC具有负载VD2、VD3的能力，可通过负载提升活性分子的溶解性、稳定性以及生物活性14-15。截至目前，MC与小分子的结合作用研究主要集中于单一分子，其对多种分子的结合作用及负载能力尚不清楚。而多种活性分子联合使用可能会产生协同作用，对人体健康产生多种益处16。例如，-乳球蛋白与香草酸、阿魏酸、槲皮素形成的三配体复合物表现出良好的稳定性与抗氧化活性，且三配体复合物的抗氧化性显著强于单一配体17。-乳球蛋白同时负载PC B2和二氢杨梅素，具有增强活性分子稳定性和协同细胞毒性的作用18。本研究在前期研究的基础上，选择了食源色素PC和Chl，以及PC的结构单元Cat作为模型分子，采用荧光分析法系统分析热处理和热处理联合超声处理下MC与PC、Cat、Chl单一分子及其二元组合物的相互作用，对比3 种分子与MC的结合常数及结合作用力，分析MC负载过程中分子间的相互影响，探讨MC对多元分子的同时负载能力。同时，研究二元及三元复合物的结构、表面形貌、热稳定性以及抗氧化性能，并评价复合物的体外模拟消化情况。研究结果可为MC在负载多元活性分子中的应用提供参考依据。1 材料与方法1.1 材料与试剂MC参照团队前期研究方法13制备，将巴氏杀菌牛乳在4 000g离心30 min，所得脱脂乳进行膜过滤，截留分子质量为100 kDa，跨膜压力为0.4 MPa，流速为 480 L/h。收集截留浓缩液后冷冻干燥至质量恒定，即得MC，其蛋白质质量分数为（83.261.87）%。PC、()-Cat、Chl、胃蛋白酶（15 000 U/mg）、胰蛋白酶（2 500 U/mg）上海麦克林生化科技有限公司；其他试剂均为分析纯。1.2 仪器与设备NAI-GZJ型实验室小型喷雾干燥机 上海那艾精密仪器有限公司；RF-5301PC荧光分光光度计、S-3400N扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）日本日立公司；Nicolet iS50傅里叶变换红外光谱仪（Fourier transform infrared spectrometer，FTIR）美国赛默飞世尔科技公司；STA 449 F5热重-差示扫描量热分析仪（thermogravimetric-differential scanning calorimetry，TG-DSC）德国耐驰仪器制造有限公司；SFX550超声处理仪 美国布兰森超声波公司；DYY-6D型电泳仪 北京六一生物科技有限公司。1.3 方法1.3.1 二元、三元复合物的制备二元复合物的制备：将MC溶解于0.05 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.86）中，制备质量浓度为2 g/L的储备液。将PC充分溶解于0.05 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.86），制备浓度为0.004 mol/L PC溶液。取不同体积PC溶液与20 mL MC溶液混合，用空白缓冲溶液补充，使混合液体积相等，分别置于298、310、318 K水浴中恒温处理20 min，即为热处理组；混合液分别置于298、310、318 K水浴中恒温处理2 min后，将12.7 mm超声波探头置于样品中心超声处理1 min，超声振幅为30%、脉冲开启时间5 s、关闭时间1 s，即为热处理联合超声处理组。处理后的溶液在避光条件下冷却至室温，贮存备用；其中PC终浓度分别为0、20、40、60、80、100 mol/L，记作PC-MC复合物。Cat-MC、Chl-MC复合物的制备过程同PC-MC复合物制备过程。其中，混合溶液中Cat终浓度分别为0、100、200、300、400、500 mol/L；Chl终浓度分别为0、10、20、30、40、50 mol/L。三元复合物的制备：首先制备出PC-MC或Cat-MC的二元复合物，其中PC、Cat的终浓度分别为60、300 mol/L（约为PC和Cat对MC荧光猝灭50%时的浓度，下同；MC终质量浓度为2 g/L）。将不同浓度Cat或PC分别加入PC-MC或Cat-MC二元复合物中，均匀混合后，分别进行热处理或热处理联合超声处理，形成相应的三元复合物记作PC-MC-Cat（Cat终浓度为0、100、200、300、400、500 mol/L）或Cat-MC-PC（PC终浓度为0、20、40、60、80、100 mol/L）。PC-MC-Chl和Chl-MC-PC复合物的制备与上述方法相同，初始二元复合物中PC、Chl的终浓度分别为60、30 mol/L（MC终质量浓度为2 g/L；PC-MC-Chl中Chl终浓度为0、10、20、30、40、50 mol/L；Chl-MC-PC中PC终浓度为0、20、40、60、80、100 mol/L）。使用喷雾干燥机对复合物进行喷干处理，设定出口温度130，物料流量300 mL/h，撞针间隔时间1 s。收集喷干后的粉末样品冷藏备用。1.3.2 荧光光谱分析复合物内源荧光光谱由荧光分光光度计测定，激发波长280 nm，激发和发射狭缝均为10 nm，记录样品在300500 nm区间的内源荧光光谱。通过Stern-Volmer方程（式（1）确定PC、Cat、Chl或其二元组合对MC内源荧光的猝灭机理19。F?1?Kq0Q?1?KsvQF0（1）式中：F0、F分别为加入小分子前后的荧光强度；Ksv为动态猝灭常数/（L/mol）；Kq为散射碰撞猝灭常 数/（L/（mols）；0为不存在猝灭剂时荧光体的食品化学 食品科学 2023,Vol.44,No.14 11寿命，生物大分子的平均寿命为108 s；Q为小分子浓 度/（mol/L）。PC、Cat、Chl与MC结合的结合常数（Ka）、结合位点数（n）通过双对数方程（式（2）计算：FF0?Flg?lgKa?nlgQ（2）通过Vant Hoff方程（式（3）、（4）计算MC与小分子结合反应的吉布斯自由能变（G）、熵变（S）和焓变（H）：RRTlnKa?SH?（3）G?H?TS（4）式中：Ka为对应温度下MC与小分子的结合常 数/（L/mol）；R为理想气体常数/（J/（Kmol）；T为处理温度/K；G为吉布斯自由能变/（J/mol）；H为焓变/（J/mol）；S为熵变/（J/（molK）。1.3.3 FTIR测定将复合物粉末置于衰减全反射（attenuated total reflection，ATR）元件，选择分辨率为4 cm1，在透射模式下采用FTIR仪扫描5004 000 cm1之间的红外光谱。1.3.4 SEM测定取适量复合物粉末置于铜台上的导电胶条表面，小心涂抹使其分散为薄层，喷金后采用SEM观察，电压12.0 kV。1.3.5 TG-DSC分析参照Qin Juanjuan等13的方法。准确称取46 mg样品，以同规格空坩埚作为参比，测定复合物在25500 区间内热稳定性，升温速率5/min。1.3.6 抗氧化性分析制备浓度为0.1 mmol/L 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）储备液。将3 mL DPPH自由基储备液与0.4 mL复合物溶液均匀混合，室温避光静置20 min，测定混合液在517 nm波长处吸光度，记为A1；将3 mL无水乙醇与0.4 mL复合物溶液均匀混合，吸光度记为A2；将3 mL DPPH自由基储备液与0.4 mL磷酸盐缓冲液均匀混合，吸光度记为A0。按式（5）计算DPPH自由基清除能力20：DPPH?/%?1?100A0A1?A2（5）制备7.4 mmol/L 2,2-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2-azino-bis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）原液和2.6 mmol/L过硫酸钾原液，将二者混合均匀并避光保存12 h；用pH 7.4磷酸盐缓冲液稀释至734 nm波长处吸光度为0.700.02，获得ABTS阳离子自由基储备液。将3 mL ABTS阳离子自由基储备液与50 L复合物溶液均匀混合后，室温静置6 min，测定混合液在734 nm波长处的吸光度。按式（6）计算ABTS阳离子自由基清除能力：ABTS?/%?1?100A0As（6）式中：A0为ABTS阳离子自由基储备液与磷酸盐缓冲液混合后的吸光度；As为ABTS阳离子自由基储备液与复合物溶液混合后的吸光度。1.3.7 体外模拟胃肠消化性分析样品的体外模拟消化性采用课题组已有方法测定，稍作修改12。将2 g氯化钠和0.032 g胃蛋白酶溶解在1 L去离子水中，并用浓盐酸将pH值调至1.2，得到模拟胃液（simulated gastric fluid，SGF）。在1 L去离子水中加入6.8 g磷酸二氢钾和0.1 g胰蛋白酶，用氢氧化钠调节溶液pH值至7.5，充分溶解后得到模拟肠液（simulated intestinal fluid，SIF）。将0.1 g复合物粉末置于10 mL试管中，加入2 mL SGF，37、130 r/min水浴振荡120 min，每60 min取样10 L。模拟肠消化在相同条件下进行4 h，以20、40、60、120 min和240 min为时间节点，每次取样10 L12。将取出后的消化液与聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液1 1混合均匀，水浴煮沸4 min，4 000 r/min离心4 min，随后将6 L混合液注入凝胶轨道并在150 V恒压下进行电泳，观察MC的胃肠模拟消化情况。1.4 数据统计分析所有数据均采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析，数据间差异显著分析采用Duncan法，P0.05，差异显著；数据以 s表示，所有数据至少为3 次实验结果。2 结果与分析2.1 MC与PC、Cat、Chl的相互作用分析2.1.1 荧光光谱分析由图2A1A3、B1B3可知，各条件处理组中，MC在336 nm（最大发射波长）处的荧光强度随着分子浓度的增加而降低，表明活性分子与MC形成了复合物。此外，随着Cat、Chl浓度的增加，MC的最大发射波长呈现蓝移现象；而PC的加入则导致其红移，说明PC的结合使MC上色氨酸残基微环境亲水性增强。相同条件处理下，Chl对MC的内源荧光猝灭效果最强，Cat最弱，表明MC与Chl之间的相互作用最强。尽管Cat是PC的结构单元，但它与MC的相互作用比PC弱，可能是由于PC结构中存在更多的黄酮单元，可与MC上不同肽链的氨基酸残基间形成非共价作用。三元复合物中，Cat和Chl的加入导致PC-MC复合物的最大发射波长发生蓝移；但PC的加入导致Cat-MC和Chl-MC最大发射波长红移，与它们对游离MC的影响相似（图2A4A7、B4B7）。与游离MC相比，二元复合物最大发射波长的移动程度更大，表明二元分子的组合对MC的色氨酸微环境有更大的影响。12 2023,Vol.44,No.14 食品科学 食品化学0300400350450500200300A110015025050?/nm0 mol/L20 mol/L80 mol/L40 mol/L60 mol/L100 mol/L0300400350450500200300A210015025050?/nm0 mol/L100 mol/L400 mol/L200 mol/L300 mol/L500 mol/L0300400350450500200300A310015025050?/nm0 mol/L10 mol/L40 mol/L20 mol/L30 mol/L50 mol/L0300400350450500200300A410015025050?/nm0 mol/L100 mol/L400 mol/L200 mol/L300 mol/L500 mol/L0300400350450500200300A510015025050?/nm0 mol/L20 mol/L80 mol/L40 mol/L60 mol/L100 mol/L0300400350450500200300A610015025050?/nm0 mol/L10 mol/L40 mol/L20 mol/L30 mol/L50 mol/L0300400350450500200300A710015025050?/nm0 mol/L20 mol/L80 mol/L40 mol/L60 mol/L100 mol/L0300400350450500200300B110015025050?/nm0 mol/L20 mol/L80 mol/L40 mol/L60 mol/L100 mol/L0300400350450500200300B210015025050?/nm0 mol/L100 mol/L400 mol/L200 mol/L300 mol/L500 mol/L0300400350450500200300B310015025050?/nm0 mol/L10 mol/L40 mol/L20 mol/L30 mol/L50 mol/L0300400350450500200300B410015025050?/nm0 mol/L100 mol/L400 mol/L200 mol/L300 mol/L500 mol/L0300400350450500200300B510015025050?/nm0 mol/L20 mol/L80 mol/L40 mol/L60 mol/L100 mol/L食品化学 食品科学 2023,Vol.44,No.14 130300400350450500200300B610015025050?/nm0 mol/L10 mol/L40 mol/L20 mol/L30 mol/L50 mol/L0300400350450500200300B710015025050?/nm0 mol/L20 mol/L80 mol/L40 mol/L60 mol/L100 mol/L下标17.PC-MC、Cat-MC、Chl-MC、PC-MC-Cat、Cat-MC-PC、PC-MC-Chl、Chl-MC-PC。图 2 热处理（A）或热处理联合超声（B）处理下 二、三元复合物荧光光谱图Fig.2 Fluorescence spectra of binary or ternary complexes with heat treatment(A)or combined heat and ultrasonic treatment(B)为了探究PC、Cat、Chl对MC内源荧光的猝灭机理，利用Stern-Volmer方程计算了Ksv和Kq19。由表1可知，各处理组中二元、三元复合物的Kq值远大于最大Kq值（2.01010 L/（mols），表明3 种小分子及其二元组合物对MC内源荧光的猝灭机理均为静态猝灭，形成了稳定性较高的静态复合物21。二元复合物Chl-MC的Ksv和Kq值均高于PC-MC和Cat-MC，这与荧光强度的变化趋势一致。此外，三元复合物的Ksv和Kq值与二元复合物接近，表明MC具有同时结合两个分子的能力。表 1 热处理或热处理联合超声处理下PC、Cat和Chl对MC的结合参数Table 1 Binding parameters of MC to PC,Cat or Chl with heat treatment or combined heat and ultrasonic treatment样品T/K处理方式Ksv/（104 L/mol）Kq/（1012 L/（mols）Ka/（104 L/mol）nH/（kJ/mol）S/（J/（molK）G/（kJ/mol）PC-MC298H2.100.122.100.123.661.591.070.0517.91147.4526.03U1.910.121.910.122.982.061.060.0743.59233.1525.53310H1.890.101.890.104.341.461.090.0417.91146.5427.52U1.840.031.840.036.331.201.140.0243.59233.7028.50318H1.780.101.780.105.602.221.130.0817.91147.2128.90U1.780.121.780.129.261.581.190.0543.59233.3030.24Cat-MC298H0.180.0090.180.0090.500.161.150.063.9784.1421.10U0.200.0060.200.0060.620.161.150.0515.58124.9221.65310H0.160.0080.160.0080.540.151.150.053.9781.0821.17U0.170.0060.170.0060.740.121.190.0415.58124.3422.97318H0.150.0090.150.0090.560.151.170.053.9784.1822.80U0.150.0060.150.0060.910.081.240.0215.58124.7624.10Chl-MC298H8.470.218.470.21109.222.691.280.0948.62278.7434.45U7.190.167.190.1671.461.751.250.0586.68402.9533.40310H8.310.428.310.42450.971.501.420.0448.62284.3639.54U6.820.576.820.57181.721.561.350.0486.68399.4537.15318H7.440.687.440.68458.681.691.430.0548.62280.2640.55U8.160.648.160.64375.601.501.450.0486.68402.0041.15样品T/K处理方式Ksv/（104 L/mol）Kq/（1012 L/（mols）Ka/（104 L/mol）nH/（kJ/mol）S/（J/（molK）G/（kJ/mol）PC-MC-Cat298H0.330.020.330.020.730.161.110.06100.24262.4322.03U0.410.020.410.020.550.141.050.0443.0372.7721.34310H0.310.0030.310.0030.510.111.070.02100.24252.3622.00U0.370.0070.370.0070.440.111.030.0243.0368.9821.64318H0.220.0080.220.0080.280.150.860.05100.24259.7017.65U0.310.020.310.020.370.131.010.0343.02971.7520.21Cat-MC-PC298H1.040.111.040.113.041.871.130.06109.88282.9125.58U1.480.071.480.072.511.571.040.0732.5925.1225.10310H0.870.050.870.052.510.751.120.09109.88270.2326.11U1.320.091.320.091.511.551.030.0732.5925.1124.80318H0.730.060.730.060.280.110.900.05109.88279.4721.01U1.340.111.340.111.101.560.980.0832.5925.1224.60PC-MC-Chl298H6.360.236.360.23 1 278.311.66 1.540.05104.47241.5440.54U5.860.305.860.3042.831.311.200.0370.31343.7432.13310H5.970.405.970.40691.131.551.480.04104.47206.0840.59U6.510.586.510.5867.442.771.240.1070.31338.3834.59318H6.930.696.930.69118.732.371.290.08104.47212.2436.98U7.200.587.200.58214.292.131.350.0770.31342.2938.54Chl-MC-PC298H1.460.091.460.094.761.821.130.0655.6197.0726.69U1.430.081.430.082.101.651.040.0639.2849.0424.67310H1.260.041.260.041.450.651.020.0555.6199.7224.70U1.440.021.440.021.360.851.000.0239.2847.5624.54318H0.980.040.980.041.070.481.010.0455.6197.7924.52U1.670.041.670.040.820.150.920.0139.2848.6423.82注：H.热处理；U.热处理联合超声处理。2.1.2 结合常数和结合位点数分析对于静态猝灭机制，Ka与n可通过双对数方程计算，结果如表1所示。相同条件处理下，二元复合物的Ka值均随温度的升高而升高，表明结合过程为吸热过程。此外，两种处理条件下，PC-MC、Cat-MC、Chl-MC在各温度下的Ka值均高于103，且遵循ChlPCCat，表明MC对Chl具有更强的亲和力。PC与MC的Ka值高于其与-酪蛋白的Ka（103），与-乳球蛋白的Ka22-23相似。Cat和MC的Ka值高于其与大豆分离蛋白（102）和-乳球蛋白的Ka值24-25。Chl和MC的Ka值高于其与大豆蛋白的Ka值（104）10。此外，MC对大黄素、咖啡酸、咖啡酸苯乙酯也表现出较强的结合作用12-13。可见，MC是一种生物活性分子的天然纳米载体。Chl-MC复合物在热处理条件下的Ka值高于热处理联合超声处理，而Cat-MC复合物的Ka则表现出相反的趋势。这可能是因为MC和Chl之间的强相互作用导致Chl很容易与MC结合，而超声波产生的空化作用削弱了二者间的结合作用。对于Ka值较低的Cat而言，超声产生的空化作用通过增加它们的碰撞加速Cat与MC结合。此外，由于其分子体积小，空化作用可以使Cat轻松进入胶束内部区域并与MC牢固结合。除热处理联合超声处理下的PC-MC-Chl复合物外，在三元复合物中，第2个分子结合的Ka值随处理温度的续表114 2023,Vol.44,No.14 食品科学 食品化学增加而减小，这表明低温有助于三元复合物的形成。此外，298 K热处理条件下，Chl和Cat与二元复合物结合的Ka值比它们与游离MC结合的Ka值大，而PC的Ka值变化与此相反，这可能是由于PC分子体积较大，其与MC的结合域与其他分子不同所致。总的来说，MC可以连续结合两个生物活性分子，并具有较单一分子高或相似的结合强度。298 K时，热处理下的三元复合物的Ka值高于热处理联合超声处理，这表明当MC与一个分子结合后，超声处理不利于另一个分子的结合。由表1可知，MC上有一个PC或Cat的结合位点。PC-乳球蛋白和Cat-大豆分离蛋白也表现出类似的 结果23-24。MC上Chl的结合位点数较PC和Cat多，表明Chl与MC产生结合作用的基团比PC、Cat更多。298 K