家族性VHL综合征患者家系突变类型及二次打击的分析.pdf

现代泌尿外科杂志临床研究家族性VHL综合征患者家系突变类型及二次打击的分析潘骏1,陈禹鑫1,逮艳文1,董翔，杨海洋,张古田1，甘卫东1,郭宏骞1（1.南京大学医学院附属鼓楼医院泌尿外科，江苏南京2 10 0 0 8；2.江苏大学鼓楼临床医学院，江苏镇江2 12 0 0 0）Analysis of family mutation type and two-hit hypothesis of a familial VHL Syn-drome patientPAN Jun,CHEN Yuxin,LU Yanwen,DONG Xiang,YANG Haiyang,ZHANG Gutian,GAN Weidong,GUO Hongqian(1.Department of Urology,Affiliated Drum Tower Hospital of Medical College of Nanjing University,Nan-jing 210008;2.Drum Tower Clinical Medical College of Jiangsu University,Zhenjiang 212000,China)ABSTRACT:Objective To explore the mutation type,clinical characteristics,molecular genetics and the two-hit type of apatient with familial Von Hippel Lindau(VHL)syndrome.Methods The data of the patient were collected.DNA wasextracted from the peripheral blood and renal cell carcinoma sample.The VHL gene germline mutation site was detected withhigh throughput sequencing next generation sequencing(NGS).The two-hit site was identified with UCSCXena database,methylation-specific PCR(MSP)and microsatellite stability detection.ResultsThe mutation site of the embryo line waslocated in c.5ooGA R167Q mutation.The patient had single nucleotide polymorphism,but no clear loss of heterozygosity,methylation or system mutation.Conclusion The germline mutation in exon 3 is the basis for the clinical features of thisfamilial renal cell carcinoma proband.The identification of the two-hit site is key to the occurrence of the disease,which issignificant for the diagnosis and treatment.The use of the databases can guide the screening of mutations and methylation sitesin familial renal cell carcinoma.KEY WORDS:renal cell carcinoma;VHL;syndrome;familial;database;two-hit hypothesis摘要：目的分析家族性希佩尔林道（VHL)综合征患者家系的突变类型、临床特征，探索VHL患者发病的分子遗传学机制，及其二次打击的类型。方法收集VHL患者家系资料，并在先证者外周血和肾癌标本中提取DNA，通过高通量测序(NGS)检测患者VHL基因胚系突变位点，并通过UCSCXena数据库、甲基化特异性PCR法（MSP）、微卫星稳定性检测来明确患者的第二次打击位点。结果NGS测序发现胚系突变位点位于第3外显子上的c.500GAR167Q突变，依据UCSCXena数据库、MSP分析、微卫星稳定检测结果提示患者存在单核苷酸多态性，未见明确杂合性缺失、甲基化、体系突变。结论第3外显子的胚系突变是该家族性肾癌先证者出现临床特征的基础，第二次打击位点是疾病发生的关键，对家族性肾癌家系的胚系突变和第二次打击位点的研究对患者及患者家系的诊断及治疗有指导意义。数据库的利用能够为家族性肾癌突变、甲基化位点的筛选进行指导。关键词：肾细胞癌；希佩尔林道综合征；家族性；数据库；二次打击中图分类号：R692希佩尔林道（Von Hippel Lindau，V H L)综合征是一种常染色体显性肿瘤，其特征是视网膜和中枢神经系统血管母细胞瘤、肾透明细胞癌（clear cell re-nal cell carcinomas,ccRCC）、嗜铬细胞瘤（pheochro-mocytoma,PCC)、胰岛肿瘤和内淋巴囊肿瘤1。VHL基因突变是VHL综合征的启动因素2 ，根据突变类型为体系还是胚系而分为散发性VHL突变收稿日期：2 0 2 2-11-2 1修回日期：2 0 2 3-0 4-13基金项目：北京融合医学发展基金会项目通信作者：甘卫东，主任医师。E-mail：g w d n ju.e d u.c n作者简介：潘骏，硕士研究生在读。研究方向：TFE3易位性肾癌。E-mail:2023年9 月第2 8 卷第9 期文献标志码：Ahttp:/jmurology.xjtu.edu,cn;zgmnwk.cug.top799D0I:10.3969/j.issn.1009-8291.2023.09.014型ccRCC和家族性VHL综合征3；文献报道，家族性VHL综合征的发病机理符合二次打击理论4，甲基化及杂合性缺失都是导致患者VHL失活的重要机制5-6 ,其中甲基化属于沉默抑癌基因的一种机制7,杂合性缺失(loss of heterozygosity,LOH)则在多阶段致癌过程中可导致肿瘤抑制基因等位基因的丢失8 。另外，单核苷酸多态性（single nucleotidepolymorphisms,SNP)在患者发病中也起到了重要作用9。本研究收集到一个家族性VHL综合征患者的外周血及病理样本，并提取DNA进行高通量基因检800测,研究该家族性 VHL综合征患者的胚系突变类型,并通过UCSCXena数据库、甲基化特异性聚合酶链式反应法（methylation specific polymerase chainreaction,MSP）、微卫星稳定性检测分别针对LOH、甲基化、突变及SNP进行实验及验证，分析患者可能的第二次打击位点及相关致病因素。1资料与方法1.1一般资料患者（先证者)男性，52 岁,因左侧腰痛2 月余于南京大学医学院附属鼓楼医院就诊，发现左肾肿瘤，遂收住入院行左肾肿瘤刻除术。患者2010年于当地医院行右肾肿瘤刻除术，术后病理提示ccRCC。患者分别于2 0 13年10 月、2 0 14年2 月于当地医院发现双侧肾上腺占位，并行双侧肾上腺切J Mod Urol,Vol.28 No.9 Sep.2023除术，术后病理提示PCC。2 0 16 年因右肾肿瘤复发，于上海市长海医院行右肾切除术，术后病理提示右肾ccRCC。经过患者本人及家属同意后，对其家系中2 2 人进行研究，其中8 人患有多系统疾病，2 人曾被考虑为VHL综合征但并未行进一步病理诊断（图1)。患病者分别为：I1(先证者的母亲)患肾肿瘤、I 8（先证者）患双侧肾 ccRCC合并双侧肾上腺PCC、I I 2(先证者的哥哥)患单侧肾肿瘤、4（先证者的哥哥)患视网膜血管母细胞瘤、9(先证者的姐姐)患单侧肾肿瘤、1（先证者的侄女）患双侧肾上腺PCC、I 2（先证者的侄女)患颅内血管肿瘤、7（先证者的侄子)患双侧肾ccRCC合并双侧肾上腺PCC。死亡女性成员死亡男性成员II正常女性成员2正常男性成员患病女性成员患病男性成员123453467596107先证者TIV2图1VHL综合征患者家族系谱图1.2试验方法1.2.1高通量测序（next generation sequencing，NGS)10将患者肾肿瘤切除术后的病理白片送上海仁东医学科技有限公司测序后进行序列分析，使用基于单分子聚合酶链式反应（single molecule-poly-merase chain reaction,SM-PCR)技术的肿瘤基因突变检测试剂盒富集血液样本关于遗传性肿瘤等642个相关基因区域的ctDNA片段，使用NextSeqCN500基因测序仪，对相关基因的全部外显子区域进行捕获测序，在DNA水平上分析相关基因的点突变、插入缺失、重排、拷贝数等突变形式。1.2.2甲基化位点预测研究UCSCXena数据库(http:/xena.ucsc.edu/）是一个基因组相关数据库，汇集了约2 0 0 个公共数据库，包括癌症基因组图谱计划（the cancer genome atlas,TCGA)数据库、癌细胞百科全书（cancer cell line encyclopedia,CCLE)数据库等。该数据库可用于检查拷贝数和甲基化、体细胞突变、基因表达、蛋白质表达和可视化，以及解释癌症基因组学数据可视化和解释癌症基因组学数3据1。依据UCSCXena数据库中包含的TCGA数据库病例作为病例筛选的基本数据，后根据VHL基因来添加数据集，选择所需要的甲基化数据集，分别选择仅包含启动子的区域，含2 7 0 0 0 0 个甲基化位点的模式，以及包含启动子和基因内部的区域，有450000个位点的模式，最终获得致病的甲基化突变位点。1.2.3MSP 检测VHL 基因甲基化12 200L新鲜血液提取基因组。经亚硫酸盐转化进行甲基化修饰：取已提取的DNA50L，加人2mol/L NaOH溶液5L。37 条件下变性10min。加人10 mmol/L对苯二酚30 L、3m o l/LNaHSOs溶液52 0 L。50 水浴16 h进行甲基化修饰。引物设计：针对VHL的转录起始位点上游2000bp至下游10 0 bp是启动子区域，根据该区域设计甲基化与非甲基化的引物组。共设计出5组引物，每一组引物包括了上游引物及下游引物（MF：为甲基化的上游引物;MR：为甲基化的下游引物；UF：为非甲基化的上游引物；UR：为非甲基化的下游引http:/jmurology.xjtu.edu,cn;zgmnwk.cug.top采用现代泌尿外科杂志物），同时从既往报道的VHL综合征甲基化病例中引用另一对引物13。MSP：参考JAMES及参考文献等的方法14，对转化的DNA进行PCR扩增，PCR反应条件：95热启动5min，95变性30 s，表 1引物序列表名称M1-FM1-RUM1-FUM1-RM2-FM2-RUM2-FUM2-RM3-FM3-RUM3-FUM3-RM4-FM4-RUM4-FUM4-RM5-FM5-RUM5-FUM5-RM6-FM6-RUM6-FUM6-RM:甲基化;UM代表非甲基化;F：上游引物;R：下游引物。1.2.4微卫星稳定性检测患者行肾肿瘤切除术后其病理白片被送至上海仁东医学科技有限公司，进行测序及序列分析，微卫星-聚合酶链式反应（microstar international-polymerase chain reaction,MSI-PCR)技术的肿瘤基因微卫星位点检测试剂盒富集血液样本，使用NextSeq CN500 基因测序仪，针对642个相关基因区域的全部外显子进行捕获。1.2.5SNP位点检测查阅参考文献，找到与VHL综合征相关的SNP位点，即rs164274216、rs77980517，对所取样本进行全外显子捕获测序2023年9 月第2 8 卷第9 期GGAGGATTATTTGAATTTAGGAGTTCTTAAAACAAAATCTCACTCTATCGCGGATTATTTGAATTTAGGAGTTTGATAAAACAAAATCTCACTCTATCACCGGAGGATTATTTGAATTTAGGAGTTCTTAAAACAAAATCTCACTCTATCGCGGAGGATTATTTGAATTTAGGAGTTTTAAAACAAAATCTCACTCTATCACCGGATTATTTGAATTTAGGAGTTCGATTAAAACAAAATCTCACTCTATCGCGGATTATTTGAATTTAGGAGTTTGATAAAACAAAATCTCACTCTATCACCGGAGGATTATTTGAATTTAGGAGTTCTTTAAAACAAAATCTCACTCTATCGCGGATTATTTGAATTTAGGAGTTTGATAAAACAAAATCTCACTCTATCACCGGAGGATTATTTGAATTTAGGAGTTCTTAAAACAAAATCTCACTCTATCGCGGATTATTTGAATTTAGGAGTTTGATTAAAACAAAATCTCACTCTATCACChttp:/;zgmnwk.cug.top80156退火30 s，7 2 延伸30 s共35个循环：用含溴化乙啶染色的1%琼脂以不同引物扩增的产物，凝胶成像自动分析系统观察分析结果15。引物序列(5 3)TGGAGGATTTTTTTGCGTACGCGAACCGAACGCCGCGAAGTTGGAGGATTTTTTTGTGTATGTCCCAAACCAAACACCACAAA2结 果2.1家系资料分析结果通过对先证者及其家系进行病史分析，能够发现该患者家系中的患者属于典型VHL综合征。根据既往研究可知，VHL综合征的初始症状可发生于全身多处器官，以合并PCC最为常见，多合并肾恶性肿瘤的发生，好发于2 0 40 岁人群，男性多见。在患者家系中发现有3名家系成员罹碱基数221724202625252526252625252525252626252526252526（w h o l e e x o me s e q u e n c e，W ES)，并与参考基因组进行比较，确定SNP的发生位点。802患肾恶性肿瘤，1名家系成员罹患肾上腺PCC,同时有2 名家系成员罹患肾恶性肿瘤合并双侧肾上腺PCC,且该患者家系成员发病年龄满足家族性VHL综合征早发的特点，十分符合VHL综合征的临床特征。2.2NGS高通量检测结果通过对患者基因点突变、插入缺失、重排、拷贝数等突变形式的分析，未发现明确的插入缺失、重排、拷贝数变化。存在2 种胚系突变基因,分别是在第50 0 位碱基处由G碱基变为A碱基的p.R167Q突变型VHL，位于第142 0 位碱基的由 C碱基变为 T碱基的 MUTYH,以及一种体系突变：位于第12 7 52 位碱基的由C碱基变为T碱基的KMT2D。目前在已发现的突变中仅有VHL基因突变存在明确临床意义。2.3甲基化位点预测结果J Mod Urol,Vol.28 No.9 Sep.2023库验证ccRCC中VHL的DNA甲基化水平（图2A)。结果显示VHL的基因表达和DNA甲基化相关，可见3个与VHL相关的甲基化位点，数据库中包含二次打击位点非甲基化患者，因1号位点在所有数据库病例患者中均为高表达，遂予以排除。故致病甲基化位点分别为：cg20916523和cg25539131。为此我们根据甲基化数据库中所提供的2 个甲基化位点进行MSP数据研究（图2 B）。结果发现cg20916523在该患者中并未出现，cg25539131位于非CPG岛处的外显子处，而该位置中的甲基化意义并不明确，且一般并不影响基因的表达量18 ,所以予以排除。同时，根据甲基化引物设计数据库设计5组引物行PCR研究，甲基化引物并未扩增出目的条带（图2 C），所以在该VHL患者的基因上无甲基化证通过UCSCXena数据明，因此该患者第二次打击位点并非甲基化。甲基化特异性DNA甲基化-I1lumina测序下的人类甲基化2 7 K芯片samplesVHLJ50 samples甲基化特异性DNA甲基化-I1lumina测序下的人类甲基化45K芯片VHLVHL2000VHLCpG输入序列500bp亚蓝酸氢新引物1000bpSetlMFIHIUFiSet4MF4H4MF4HSetsMESHSUF5MSPPrimerSet1500bp2000bpHMRTIURIMR2HUR2MR3HUR3MR4TUR4HMR5IUR5CpGBVH L(c g 16 8 6 910 8):0.8 8 7 8 h g 38 c h r 3:10,142,6 35-10,142,6 36 M e a n:0.8 2 512 9M e d i a n:0.8 555V H L(c g 2 0 916 52 3):0.8 34h g 38.c h r 3:10,142,90 0-10,142,90 1M e a n:0.7 142 2 9M e d i a n:0.7 598VH L(c g 2 5539131):0.8 6 7 7 h g 38 c h r 3:10,148,2 57-10,148,2 58 M e a n:0.8 4410 2 M e d i a n:0.8 56 2CA：根据UCSCxena数据库结果，排除非VHL基因范围内的基因位点，留下3个位点，1号位点在所有样本中都高表达而排除，2 号位点和3号位点为筛选出的甲基化位点；B：MSP中针对数据库提供的位点设立位点F1-5及R1-5，检测DNA组中甲基化的可能性；C:基因组荧光染色图，在染色图中未见明确甲基化位点。图2 先证者的甲基化检测结果2.4SNP及杂合性缺失检测结果基于二代测序，我们通过MSI-PCR在VHL基因的相应片段中发现存在微卫星不稳定区域共9 1个，对此我们进行了微卫星状态分析，结果提示该患者微卫星稳定，可判断患者第二次打击位点并非LOH。依据WES结果，我们发现在rs779805处存在SNP，位于第18 3位核苷酸，密码子6 1C/G。3讨 论VHL综合征是一种罕见的家族遗传性疾病，能够累及全身多个脏器，临床表现异质性大19-2 0 1。根据表型特征，VHL综合征可分为4类：1型、2 A型、2B型和2 C型。1型中不存在PCC,2A型和2 B型可能表现为PCC,并通过伴随的ccRCC额外风险进行区分，而2 C 型仅呈现ccRCC21。遗传性VHL疾病中最常见的突变R167Q属于2 B型突变，发生此类突变易患ccRCCL22。VH L综合征的致病基因即VHL基因为抑癌基因,定位于3号染色体短臂，含有3个外显子，编码pVHL蛋白质2 3。pVHL和缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor，H I F)结合，引起HIF降解。当缺失或者变异导致pVHL合成减少时HIF积累，将可能引起下游基因持续激活而导致肿瘤的发http:/jmurology.xjtu.edu,cn;zgmnwk.cug.top现代泌尿外科杂志生发展2 41。根据Knudson的二次打击假设，通过对儿童视网膜母细胞瘤发病率的分析,认为该疾病的发生是二次突变的结果。家族型者第1次突变发生于生殖细胞，第2 次突变发生于出生后体细胞，肿瘤的发生是由于肿瘤抑癌基因的双等位基因丢失，大量分子生物学研究已证实了这种由统计学分析提出的“二次打击 学说2 5。MAHER等2 6 通过对收集到的VHL综合征患者进行相关性分析证实，VHL综合征的致病特点类似于视网膜母细胞瘤，符合二次打击学说，VHL疾病中的小脑血管母细胞瘤和肾细胞癌均发生在相同的突变模型，同时在肾细胞癌中第二次打击的原因以LOH、甲基化、基因突变等多见。我们通过家系调查及对先证者外周血及病理组织采用NGS发现其为VHL综合征，VHL第3外显子发生病理性胚系错义突变,该突变类型为VHL综合征中最具特点的R167Q突变，目前已有通过下调HIF-2来调节R167Q突变造成的缺氧、干扰可塑性调节的相关研究2 2 。同时，我们针对第二次打击位点类型进行研究，采用数据库检索、MSP实验、微卫星稳定性研究及MSI-PCR等方法，发现该患者无甲基化、LOH、突变的情况，仅存在 SNP。V H L突变的位点及类型众多，我们的研究不仅是对VHL综合征的进一步探索，同时也是对二次打击理论的进一步认识2 7 。SNP是导致患者肿瘤发生的重要机制之一，研究SNP能够对VHL综合征的发生发展有着更深刻的认识。目前对于 SNP引起VHL综合征的机制尚不明确，但是既往研究认为SNP可能通过影响VHL基因的功能进而影响疾病易感性或者是通过促进LOH、甲基化的发生来产生作用,同时，疾病相关的SNP可能作为转录增强子，与转录因子相互作用，调节靶基因的表达2 8 ,因此，对于SNP导致VHL综合征发生、发展的机制需要更进一步的研究与探讨。VHL综合征有家族型和散发型之分，本研究中先证者患者确诊为VHL综合征，其发病的家系成员临床考虑为VHL综合征,且家族性恶性肿瘤病史伴有肾上腺恶性肿瘤疾病的家系成员数名，符合家族性VHL综合征诊断指征，因此均可临床确诊为VHL综合征2 9，该家族也可初步判断为家族性VHL综合征。根据患者及其家系的发病年龄，发现患者与其家系其余患有肾癌者的发病年龄均早于40 岁，符合家族性肾癌早发的临床特点30 1，同时该患者家系中起初发病的位点并不一致以及易产生新的病灶，也符合该家族性肿瘤累及范围广、发展快的特点31。目前2023年9 月第2 8 卷第9 期http:/;zgmnwk.cug.top803已知R167Q的突变均发生于胚系突变中，而R167Q突变导致VHL基因功能丧失，影响下游HIF-2特别是HIF-2的组成性稳定，可能是促进其发展及多处转移的重要原因2 2 。综上所述，对于患者基因的不同层面，包括DNA、RNA、蛋白质层面的研究，有利于我们研究VHL综合征肿瘤的发生、发展机制。对于VHL综合征二次打击的研究能够对我们研究如何发现以及治疗提供了一个方向。同时，进行患者数据库基因甲基化研究对于帮助筛选患者甲基化等情况有着十分重要的作用，对符合二次打击学说的肿瘤有着很好的筛选作用。参考文献：1 王孟尧，蔡善君.VHL综合征研究新进展J.临床医药文献电子杂志，2 0 196（8 5）：191.2龚侃，张志文，辛殿旗，等.原发性散发性肾透明细胞癌患者癌组织中抑癌基因VHL突变的研究J.中华医学杂志，2 0 0 1，8 1(3):142-144.3J BADER HL,HSU T.Systemic VHL gene functions and theVHL diseaseJJ.FEBS Lett,2012,586(11):1562-1569.4 ASAKAWA T,ESUMI M,ENDO S,et al.A mutation at IVS1+5 of the von Hippel-Lindau gene resulting in intron retentionin transcripts is not pathogenic in a patient with a tonguecancer?:case reportJJ.BMC Med Genet,2012,13:23.5J HAMANO K,ESUMI M,IGARASHI H,et al.Biallelic inactiva-tion of the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene in sporadicrenal cell carcinomaJ.J Urol,2002,167(2 Pt 1):713-717.6JVAN DER HORST-SCHRIVERS 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