吉西他滨联合热疗对胰腺癌PANC-1细胞凋亡的影响及机制研究.pdf

陕 西 医 学 杂 志S h a a n x iM e d i c a l J o u r n a l2 0 2 3年9月第5 2卷第9期S e p.2 0 2 3V o l.5 2N o.9基金项目:陕西省卫生健康委员会科研基金资助项目(2 0 2 2 D 0 4 6)通讯作者:张 璞,E-m a i l:z h a n g p u 6 4 9 61 2 6.c o m吉西他滨联合热疗对胰腺癌P AN C-1细胞凋亡的影响及机制研究习 攀1,王 蒨1,郭俊俊1,李 量1,张 璞2(1.陕西省肿瘤医院放疗科,陕西 西安7 1 0 0 6 1;2.陕西省核工业二一五医院胸外科,陕西 咸阳7 1 2 0 0 0)摘 要 目的:探索吉西他滨(G EM)联合热疗对胰腺癌P AN C-1细胞凋亡的影响及机制。方法:将人胰腺癌P AN C-1细胞随机分为对照组(无任何处理)、G EM组(给予G EM)和热化疗组(给予热疗联合G EM)。比较各组细胞增殖、凋亡、活性氧(R O S)、特异性蛋白1(S p 1)及其下游蛋白表达情况。评估R O S抑制剂N-乙酰半胱氨酸(NA C)对各组细胞增殖及相关蛋白表达的影响。结果:G EM对P AN C-1细胞增殖的抑制作用呈剂量和时间依赖性。3 0m o l/LG EM对P AN C-1细胞增殖的抑制作用高于其他剂量(均P0.0 5)。在G EM治疗前热疗1h细胞存活率显著低于G EM与热疗同时1h和G EM治疗后热疗1h(均P0.0 5)。与对照组比较,G EM组和热化疗组细胞凋亡率增加,且热化疗组高于G EM组(均P0.0 5)。与对照组比较,G EM组和热化疗组R O S升高,且热化疗组高于G EM组(均P0.0 5)。与对照组比较,G EM组和热化疗组S p 1、B细胞淋巴瘤-2(B c l-2)蛋白表达水平降低,且热化疗组低于G EM组(均P0.0 5)。与G EM组比较,热化疗组环氧合酶-2(C o x-2)蛋白表达水平降低(P0.0 5)。加入NA C后热化疗组细胞存活率较加入前升高,3 0m o l/LNA C对P AN C-1细胞增殖的影响更显著(均P0.0 5)。3 0m o l/LNA C显著恢复了S p 1及其下游C o x-2和B c l-2蛋白的表达(均P0.0 5)。结论:G EM联合热疗通过诱导R O S的产生抑制胰腺癌P AN C-1细胞增殖,促进细胞凋亡,进而抑制S p 1及其下游相关蛋白的表达。关键词 胰腺癌;热疗;吉西他滨;细胞凋亡;活性氧;特异性蛋白1中图分类号:R7 3 5.9 文献标志码:A D O I:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 0 0 0-7 3 7 7.2 0 2 3.0 9.0 0 4E f f e c t a n dm e c h a n i s mo f g e m c i t a b i n ec o m b i n e dw i t hh y p e r t h e r m i ao na p o p t o s i so fp a n c r e a t i cc a n c e rP A N C-1c e l l sX IP a n,WANGQ i a n,GUOJ u n j u n,L IL i a n g,Z HANGP u(D e p a r t m e n to fR a d i o t h e r a p y,S h a a n x iP r o v i n c i a lC a n c e rH o s p i t a l,X ia n7 1 0 0 6 1,C h i n a)A B S T R A C T O b j e c t i v e:T oe x p l o r e t h ee f f e c t a n dm e c h a n i s mo fg e m c i t a b i n e(G EM)c o m b i n e dw i t hh y p e r t h e r m i ao na p o p t o s i so fp a n c r e a t i cc a n c e rP AN C-1c e l l s.M e t h o d s:H u m a np a n c r e a t i cc a n c e rP AN C-1c e l l sw e r er a n d o m l yd i-v i d e d i n t oc o n t r o l g r o u p(w i t h o u t a n yt r e a t m e n t),G EMg r o u p(t r e a t e dw i t hG EM)a n dt h e r m o c h e m o t h e r a p yg r o u p(t r e a t e dw i t hh y p e r t h e r m i ac o m b i n e dw i t hG EM).C e l l p r o l i f e r a t i o n,a p o p t o s i s,r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s(R O S),s p e-c i f i cp r o t e i n1(S p 1)a n d i t sd o w n s t r e a mp r o t e i ne x p r e s s i o nw e r e c o m p a r e da m o n g t h eg r o u p s.T h e e f f e c t s o fR O S i n-h i b i t o rN-a c e t y l c y s t e i n e(NA C)o nc e l l p r o l i f e r a t i o na n dr e l a t e dp r o t e i ne x p r e s s i o nw e r ee v a l u a t e d.R e s u l t s:G EMi n-h i b i t e dt h ep r o l i f e r a t i o no fP AN C-1c e l l s i nad o s e-a n dt i m e-d e p e n d e n tm a n n e r.T h e i n h i b i t o r ye f f e c to f3 0m o l/LG EMo nt h ep r o l i f e r a t i o no fP AN C-1c e l l sw a sh i g h e r t h a nt h a to fo t h e rd o s e s(a l lP0.0 5).T h ec e l l s u r v i v a l r a t eo fh y p e r t h e r m i a f o r1h o u rb e f o r eG EMt r e a t m e n tw a ss i g n i f i c a n t l y l o w e r t h a nt h a to fb o t hG EMa n dh y p e r t h e r m i af o r1h o u ra n dt h a to fh y p e r t h e r m i af o r1h o u ra f t e rG EMt r e a t m e n t(a l lP0.0 5).C o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o lg r o u p,t h ea p o p t o s i sr a t eo fG EMg r o u pa n dt h e r m o c h e m o t h e r a p yg r o u pw a s i n c r e a s e d,a n d t h e t h e r m o c h e m o t h e r a p yg r o u pw a sh i g h e r t h a nG EMg r o u p(a l lP0.0 5).C o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o l g r o u p,R O S l e v e lw a s i n c r e a s e d i nt h eG EMg r o u pa n dt h et h e r m o c h e m o t h e r a p yg r o u p,a n dt h et h e r m o c h e m o t h e r a p yg r o u pw a sh i g h e rt h a nG EM g r o u p(a l lP0.0 5).C o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o lg r o u p,t h ep r o t e i ne x p r e s s i o nl e v e l so fS p 1a n dB c l-2i nt h eG EMg r o u pa n dt h e t h e r m o c h e m o t h e r a p yg r o u pw e r ed e c r e a s e d,a n dt h e t h e r m o c h e m o t h e r a p yg r o u pw a s l o w e r t h a nG EMg r o u p(a l lP0.0 5).C o m p a r e dw i t ht h eG EMg r o u p,t h e e x p r e s s i o no f c y c l o o x y g e n a s e-2(C o x-2)p r o t e i nw a sd e c r e a s e d i nt h et h e r m o c h e m o t h e r a p yg r o u p(P0.0 5).A f t e r t h e a d d i t i o no fNA C,t h e s u r v i v a l r a t eo fP AN C-1c e l l s i n t h e t h e r-m o c h e m o t h e r a p yg r o u pw a sh i g h e r t h a nt h a tb e f o r et h ea d d i t i o no fNA C,a n dt h ee f f e c to f3 0m o l/LNA Co nt h ep r o l i f e r a t i o no fP AN C-1c e l l sw a sm o r es i g n i f i c a n t(a l lP0.0 5).3 0m o l/LNA Cs i g n i f i c a n t l yr e s t o r e dt h ep r o t e i ne x p r e s s i o n so fS p 1a n d i t sd o w n s t r e a mC o x-2a n dB c l-2(a l lP0.0 5).C o n c l u s i o n:G EMc o m b i n e dw i t hh y p e r t h e r-03112 0 2 3年9月第5 2卷第9期S e p.2 0 2 3V o l.5 2N o.9陕 西 医 学 杂 志S h a a n x iM e d i c a l J o u r n a lm i a i n h i b i t s t h ep r o l i f e r a t i o na n dp r o m o t e s a p o p t o s i so fP AN C-1c e l l sb y i n d u c i n g t h ep r o d u c t i o no fR O S,t h e r e b y i n-h i b i t i n gt h ee x p r e s s i o no fS p 1a n d i t sd o w n s t r e a mp r o t e i n s.K E Y WO R D S P a n c r e a t i c c a n c e r;H y p e r t h e r m i a;G e m c i t a b i n e;A p o p t o s i s;R e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s;S p e c i f i e i t yp r o-t e i n1 胰腺癌是具侵袭性和难治的消化道恶性肿瘤之一,预后不良。根据流行病学资料1显示,胰腺癌将在2 0 4 0年超过结直肠癌成为全球癌症相关死亡的第二大癌种。早期胰腺癌一般无症状,发展至局部晚期可表现为腹痛、体重减轻、黄疸、恶心、疲劳等症状2-4。因此,一旦出现这些症状,超过8 0%的患者已处于局部晚期或者晚期。到目前为止,外科手术仍是治疗胰腺癌 的 重 要 方 法 之 一,但 只 适 用 于1 5%左 右 的 病例5-7。少于8%的胰腺癌患者存活超过5年8-1 0。所以,在无法早期诊断和切除的情况下,迫切需要更有效的治疗手段。以吉西他滨(G e m c i t a b i n e,G EM)为代表的化疗药物,目前仍是局部晚期、不可切除的晚期胰腺癌的治疗首选。然而,由于获得性耐药等原因,临床获益不超过3个月1 1-1 2。热化疗作为一种很有前景的肿瘤治疗方法,可通过改善化疗敏感性来提高治疗效果1 3。相关研究1 4发现,1 7例胰腺癌患者使用热化疗可使患者中位总生存期延长到1 7个月。此外,在另一项涉及1 0 6例-期胰腺癌患者的回顾性研究1 5显示,热化疗治疗组的中位总生存期为1 8.0个月,非热疗组为1 0.9个月。当然,还需要进一步的前瞻性随机对照研究来证实热化疗的有效性与安全性。此外,热化疗的协同作用及其相关分子机制目前尚未完全清楚,因此,本研究探讨热疗联合G EM治疗胰腺癌的疗效及其相关分子机制。1 材料与方法1.1 实验细胞与试剂 人胰腺癌细胞株P AN C-1购自 上 海 市 细 胞 库;R PM I-1 6 4 0培 养 基(批 号:A 1 0 4 9 1 0 1)、0.2 5%胰蛋白酶(批号:2 5 2 0 0 0 5 6)、杜氏磷酸缓冲盐溶液(D P B S)(批号:1 4 1 9 0 1 4)购自美国G i b c o公司;G EM(批号:G 5 5 2 0 0 0)购自法国礼来公司;N-乙酰半胱氨酸(NA C,批号:T 3 4 5 6 1)、碘化吡啶(P I)(批号:P A 5-1 6 6 6 1)、荧光染料D C F H-D A(批号:C 2 9 3 8)购自B e y o t i m e公司;抗特异性蛋白1(S p 1)抗体(批 号:P A 5-2 9 1 6 5)、抗 细 胞 周 期 蛋 白D 1(C y c l i nD 1,批 号:MA 5-3 5 3 3 1)、环 氧 合 酶-2(C o x-2,批 号:MA 5-2 7 7 8 3)、B细 胞 淋 巴 瘤-2(B c l-2)(批 号:P A 5-1 0 6 0 3 9)抗 体 均 购 自C e l l S i g n a l i n g T e c h n o l o g y(C S T)公司;MT T试剂盒(批号:1 2-6 6 9 6-4 2)购自美国S i g m a公司;A n n e x i nV-F I T C(批号:1 4 7 F I)购自V a z y m e生物技术有限公司。1.2 实验方法1.2.1 细胞培养:将P AN C-1悬浮于R PM I-1 6 4 0培养基中,置于5%C O2、3 7细胞孵育箱中培养。1.2.2 细胞分组与处理:将P AN C-1细胞随机分为对照组(无任何处理)、G EM组(给予G EM)、热化疗组(给 予 热 疗 联 合G EM)。将 浓 度 为5、1 0、2 0、3 0m o l/LG EM分别溶解在R PM I-1 6 4 0培养基中处理P AN C-1细胞,分别作用2 4、4 8、7 2h,以筛选最佳剂量和 持 续 时 间。热 化 疗 组 将 细 胞 放 在5%加 湿C O2、4 3培养箱中孵育1h,联合G EM3 0m o l/L处理2 4h。此外,为了研究活性氧(R O S)在热疗联合G EM治疗中的作用,在热疗前分别用抗氧化剂NA C(0、2 0、3 0、4 0、5 0m o l/L)预处理细胞1h。1.2.3 细胞增殖情况检测:将P AN C-1细胞悬液接种于9 6孔板中,根据不同分组进行相应处理(用热疗预处理6 0m i n或加入指定最终浓度的G EM,并孵育不同时间)后,在每孔中加入MT T,3 7 下孵育4h,用酶标仪检测吸光度值。1.2.4 细胞凋亡检测:采用A n n e x i nV-F I T C标记的流式细胞仪分析和D A P I染色技术,评价G EM单用或热疗联合G EM处理后的细胞凋亡情况。P AN C-1细胞按11 06细胞/培养皿接种于直径1 0c m的培养皿中。G EM处理前2 4h进行热疗(4 3 处理1h),收集细胞前2 4h给予G EM(终浓度3 0m o l/L)。处理后取出培养上清,清洗保留的细胞,离心以后在2 0 0l结 合 缓 冲 液 中 重 悬,然 后 与1 0lA n n e x i nV-F I T C和5lP I在4下反应3 0m i n。加入3 0 0l结合缓冲液,立即使用C y tE x p e r t软件,在流式细胞仪上检测凋亡细胞。将P AN C-1细胞在2 4孔板中培养,每孔中嵌入圆形玻片,根据不同分组进行相应处理后用D A P I染色,在倒置荧光显微镜下观测和拍照。1.2.5 相关蛋白表达检测:将P AN C-1细胞在P B S中洗涤,并根据说明提取蛋白。用B C A试剂盒定量测定后分离等量蛋白,转移到P V D F膜。然后用5%脱脂奶粉封闭,并与抗S p 1、C y c l i nD 1、B c l-2和C o x-2的一抗在4下反应过夜。用辣根过氧化物酶偶联的I g G二抗在室温下检测,随后显影。1.2.6 R O S检测:处理后的细胞用P B S洗涤,用1 0m o l/LD C F H-D A溶液在3 7下培养约2 0m i n,清洗细胞后在倒置荧光显微镜下观察染色细胞。1.3 统计学方法 采用S P S S2 2.0统计学软件分析1311陕 西 医 学 杂 志S h a a n x iM e d i c a l J o u r n a l2 0 2 3年9月第5 2卷第9期S e p.2 0 2 3V o l.5 2N o.9数据,计量资料以(xs)表示,行t检验,P0.0 5为差异有统计学意义。2 结 果2.1 各组细胞增殖情况比较 G EM对P AN C-1细胞增殖的抑制作用呈剂量和时间依赖性。3 0m o l/LG EM对P AN C-1细胞增殖的抑制作用高于其他剂量(均P0.0 5)。不同联合方式的热化疗组细胞存活率显著低于G EM组(均P0.0 5)。在G EM治疗前热疗1h细胞存活率显著低于G EM与热疗同时1h和G EM治疗后热疗1h(均P0.0 5)。2.2 各组细胞凋亡情况比较 见图1、2。D A P I染色显示,与对照组比较,热化疗组P AN C-1细胞凋亡最明显,G EM组P AN C-1细胞凋亡次之。流式细胞术显示,对照组、G EM组和热化疗组细胞凋亡率分别为(2.1 70.2 1)%、(9.5 30.4 9)%、(2 3.1 01.4 2)%。与对照组比较,G EM组和热化疗组细胞凋亡率增加,且热化疗组细胞凋亡率高于G EM组(均P0.0 5)。2.3 各组细胞R O S比较 见图3。与对照组比较,G EM组 和 热 化 疗 组R O S升 高,且 热 化 疗 组 高 于G EM组(均P0.0 5)。图1 各组细胞D A P I染色结果(2 0 0)图2 各组细胞凋亡情况图3 各组细胞R O S比较(荧光染色,2 0 0)2.4 各组细胞S p 1及其下游蛋白表达水平比较 见图4。与对照组比较,G EM组和热化疗组S p 1蛋白表达水平降低,且热化疗组低于G EM组(均P0.0 5)。与G EM组比较,热化疗组C o x-2蛋白表达水平降低(P 0.0 5)。与对照组比较,G E M组和热化疗组B c l-2蛋白表达水平降低,且热化疗组低于G E M组(均P 0.0 5)。23112 0 2 3年9月第5 2卷第9期S e p.2 0 2 3V o l.5 2N o.9陕 西 医 学 杂 志S h a a n x iM e d i c a l J o u r n a l图4 各组细胞S p 1及其下游蛋白电泳结果2.5 NA C对各组细胞增殖及相关蛋白表达的影响 加入NA C后热化疗组细胞存活率较加入前升高,且3 0m o l/LNA C对P AN C-1细胞增殖的影响更显著(均P0.0 5)。此外,我们发现使用3 0m o l/LNA C显著恢复了S p 1及其下游C o x-2和B c l-2蛋白的表达(均P0.0 5)。3 讨 论胰腺癌是目前分化较差的恶性实体瘤之一,由于起病隐匿、早期诊断困难以及对放化疗不敏感,一般预后不佳1 6。本研究表明,热疗可以提高G EM对胰腺癌细胞的抑制作用,从而显著刺激R O S的产生,抑制S p 1及其下游蛋白的表达。热疗是一种很有潜力的癌症治疗方式,通过加热到4 24 3不仅可以实现对肿瘤细胞的直接杀灭作用,而且可以促进化疗药物的传递并提高敏感性。此外,热疗通过延缓放疗诱导的癌细胞D NA损伤修复来放大放射治疗的效果。热疗可引起一系列广泛的细胞反应,包括D NA损伤、有氧代谢和热休克蛋白的诱导。此外,热 疗 会 引 发 氧 化 应 激,增 加R O S的 产生1 7。临床研究1 7表明,热疗作为胰腺癌的姑息性治疗方法,可促进肿瘤消退。临床研究1 8-2 2也证实了热疗联合放疗、化疗对不可切除的局部晚期胰腺癌的治疗效果。J i n等2 3研究也表明热疗(4 2)通过诱导R O S的产生抑制了SW 1 9 9 0细胞的活力。本研究证实了热化疗联合对胰腺癌细胞抑制作用最为显著。此外,与G EM组比较,热化疗组R O S显著升高。S p 1属于S p/K r t i p p e l转录因子家族(S P/K L F家族),由D NA结合区、S p 1区激活区、B t d盒和S P盒四个功能域组成。C端D NA结合区域由三个典型的C y s 2-H i s 2锌指结构组成,与G C盒的高亲和力和对C T、G T盒的低亲和力密切相关2 4。因此,S p 1的序列特异性D NA结合赋予其对细胞生长、发育、分化和迁移等基因表达的调节作用。研究证实,在具有侵袭、转移性更高的胰腺癌样本中S p 1异常过度表达,S p 1高表达与患者更差的临床分期、肿瘤分级和淋巴结转移密切相关,同时也意味着患者预后差和极低的5年生存率。本研究中,在G EM组细胞中S p 1表达下降,而在热化疗组S p 1降低更加明显。同时,热化疗组也下调了S p 1下游C o x-2、B c l-2蛋白的表达。S p 1可以和许多核因子相互作用,调节基因表达。在胰腺癌细胞中,S p 1通过其N端结构域与转录因子活化T细胞核因子C 2(N F AT c 2)的相互作用增加了活化T细胞核因子(N F AT)的活性。Y a n g等2 5证实了S p 1与YA P 1启动子中的多个位点结合,从而驱动胰腺癌细胞中YA P 1的激活。血管内皮生长因子(V E G F)和C o x-2是S p 1的主要靶基因之一,是影响细胞生长、恶性肿瘤发生与发展的关键调控因子。H u等2 6报道了在胰腺癌细胞中,S p 1与C o x-2的表达呈正相关,并且S p 1结合到C o x-2启动子-2 4 5/-2 4 0附近的序列位置。本研究也证实,C o x-2在热化疗作用下与S p 1发生了类似的变化。综上所述,热化疗通过诱导R O S的产生抑制胰腺癌P AN C-1细胞增殖,促进细胞凋亡,进而抑制S p 1及其下游相关蛋白的表达。本研究可为热疗联合化疗治疗胰腺癌提供基础实验依据。参考文献1 R a h i bL,W e h n e rMR,M a t r i s i a nLM,e t a l.E s t i m a t e dp r o j e c-t i o no fu sc a n c e ri n c i d e n c ea n dd e a t ht o2 0 4 0J.J AMAN e t wO p e n,2 0 2 1,4(4):e 2 1 4 7 0 8.2 Z h a n gL,S a n a g a p a l l i S,S t o i t aA,e t a l.C h a l l e n g e s i nd i a g-n o s i so fp a n c r e a t i cc a n c e rJ.W o r l dJ G a s t r o e n t e r o l,2 0 1 8,2 4(1 9):2 0 4 7-2 0 6 0.3 王 旭,程 合,刘 辰,等.2 0 2 2年度胰腺癌研究及诊疗新进展J.中国癌症杂志,2 0 2 3,3 3(1):1-1 3.4 陈 娟,朱凤婷,冯冬婵,等.清胰化积汤联合介入化疗栓塞治疗晚期胰腺癌临床研究J.陕西中医,2 0 2 3,4 4(2):1 7 8-1 8 2.5 杨尹默,田孝东,许静涌,等.胰腺癌临床研究回顾与展望J.中国实用外科杂志,2 0 2 0,4 0(1):4 8-5 2.6 安革利,董 峰,宋利芳.胰腺癌根治术后患者预后的相关影响因素J.实用癌症杂志,2 0 2 3,3 8(1):1 2 6-1 2 8.7 王延磊,王政华.C T引导下1 2 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5.(收稿:2 0 2 3-0 3-1 3)审稿人:蔡英全(上接第1 1 2 9页)1 5