基于数据挖掘和实验验证探讨舒筋健腰丸干预黄韧带肥厚腰椎管狭窄症的作用机制.pdf
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1、2023 第二十五卷 第三期 Vol.25 No.3 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 基于数据挖掘和实验验证探讨舒筋健腰丸干预黄韧带肥厚腰椎管狭窄症的作用机制冯蓬1,李路广1,李建国1,覃仁安2,刘海英2,高景华1,孙东2(1.中国中医科学院望京医院 北京 100020;2.广州白云山陈李济药厂有限公司 广州 510220)摘要:目的结合数据挖掘和实验验证,探讨舒筋健腰丸抑制黄韧带肥厚的作用机制。方法借助TCMSP和TCMID数据平台筛选舒
2、筋健腰丸的有效活性成分和靶点,利用GEOquery包获取GEO数据库中黄韧带肥厚腰椎管狭窄症的差异表达蛋白芯片数据,提取药物与疾病的共同靶点,利用STRING数据库构建蛋白质相互作用网络,利用Cytoscape 3.7.1软件对关键靶点进行网络拓扑学分析。再利用DAVID在线工具对核心靶点进行GO富集分析和KEGG信号通路分析,以探究舒筋健腰丸干预黄韧带肥厚腰椎管狭窄症可能的分子机制和关键靶点。建立大鼠黄韧带肥厚模型,随机将大鼠分为正常组、模型组、氯磷酸盐组(阳性药物组,Clodronate Liposomes,5 mgmL-1,每次0.5 mL)和中药组(60 kg人用药等效剂量,1.5 g
3、kg-1d-1),采取预防性灌胃给药策略,于造模8周后取材。利用HE和Masson染色从组织病理学角度评估对舒筋健腰丸黄韧带肥厚的干预作用,利用免疫组化法检测PPI网络中关键蛋白表达。结果网络药理学方法筛选出舒筋健腰丸干预黄韧带肥厚的靶点77个,利用网络拓扑参数筛选出关键蛋白TGF-1、LOXL2、TNF-、IL-6和IL-1。GO富集和KEGG通路分析表明该药可能通过炎症因子的调控、细胞外基质调节和胶原蛋白的分泌等发挥作用。通过HE和Masson染色,与模型组相比,中药组显著抑制大鼠肥厚黄韧带的病理产物堆积,抑制其胶原容积分数增高(P0.05),但其抑制作用不及氯磷酸盐组(P0.05);通过
4、免疫组化分析,与模型组相比,中药组能够显著抑制关键蛋白TGF-1、LOXL2、TNF-、IL-6和IL-1的表达(P0.05)。结论舒筋健腰丸可能通过抑制TGF-1、LOXL2、TNF-、IL-6和IL-1蛋白的表达发挥干预黄韧带肥厚腰椎管狭窄症的作用。关键词:舒筋健腰丸 数据挖掘 组织病理学 黄韧带 纤维化 炎症反应doi:10.11842/wst.20220510010 中图分类号:R285.5 文献标识码:A腰椎管狭窄症(Degenerative lumbar spinal stenosis,DLSS)是骨科难治性疾病,该病已成为全球范围内引起中老年人群腰腿痛和活动功能受限的主要原因之一
5、1。在我国人口老龄化的大背景下,该病在日益严重威胁中老年人群的生活质量和身心健康的同时,也给社会、医疗造成巨大的负担。临床中,黄韧带肥厚腰椎管狭窄症较为常见,其典型临床症状为腰腿疼痛伴间歇性跛行。黄韧带肥厚可以压缩50%-80%的腰椎管有效容积,可伴随急、慢性炎症反应,继发疼痛和组织水肿,是DLSS的重要病理因素之一2-3。黄韧带肥厚导致腰椎管狭窄是一个缓慢进展且涉及复杂病理机制的过程,这种退行性疾病严重限制了患者的腰椎功能、行走能力和生活质量,并已成为脊柱手术最常见的适应症之一4。收稿日期:2022-05-10 修回日期:2022-10-06 中国中医科学院望京医院院级科研课题(2021-H
6、X-7):基于TGF-1/PI3K/AKT通路研究舒筋健腰丸调控黄韧带成纤维细胞增殖、凋亡在黄韧带肥厚中的作用机制,负责人:高景华。通讯作者:高景华,教授,主任医师,博士研究生导师,主要研究方向:退行性脊柱疾患的诊断及中医疗法的研究;孙东,主管中药师,广州白云山陈李济药厂有限公司总经理,主要研究方向:中药学研究。952 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中医药数据研究黄韧带肥厚腰椎管狭窄症的主要致病因素为黄韧带病理性
7、肥厚,其主要表现为:弹性蛋白减少,胶原蛋 白 增 多,病 理 产 物 堆 积,胶 原 容 积 分 数 增 大(Collagen volume fraction,CVF),细胞外基质沉积、重塑,伴随大量炎性细胞和炎症因子浸润5-7。正常黄韧带是一种弹性结构,细胞外基质成分较为稳定,包含约80%的弹性蛋白和20%的胶原蛋白,其CVF稳定在20%左右8。然而现有证据表明,随着黄韧带肥厚的进展,其表现出病理产物堆积,CVF增大,提示纤维化改变5。黄韧带的主要功能为维持椎体间的稳定性和限制脊柱前屈。因此,当椎体节段性失稳时,则有可能造成黄韧带的损伤,激活炎症反应和组织损伤修复程序,诱发疼痛刺激和纤维化6
8、。而纤维化的黄韧带弹性下降,韧性增加,弹性纤维受力更容易发生断裂,继而恶性循环,逐渐增厚,直至挤压神经纤维,引发疼痛刺激。因此,对该恶性循环进行干预,改善临床症状,抑制炎症和疼痛刺激,抑制椎管有效容积进一步压缩,减少手术介入,具有重要意义。舒筋健腰丸是全国中药行业著名的老字号“陈李济”自主研制的纯中药复方制剂,具有补益肝肾、强健筋骨、驱风除湿、活络止痛的功效。研究团队前期开展了舒筋健腰丸的多中心、随机、对照临床研究,观察了舒筋健腰丸治疗黄韧带肥厚DLSS的临床疗效。结果表明,在舒筋健腰丸治疗黄韧带肥厚DLSS四周后,患者的腰膝酸痛VAS评分、中医证候总积分、间歇性跛行距离较治疗前均有显著改善(
9、P0.05),其具有明确的临床疗效9-10。在基于主动监测的真实世界临床研究中,舒筋健腰丸上市后有效性和安全性评价也得到了大样本循证支持11。舒筋健腰丸临床应用专家共识 中也对该药物临床应用有效性给予了肯定,并提供了该药物的临床应用指导和参考11-12。然而鉴于舒筋健腰丸具有多成分、多途径、多靶点作用的特点,目前该方干预黄韧带肥厚DLSS的物质基础、作用机制及作用环节仍缺乏探索。数据挖掘、网络药理学等技术近年来逐步发展,是初步筛选中药有效活性成分和预测方剂多组分治疗机制的有效方法,与实验验证结合能够为中药复杂成分机制探索提供方向13-14。因此,本研究结合数据挖掘和实验研究,探索舒筋健腰丸干预
10、黄韧带肥厚DLSS的作用机制。1 材料 1.1动物8周龄SPF级雄性SD大鼠40只,体质量220-250 g,购于中国食品药品鉴定研究院(北京大兴),实验动物生产许可证号:SCXK(京)2017-0005。实验动物均饲养于中国中医科学院动物房,动物饲料由北京科澳协力饲料有限公司提供。实验室保持通风良好,温度、湿度适宜(温度20-25,湿度40%-50%,光照12 h与黑暗12 h交替循环),自由进食水。所有动物均适应性饲养1周。动物实验方案经北京隆安实验动物伦理委员会批准(BJLongan-L-L-003)。1.2主要试剂和仪器舒 筋 健 腰 丸(广 州 陈 李 济 药 厂,国 药 准 字Z4
11、4021058,规格:120 g/瓶);中性甲醛(武汉塞维尔生物科技有限公司,货号:G1101-500ML);10%EDTA、苏木素染液、伊红染液(北京索莱宝科技有限公司,货号分别为:E8030、G1080、G1100);Weiger铁苏木素A/B液、丽春红酸性品红染液、磷钼酸溶液、苯胺蓝染液(北京索莱宝科技有限公司,货号分别为:G1142、P0012、G3720、G3665);TGF-1兔单克隆抗体、TNF-兔单克隆抗体、IL-1鼠单克隆抗体、IL-6兔单克隆抗体、LOXL2 兔 单 克 隆 抗 体(Abmart,货 号:T58262,PU787889,MK56352,TD6087,T571
12、06);PBS 缓冲液(北京索莱宝科技有限公司,货号:P1020);打磨机磨钻(韩国世新精密工业社,型号:STRONG204);石蜡切片机(德国Leica,型号:RM2235)。2 方法 2.1舒筋健腰丸有效成分检索与筛选舒筋健腰丸药由狗脊、金樱子、鸡血藤、千斤拔、黑老虎、牛大力、女贞子、桑寄生、菟丝子、延胡索、两面针、乳香、没药构成。基于中药系统药理学数据库和分析平台在线数据库15(TCMSP,http:/ Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology
13、 2023 第二十五卷 第三期 Vol.25 No.3 2.2黄韧带肥厚相关靶点的获取通 过 GEOquery 包 从 GEO 数 据 库(https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/)中下载 GSE113212 蛋白芯片数据。该芯片数据总共包含8个样本,其中对照组为4个腰椎 间 盘 突 出 症 患 者 的 黄 韧 带(GSM3100386-GSM3100389),4 个样本为 DLSS 黄韧带肥厚样本(GSM3100390-GSM3100393)。在数据处理过程中,去除掉一个探针对应多个分子的探针,当遇到对应同一个分子的探针时,仅保留信号值最大的探针。然后通过箱式图查看样本标准化
14、的情况,通过PCA图查看样本分组间聚类情况。利用R包limma包分析、筛选和绘制差异基因表达图,筛选条件为 adj.P2。2.3构建药物活性成分-疾病靶点的蛋白互作网络(PPI Network)利用PubChem数据库20(https:/pubChem.ncbi.nlm.nih)获取舒筋健腰丸所有药物的有效活性成分的SMILE 结构,通过 DrugBank Database21(https:/www.drugbank.ca/)和 SwissTarget Prediction Database22(http:/www.swisstar getprediction.ch/)数据库基于有效活性成分的
15、二级结构预测其对应的靶点蛋白,相似性阈值默认为0.85。为阐明舒筋健腰丸的潜在靶点与黄韧带肥厚相关靶点之间的相互作用,将疾病靶点与药物靶点取 交 集 并 绘 制 韦 恩 图(http:/ 11.0(https:/www.string-db.org/)23平台构建PPI网络,生物种类选定“Homo sapiens”,最小互相作用阈值“Highest Confidence”设置为0.85,得到蛋白间的相互作用关系,利用 Cytoscape24实现网络的可视化。最终选取拓扑分析参数自由度值和平均最短路径值前五名作为关键靶点。2.4GO富集分析和KEGG信号通路分析将 PPI 网络靶点上传至 DAVI
16、D 数据库(https:/david.ncifcrf.gov/)25,进行 GO 富集,分析生物学过程(BP)、细胞组成(CC)、分子功能(MF)以及KEGG信号通路分析。利用 R 语言将获得的 GO 富集分析和KEGG通路分析制作成气泡图。综合分析舒筋健腰丸干预黄韧带肥厚DLSS的机制。2.5舒筋健腰丸药物制备、分组、造模及给药实验所用舒筋健腰丸均来自广州陈李济制药厂(同一批次,规格:120 g/瓶),药物均为浓缩水蜜丸。根据厂家提供舒筋健腰丸质控标准,所有丸剂分批次每天晨经过4、24 h蒸馏水密封浸泡,后经充分的搅拌,制成含药浓度为0.05 gmL-1的混悬液,随后装于药用高密度聚乙烯密封
17、瓶中并做好标记。为保证混悬液稳定性,所有药液均提前24 h配置并用于第2天大鼠灌胃。按照随机数表法将实验大鼠分为4组,分别为正常组、模型组、氯磷酸盐组和中药组,每组6只,各组自由摄食、摄水。舒筋健腰丸给药剂量按照60 kg人与大鼠体表面积关系换算出大鼠每日中药等效剂量,得出每日等效剂量为1.5 gkg-1。大鼠每周称重并调整给药剂量。中药组灌胃舒筋健腰丸混悬液,每日1次,持续8周;正常组、模型组和氯磷酸盐组每日灌胃等量生理盐水,持续 8周;氯磷酸盐组在每日灌胃生理盐水的基础上,于造模后即刻、2周、4周和6周于原位注射Clodronate Liposomes(溶于PBS,4储存,浓度5 mgmL
18、-1,0.5 ml/次)。造模 3 天后即开始按计划给药。中药组、模型组和氯磷酸盐组均采用大鼠腰椎失稳损伤法造模。大鼠腰椎黄韧带肥厚模型采用腰椎失稳损伤法造模26。造模方法为:完全切除大鼠L5和L6棘突,磨削双侧L5/6小关节,切除整个L5-L6椎旁肌,直至椎板暴露,术后3天给予注射头孢呋辛钠抗感染处理,造模持续8周。模型评价标准:取大鼠L5/6包含黄韧带椎体节段,垂直黄韧带制作组织切片,利用Masson染色,计算大鼠黄韧带胶原容积分数,若CVF大于30%即认定纤维化模型成功26,组织切片可随后用于免疫组化染色等实验。2.6HE染色和Masson染色HE染色:二甲苯脱蜡后梯度酒精水化,将大鼠腰
19、椎节段切片置于苏木素染液中染色15 min,分化液分化30 s,伊红复染5 s,双蒸水冲洗,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,最后中性树胶封片。Masson染色:切片水化后,Weigert铁苏木素染液染色 5 min,盐酸分化 2 s至返蓝,双蒸水冲洗,丽春红品红染色液染色15 min,磷钼酸溶液洗3 min,苯胺蓝色液中染色3 min,冰醋酸洗1 min,脱水,透明,中性树胶封固。利用Masson染色分析CVF,即胶原蛋白阳性的蓝色面积与组织总面积的百分比。将同等放大倍数的镜下图像导出,采用Image J软件测量黄韧带厚度、长度、面积等数值,每组随机选取3张Masson染色图片测算CVF并取平均值,
20、954 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中医药数据研究用于后续统计分析。2.7免疫组织化学染色法检测纤维化相关蛋白和炎性相关蛋白根据PPI网络利用拓扑分析方法筛选网络中的关键作用靶点,采用免疫组化法检测各组黄韧带中相关蛋白的表达和定位。采用专业图像分析系统Image J 1.50 对免疫组化切片进行分析,以平均光密度值(MOD,MOD=IOD/Area)作为表达强度的评价参数。表1舒筋健腰丸预测靶点靶点名称PTGS
21、2PGRESR1LSSRORANR1I3VDRCLEC4ESULT2B1NR1I2ARHMGCRCYP51A1F2CHRM1SCN5ANOS3RXRAACHEADRA1ACHRM2ADRB2OPRM1GABRA1DPP4CHRNA7NCOA2TGF-1GABRA2SLC6A2MAOBSLC6A3DRD1ADRB1PDE3AHTR2AADRA1BAKR1B1PTGS1SCN3AAKR1A1AKR1E2PLA2G1BACP1LOXL1PTPRSNR1H2NR1H3ESR2CYP17A1TBXA2RKCNA3IL-1PTPN6PRGRSLC6A4CYP19A1CHRM5NOS1NOS2CDC25BP
22、PARGPPARDPPARAPTGER2ALOX5ALOX12ALOX15BALOX12BGABRB3GRIA2GABRA5AKR1C3LYZAMY2APTGER4PTGER3ANXA1CD300ASCN11ACHRNECHRNA9SLC22A1SLC18A1CEND1GGT1GLO1GPX7GPX6GSTT1GSTM3GPX2GSRMGST2GSTZ1GSTA4MGST1LTC4SGSTA3HAGHMGST3GSSGSTO2GPX8GPX5GSTK1HPGDSGSTA1GPX4GSTA5GPX3GLRXGSTM1GPX1GSTP1ESDGSTM2GSTM5GSTA2ADRA2ACOX2TYR
23、ATCAYCOX1FECHCOX6B1COX8ASRD5A2EIF2AK1MTNR1ASOAT1CRYZSNW1MTNR1BMTTPVKORC1PAWRHTR2CSOAT2NQO1GPR27CBR4CYP27B1VKORC1L1GCPDE7BPRKDCPIK3CAPIK3CBITPR3ATMPDE11APIK3R1ADAPDE5APIK3CDADORA2BITPR2POLA2DRD5CCL23SLAMF8CCL18AOC3AOC2HIF1AIL-1IL-10BCL2SRPK2POSTNHSP90PTGS3SMAD3CD86CALCASOX2BAXRAB7APIK3SMAD7CTSDMAPK14
24、AKT1APLNIL6JUNCNR1CXCL8SMAD2TGFA1AGTR1ARRDC3ADRB3ADRA2BARRB2ADRA1DAPRTPNPSCN1BSCN2BSCN7ASCN2ASCN4BABATHDAC9SCN1ASCN10AACADSBSCN3BSCN9ASCN8ALPLRDH11RDH5ALDH1A1RBP3ALDH1A3RLBP1RETSATRDH12RDH14RDH13DHRS4RDH8DHRS3RBP1LRATKCNQ1RARAALDH1A2RXRBRARBRARRES1GPRC5ANR0B1RXRGRARGMCRPTPN2PTPN1TDP1PCK1TOP2BHSD11B1
25、MAPTHSD11B2NR3C1FNTAFNTBAKR1B10AKR1B15POLBNR3C2ESRRGAKR1C2COX4I1FABP6NR1H4ABCB4COX6CCOX5ACES1AKR1D1ALADCOX7BCOX7CCOX7A1TNF-SP1PCK2PECRFABP4ACACBDDCTRPA1DRD4DRD2HTR3ANPR1CHRNGCHRNA10CHRFAM7ACHRNA4CHRNA6CHRNB3CHRNDCHRNB4CHRNA7BCHECHRNB1CHRNA1PDE1BVPS18SERPINE2LOXL2FOXD3FAPEGR3DESDCTN6SCG5P4HA1COL10A1C
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