分子生物学第4章重点及试题.doc

一、名词解释：
转录: 是指以DNA为模板，在依赖于DNA的RNA聚和酶催化下，以4中NTP（ATP、CTP、GTP和UTP）为原料，合成RNA的过程。
转录单位 (transcription unit): 从启动子到终止子的序列 (转录起始点)。
模板链（template strand）: 又称反义链, 指与转录物互补的DNA链（极性方向3’→5’）。
编码链: 又称有义链, 指不作模板的DNA单链（极性方向5’→3’）。
hnRNA：核内不均一RNA，是存在于真核细胞核中的不稳定，大小不均一的一组高分子RNA的总称。
转录的极性：转录的效率与转录单位的位置有关。
转录起始：RNA聚合酶与DNA转录启动子结合形成有功能的转录起始复合物的过程。
启动子（Promoters）：指DNA分子上被RNA聚合酶、转录调节因子等识别并结合形成转录起始复合物的区域。
核心启动子：RNA聚合酶能够直接识别并结合的启动子。
RNA聚合酶：是催化以DNA为模板（template）、三磷酸核糖核苷为底物、通过磷酸二酯键而聚合的合成RNA的酶。
C端结构域(CTD)：RNApolⅡ的大亚基中有 C 末端结构域。CTD中含一保守氨基酸序列的多个重复Tyr－Serp－Pro－Thrp－Serp－Pro－Serp C端重复七肽。
沉默子（silencer）：沉默子能够同反式因子结合从而阻断增强子及反式激活因子作用并最终抑制该基因的转录活性的真核基因中的一种特殊的序列。
增强子(enhancer)：是一类正调控元件，能够从转录起始位点的上游或下游数千个碱基处来激活转录。
绝缘子（insulater）：阻断增强子或沉默子的DNA序列。
上游：转录起点上游的序列，是调控区，与转录的方向相反。
下游：转录起点下游的区域，是编码区，与转录的方向一致。
转录起点：＋1位点，RNA聚合酶的转录起始位点，起始NTP多为ATP或GTP。
转录泡：在转录时RNA聚合酶Ⅱ（RNAPⅡ）与DNA模板结合，会形成一个泡状结构，成为转录泡。
转录压制：指转录因子的过度表达，抑制受特异性调节基因的基本转录装置，引起转录抑制。
上游激活序列(UAS)：TATA框上游的保守序列称为上游启动子元件或上游激活序列。
锌指结构：在蛋白质中，一小段保守的氨基酸序列（约23个氨基酸残基）结合一个锌离子而形成的一个相对独立的功能域。
终止子（terminator）：在转录的过程中，提供转录终止信号的RNA序列。
抗终止子：有的蛋白因子能作用于终止序列，减弱或取消终止子的作用，称为抗终止作用，这种蛋白因子就称为抗终止因子。/引起抗终止作用的蛋白质。
RNA加工：指新合成的前体RNA分子所经历的结构和化学方面的修饰与成熟的过程。
帽子结构：在RNA链长度超过20-30nt之前，其5’端经化学修饰被加上了一个7-甲基鸟苷残基，这种5’末端的修饰称为帽子结构
poly（A）尾巴：核内不均一 RNA 和 mRNA 在其3’-末端的一个独特的结构，由 AMP 残基组成的长链。
多聚腺苷化（polyadenylation）：添加 poly（A）到 RNA 分子上的过程。
SD 序列：原核生物起始密码子AUG上游7-12个核苷酸处一段可以与16SrRNA的3’端反向互补保守区。
选择性剪接：一个hnRNA（pre-mRNA）转录本，通过外显子的剪接、重组，产生多个成熟的mRNA的机制。
组成性剪接：一个基因的转录产物通过剪接只能产生一种成熟的mRNA.它和选择型剪接的区别是后者可以产生多种成熟mRNA。
剪接体：在剪接过程中形成的剪接复合物称为剪接体,剪接体的主要组成是蛋白质和小分子的核RNA(snRNA)。复合物的沉降系数约为50～60S,它是在剪接过程的各个阶段随着snRNA的加入而形成的。
RNA编辑：指由RNA水平的核苷酸改变所引起的密码子发生变化的一种预定修饰，一种RNA编辑是以另一RNA为模板来修饰mRNA前体。
内含子：断裂基因的非编码区，可被转录，但在mRNA加工过程中被剪切掉。
外显子：断裂基因中的编码序列，在剪接后仍保存下来，并可在蛋白质生物合成过程中被表达为蛋白质。
断裂基因：真核生物结构基因，由若干个编码序列和非编码序列互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码序列再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质。
启动子的清理：当开放的启动子复合物足够稳定是，RNA聚合酶离开启动子，释放出σ亚基，核心酶空出启动子位点以进行下一次转录起始。
指导RNA：一类小RNA分子，其部分序列可与被编辑的RNA序列互补。

二、
● 3类特异性转录因子：酸性功能域、富含Gln功能域、富含Pro功能域
以3种方式发挥作用：①改变DNA构象
②影响基本转录起始复合体装置
③影响其他调节因子的活性

● RNA转录3个过程（起始、延伸、终止）

● 真核生物中有三种不同的RNA聚合酶，因此也有三种不同的启动子：RNA polⅠ启动子、RNA polⅡ启动子、RNA polⅢ启动子。

● 说明RNApol全酶各个亚基的主要功能。
（2） σ亚基：转录起始时与核心酶结合成全酶，使全酶能识别启动子的Sextama Box(－35区，R位点)、Pribnow Box（-10区，B位点）,选择并紧密与模板链发生特异性结合。不同的σ因子与核心酶结合，可识别不同的启动子。全酶完成转录发动后，σ亚基离开全酶。可重复使用。
（2）α亚基：核心酶的组建因子 ，促使RNApol 与DNA模板链结合
前端α因子－－使模板DNA双链解链为单链
尾端α因子－－使解链的单链DNA重新聚合为双链
（3）β亚基：模板链结合位点，包含RNA/DNA杂交链结合位点
• 完成NMP之间的磷酸酯键的连接
• 编辑功能（排斥与模板链不互补的碱基）
• 与Rho （ρ）因子竞争RNA 3’－end
• 构成全酶后，β因子含有两个位点：
起始位点I（initiation site. Rifs）:对利福平敏感，该位点专一性地结合ATP或者GTP （需要高浓度的ATP或GTP）
延伸位点E（elongation site RifR）:对利福平不敏感，对NTP没有专一性的选择，从而保证了RNA链的延伸
（4） β’亚基：促进RNA聚合酶与非模板链结合。

RNA聚合酶核心酶4个功能位点：非模板链结合位点、模板链结合位点、双链DNA解旋位点、双链DNA重绕位点

● 原核生物启动子结构及各部分功能。
答：启动子由两个部分组成：
上游部分：上游控制因子（UCE）：CAP-cAMP的结合位点
CAP：降解物基因活化蛋白
cAMP：环腺苷酸（cAMP）的受体蛋白
下游部分：核心启动子（core promoter） ：－35 区（ RNApol识别位点，R site） 、 －10区（ RNApol结合位点，B site）、转录起点（+1位点，I site）
Sextama 盒：-35区序列（TTGACA），位于复制起点上游35区处的6核苷酸序列，能直接被RNA聚合酶全酶中的σ因子识别并结合。
Pribnow 盒：-10区序列（TATAAT），位于-10区处的6核苷酸序列，能使RNA聚合酶识别DNA双链中的模板链，确保转录的链和方向无误。

● 真核生物启动子
①RNApolⅠ：负责转录rRNA
顺式作用元件：UPE（上游启动子元件）、Core promoter（核心启动子元件）
反式作用因子：UBF（上游启动子元件结合因子）、SL1（选择性因子）
②RNApolⅡ：负责转录hnRNA（mRNA 前体，核不均一RNA）、部分snRNA（核内小分子 RNA ）
顺式作用元件：+1区、-30区、-70区、-90区（Cap site、TATA-box、CAAT-box、GC island）
反式作用因子：TFⅡA、TFⅡB、TFⅡD、TFⅡE、TFⅡF、TFⅡH
③RNApolⅢ：负责转录5S rRNA、tRNA的前体、Alu序列和部分 snRNA
顺式作用元件：内部启动子Ⅰ（A box、B box）内部启动子Ⅱ（A box、B box）
反式作用因子：内部启动子Ⅰ（TFⅢC、TFⅢB）内部启动子Ⅱ（TFⅢA、TFⅢC、TFⅢB）（TFⅢC：辅助TFⅢB TFⅢB：定位因子，结合到A-box上游）

在 UBF 与DNA结合后，SL1方可结合上来，它类似原核生物RNA聚合酶中的σ因子，确保RNA聚合酶正确定位在起始点上。UBF 与RNA聚合酶Ⅰ相互作用可识别不同来源的模板，但SL1 具有种属特异性。
TFⅢA ： TFⅢA 在一行上有9个锌指，他们会插入到5S rRNA 基因内部启动子的每一面的大沟中，这就使特异的氨基酸能够与特异的碱基接触并相互作用，形成致密的 protein-DNA 复合物。

启动子上游元件（USE）：
GC岛（GGGCGG）:严格控制RNA的转录启动
CAAT盒（GGC(T)CAATCT）：决定启动子起始转录的效率，增强启动子的强度

● 试比较原核和真核细胞的mRNA的异同.
⑴原核生物
①原核生物mRNA 的半衰期短。
②许多原核生物mRNA以多顺反子形式存在。
③其5’端无帽子结构，3’端没有或只有较短的poly(A)。
④原核细胞mRNA（包括病毒）有时可以编码几个多肽。
⑤原核生物常以AUG（有时GUG，甚至UUG）作为起始密码子
⑵真核生物：
①其5’端存在帽子结构。
②绝大多数真核生物mRNA具有poly(A)尾巴。
③其RNA最多只能编码一个多肽。
④真核生物几乎永远以AUG为起始密码子。

● 剪接分支位点核苷酸是腺嘌呤核糖核苷酸

● RNA链合成的特点：
1.RNA是按5’→3’方向合成
2.以DNA双链中的反义链（模板链）为模板
3.以4种三磷酸核苷（NTPs）为原料
4.根据碱基配对原则
5.各核苷酸间通过形成磷酸二酯键相连
6.不需要引物
7.合成的RNA带有于DNA编码链相同的序列

● 真核生物RNA聚合酶Ⅱ转录起始
①TFⅡD因子对TATA盒的识别，TFⅡA与TFⅡD和其中的TBP结合，增强并稳定TFⅡD与TATA盒的结合，形成“前转录起始复合体（TIC）”（TFⅡD因子:TATA盒结合蛋白TBP、至少8个TBP辅助因子TAF）
②随后TFⅡB作为TFⅡD和RNA聚合酶的桥梁因子，富集高浓度RNA聚合酶到启动子周围，TFⅡF和TFⅡH使DNA解螺旋后有助于RNA聚合酶的转录与移动。形成“基本转录起始复合体（TIC）”
③TFⅡH的激酶活性使RBPⅡA型的CTD发生高频的磷酸化，转换为ⅡO型的高转录活性的RNA聚合酶。形成“完全的转录起始复合体（TIC）”
④RNA聚合酶在启动转录前清理转录起始复合体后，仅与TFⅡF因子一起完成转录的延伸
（TFⅡD：对增强子和沉默子作出反应）

● 原核生物与真核生物启动子的主要差别？
原核生物
TTGACA --- TATAAT------起始位点
-35 -10
真核生物 
增强子---GC ---CAAT----TATAA—5mGpp—起始位点
-110 -70 -25

● 增强子的组织和细胞学表达特性：
（1） 远距离作用
（2） 增强子的位置无需固定，可在受其调控基因的上游、下游、或内部。
（3） 一个增强子可以包含一个以上能够被转录激活子识别的元件。

● 沉默子：
①可以在远距离调控转录 （至少 1 kb 以外）。
②可以使染色质卷曲成浓缩的难以接近的非活性的形式。与组蛋白的去乙酰化有关。
③沉默子是一种通过延伸DNA的异染色质化而影响染色质结构，形成高密度的异染色质，从而关闭转录的DNA 元件。

● 绝缘子：
①是一段具有特化染色质结构的区域，能够阻断增强子和沉默子对靶基因的作用效应。
②当绝缘子位于增强子和启动子之间时，可以阻断增强子上的激活子与下游基本转录复合物的结合，从而阻止增强子对启动子的表达效应。
③当绝缘子位于沉默子和启动子之间时，可以提供一道屏障墙，阻止沉默子的异染色质化区域的延伸，从而阻断沉默子对下游靶基因的失活效应。

● 终止子：
1） 一种是依赖ρ因子(ρfactor)的转录终止子
2）一种是不依赖ρ因子的转录终止子

● 帽子结构的功能
①保护mRNA，防止降解。
②将mRNA转运出细胞核。
③增强mRNA的可译性。
④帽子结构是pre-mRNA正确剪切所必需。
⑤与某些RNA病毒的正链RNA的合成有关，抢夺宿主mRNA的帽子
⑥5’端完整的帽子结构将有利于第一个内含子的剪切。

● poly（A）尾巴的作用：
①稳定mRNA，防止降解。
②促进mRNA的翻译。
③在拼接和mRNA向核外运输的过程中发挥作用。

● 多腺苷酸化的意义：
①参与新生RNA从DNA/RNA/RNA聚合酶Ⅱ三联体复合物中的释放
②与转录偶联既能促进转录终止，也能防止mRNA“早熟”
③参与前体的3’端内含子的去除
④稳定mRNA
⑤影响翻译效率

● mRNA的降解：
mRNA作为合成蛋白质的模板，在完成任务后，就到达细胞的一定部位死亡。细胞对于mRNA的命运具有空间控制作用。
过程：真核细胞中mRNA降解的前奏是先去掉polyA尾，然后触发了5’帽子的去除，最后导致mRNA被一种外切酶从5‘→3’降解。
Ccr4p是一种去掉mRNA的polyA尾巴的酶，而去帽酶则位于P小体内

● 第一类内含子剪接的机制：
①剪接活性由35s rRNA自身催化（auto-catalysis）完成，剪接过程不需任何酶类与能量的参与。
②剪接反应只要求鸟苷酸的3’-OH。一处的磷酸酯键转化为另一处新的磷酸酯键，不需以分解高能前体物（NTP）为代价而形成新的磷酸酯键，破坏的磷酸酯键与形成的磷酸酯键总是相等。
这类内含子的剪接包括三次转酯反应
第一次转酯反应由游离的G发动，G的3’-OH攻击内含子的5’末端，产生G-内含子和外显子游离的3’-OH末端。
第二次转酯反应由上一个外显子的3’-OH攻击另一个外显子，并与之相连，同时释放线状的内含子。
游离的线状内含子发生第三次转酯反应而形成环状。

● RNA编辑（RNA Editing）的生物学意义
①形成/删除AUG, UAA, UAG, UGA…
②改变codon信息
③扩大编码的遗传信息量
④mRNA editing 较大程度地改变了DNA的遗传信息，使该基因的DNA序列仅是一串简略意义模糊的序列（abbreviated ）或称为隐秘基因、模糊基因

● 真核生物mRNA5’端帽子结构与3’尾巴结构的主要功能
⑴5’端“帽子”结构的功能：
①稳定mRNA的一级结构，防止mRNA被5’-核酸外切酶所水解；
②为mRNA识别核糖体提供信号，使 mRNA 较快地与核糖体结合，以提高mRNA对蛋白质的合成效率。
⑵3’端polyA尾巴结构的功能：
①有助于mRNA从细胞核向细胞质转移；
②与保护mRNA的稳定性和维持mRNA的二级结构有关；
③对蛋白质的合成速度有影响。

三、
1、转录是以DNA一条链为模板的RNA的酶促合成。我们把模板链称为有意链。
2、数个生化反应可由核酶催化，这种具有催化功能的RNA可以剪切自身或其它的RNA分子，或者完成连接或自身剪接反应。
3.hnRNA与mRNA之间的差别主要有两点大小、 翻译功能。
4.mRNA在转录开始后不久就与核糖体结合，形成NAP颗粒这种颗粒排列于mRNA分子上，呈串珠状，就像核小体一样。
5、原始转录物的一些序列被 修饰 ， 叫做RNA编辑。
6. 真核生物mRNA的5'-帽子结构是m7GpppXpYp, 其3'末端有PolyA结构。
7. 原核生物DNA指导的RNA聚合酶的核心酶的组成是α亚基、α亚基、β亚基、β’亚基。
8. 真核生物RNA聚合酶III负责转录tRNA、5S rRNA、Alu序列和部分snRNA 。
9. 在转录过程中RNA聚合酶全酶的σ因子负责识别启动子的Sextama Box(－35区),并通过σ与模板链结合,核心酶负责转录起始和延伸。
10.将TATA区上游的保守序列称为CAAT盒 。
11.真核生物的加工过程中，5’端加上帽子结构，在3’端加上多腺苷酸尾巴，后者由RNA末端腺苷转移酶催化。如果转录的基因不连续，那么， 一定要被切除，并通过剪接，将外显子连在一起。
12.每个锌指的C-末端形成一个α-螺旋，在DNA大沟的转折处与DNA结合。有锌参与时才具备转录调控活性。
13.GAL4 蛋白是参与半乳糖代谢的一套基因表达的正调节因子。GAL4能够识别这些基因上游激活序列。
14.LexA 蛋白是原核生物的阻遏物，在大肠杆菌细胞中，结合在lexA 操纵子上，能够阻止下游基因的表达。 LexA 蛋白无转录激活域，因为LexA 蛋白无转录激活功能。
15.激活域的功能是将RNA 聚合酶募集到启动子处，让结构基因开始表达。
16.未甲基化帽子的底物在剪切时，可以被S-腺苷酸-同型半胱氨酸抑制，此物质也是帽子甲基化过程的抑制剂。
17.AAUAAA 基序在pre-mRNA 多腺苷化位点上游 20 nt 处。多聚腺苷化的能力取决于一致序列的保守性。
18.多聚腺苷酸化涉及前体mRNA的切割和在切割位点的多聚腺苷酸化两个过程。
19.16S rRNA的3’端即非常保守，又高度自我互补，能形成发卡式结构。这正好说明了序列配对是动态的，可变的。
20. L19 是剪切下来的内含子，L19 可以促进RNA 重排，作为 RNA 异构酶；
具有酶的基本共性
21.在gRNA 的5’-末端，锚定序列能够引导gRNA到达mRNA将被编辑的区域。

四、
● 简述转录的基本过程?
答：模板识别：RNA聚合酶与DNA双链启动子相互作用并与之相结合。
↓
转录起始
↓
转录延伸：RNA聚合酶释放σ因子离开启动子，核心酶沿模板DNA链移动并使新生RNA链不断伸长。（TFⅡS 刺激延伸；TFⅡS 负责转录产物的矫正）
↓
转录终止：当RNA链延伸到转录终止位点时，RNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯键，RNA-DNA杂合物分离，转录泡瓦解，DNA恢复成双链状态，而RNA聚合酶和RNA链都被从模板上释放出来。

● 说明poly(A)在分子生物学实验中的应用价值。
a) 可将 oligo (dT) 与载体相连，从总体RNA中分离纯化mRNA
b) 用寡聚dT（oligo (dT)）为引物，反转录合成 cDNA

● Euk.mRNA帽子的种类。
帽子0（Cap-0） m7GpppXpYp-------（共有）m7G N7—甲基鸟苷
帽子1（Cap-1） m7GpppXmpYp--------第一个核苷酸的 2’-O 位上产生甲基化 （A N6 位甲基化）
帽子2 （Cap-2） m7GpppXmpYmp第二个核苷酸的 2’-O 位上产生甲基化（A、G、C、U）

● 真核生物mRNA前体内含子剪接的信号序列特征是什么？
mRNA前体中内含子的两端边界存在共同的序列，这些序列可能是产生mRNA前体剪接的信号。多数细胞核mRNA前体中内含子的5’边界序列为GU，3‘边界为AG。

● I型内含子发生改变后，可以产生其他酶的活性吗?如果可以，是哪些活性?这意味着I型内含子的催化中心有什么特点？
答：可以。这些活性包括：RNA聚合酶、内切核酸酶、磷酸酶、连接酶的活性。将I 型内含子转变成这些酶的能力表明它能结合于RNA的糖—磷酸骨架并能催化在它前后的几个不同反应。

● 转录涉及模板链和编码链的分离，解释在转录中单链DNA是怎样被保护的。
答： 转录过程中控板与编码链分离时，聚合酶覆盖了整个转录泡——从解旋位点到螺旋重新形成位点，因此单链的DNA被保护起来。

● 哪三个序列对原核生物mRNA的精确转录是必不可少的?
答： -35(RNA聚合酶结合位点)、-10(RNA聚合酶起始位点)启动子序列和终止子；

● 试证明一个基因中只有一条DNA链作为模板被转录。
答：若基因两条链均被转录，而RNA聚合酶只能以5’ →3’方向合成，所以两条DNA链会以相反方向转录。两信使携带着彼此互补的反向核苷酸序列，编码不同的多肽。信使只可以与一条DNA链(重链)互补，因而DNA双链中只有一条链作为转录的模板。

● 有一个被认为是mRNA的核苷酸序列，长300个碱基，你怎样才能： (1)证明此RNA是mRNA而不是tRNA或rRNA。 (2)确定它是真核还是原核mRNA。
答：根据序列组成进行判断： (1)此序列太长不可能是tRNA。如果它是rRNA，应该含有许多特殊元件，同时应具有可以形成发夹环的反向重复序列。如果是mRNA则应有AUG起始密码子、一段相应的氨基酸密码子和一个相应的终止密码子构成的可读框。 (2)所有的真核生物mRNA在5’端都含有一个7—甲基鸟苷，而且大多数还在3’端 有一个长的po1yA尾巴。这些都是原核生物mRNA所不具有的，但是原核生物mRNA靠近5’端有l—个核糖体结合序列(SD序列)。

● 详述怎样加工才能使真核生物mRNA 成熟
一、首、尾修饰
1、5’端加帽 成熟真核生物mRNA,其结构5’端形成-m7GpppmXpYp-帽子结构
2、3’端加尾 多数真核生物mRNA3’端都有多聚（A)尾，长约100－200个核甘酸。
二、真核生物mRNA的剪接
剪接就是在细胞核中，除去 hnRNA中的内含子，并在连接酶的作用下，将外显子各部分连接起来的过程。
(1)mRNA前体的剪切部位是在内含子末端的特定部位
(2)套索结构的形成及剪接
(3)剪接体的形成

● 现分离了一段DNA片段，可能含有编码多肽的基因的前几个密码子。该片段的序列组成如下:
5’CGCAGGATCAGTCGATGTCCTGTG 3’
3’GCGTCCTAGTCAGCTACAGGACAC 5’
(1) 哪一条链作为转录的模板链？
(2) mRNA的顺序是什么？
(3) 此mRNA能形成二级结构吗？
(4) 翻译从哪里开始，朝哪个方向进行？
(5) 此DNA最可能是从原核细胞还是真核细胞中分离的？
提示：mRNA上含有起始密码子AUG对应的编码链上应该是ATG，另一条链即是模板链
DNA的损伤原因是什么?
6、试比较RNA转录与DNA复制的区别？
7、简述σ因子的功能？

注：转录起始点（p126）、靶基因启动子（p126）、核心酶概念（p128）、转录的基本过程（p131）、三类机制剪接（p160）