贵州白山羊肌肉生长抑制素（MSTN）基因生物信息学预测与系统进化分析.pdf

本研究旨在解析贵州白山羊肌肉生长抑制素（MSTN)基因的结构特性，为该基因功能探究提供理论依据。基于生物信息学及比较基因组学方法，对NCBI数据库中已登录的贵州白山羊MSTN基因完整编码区序列(CDS)核苷酸组成特性及编码蛋白的相关结构开展预测及分析，构建了15个物种MSTN基因系统进化树。结果表明，贵州白山羊MSTN基因CDS长度为112 8 bp，共编码37 5个氨基酸，由3个外显子和2 个内含子构成，其AT含量均高于GC。贵州白山羊MSTN蛋白属混合型二级结构，存在无规则卷曲、延伸链和一螺旋，为弱碱不稳定亲水蛋白质；包括1个18 个氨基酸的潜在信号肽，无跨膜区，形成5对二硫键，含有16 个磷酸化位点；2 7 8 37 5位氨基酸为转化生长因子-样结构域。贵州白山羊MSTN基因与绵羊、牛等牛科动物的亲缘关系较近，与鸡形目原鸡和绿头野鸭的亲缘关系较远。本研究可为贵州白山羊MSTN基因分子遗传学及其表达调控研究奠定理论基础。关键词：贵州白山羊；肌肉生长抑制素基因；编码蛋白；比较基因组学；肌肉发育中图分类号：S827;Q754Bioninformatics Prediction and Phylogenetic Analysis of MSTN Gene in文献标识码：AGuizhou White Goat文章编号：10 0 1-47 2 1(2 0 2 3)0 5-0 0 16-0 6SONG Xingchao,MENG Jinzhu,ZHAO Yuanyuan,WU Zhenyang,AN Qingming(Guizhou Provincial Key Laboratory for Biodiversity Conservation and Utilization in the Fanjing Mountain Region,Collegeof Agroforesry Engineering and Planning,Tongren University,Tongren 554300,China)Abstract:In order to analyze the structural characteristics of myostatin(MSTN)gene in Guizhou white goat and provide theoretical basisfor exploring its function.The nucleotide composition of the complete coding region sequence and the related structure of the encoded pro-tein of MSTN gene in Guizhou white goat registered in NCBI database were predicted and analyzed.The phylogenetic tree of MSTN geneamong 15 species was constructed based on bioinformatics and comparative genomic methods The results showed that the length of codingregion of MSTN gene in Guizhou white goat was 1 128 bp,encoding 375 amino acids,including three exons and two introns,and the ATcontent was significantly higher than that of GC.Further analysis revealed that the mixed secondary structure of MSTN protein was mainlycomposed of random coil,extend strand and-helix,which was a weakly alkaline unstable hydrophilic protein.The MSTN protein ofGuizhou white goat contained one signal peptide composed of 18 amino acids,no transmembrane region,forming 5 disulfide bonds,inclu-ding 16 phosphorylation sites.278-375 amino acids are transforming growth factor-like domains.The MSTN gene of Guizhou white goatis closely related to sheep and cattle,and is relatively distant to chicken and mallard.The research would lay the foundation for moleculargenetics and expression study of MSTN gene in Guizhou white goat.Key words:Guizhou white goat;MSTN gene;encoding protein;comparative genomics;muscle development我国山羊遗传资源较为丰富，贵州白山羊属肉用型优良地方山羊品种，该品种已被列入贵州地方畜禽收稿日期：2 0 2 3-0 3-0 2基金项目：铜仁市科学技术局博士人才项目（铜市科研（2 0 2 0)12 6 号）；铜仁学院博士科研启动基金项目（trxyDH2001)；铜仁市科学技术局博士人才项目（铜市科研(2 0 2 3)4号），贵州省科技计划项目（黔科合基础(2 0 2 0)1Y138)作者简介：宋兴超（198 2-)，男，河北博野人，博士，副教授，主要从事特种畜禽遗传育种研究。通讯作者：安清明（198 7-)，男，教授，主要从事山羊遗传育种研究。遗传资源志中国畜禽遗传资源志羊志和农业农村部最新颁布的国家畜禽遗传资源目录1,2 ,因其具有第5期抗逆性强、耐粗饲、肉质细嫩、擅味轻和肉味鲜美等优点，深受消费者喜爱，但该品种存在屠宰率低、净肉率低及生长速度较慢等缺点3，限制了地方山羊品种养殖产业的进一步发展。在保证地方品种原有优质特点的前提下，如何提高其生长速度和成年体重是目前贵州地方山羊品种改良及山羊产业规模化发展的一个关键核心问题，然而传统育种方法周期长，遗传进展缓慢且效果不显著。基于分子水平,筛选山羊生长性状的关键基因及相关分子标记，并进行标记辅助选择育种，可加快肉用山羊品种选育的遗传进展，同时也是改良贵州特色地方山羊品种的有效策略。肌肉生长抑制素（Myostatin，M ST N)又称生长与分化因子8(Growth and differentiation factors 8,GDF8),属于转化生长因子超家族成员，是控制肌肉生长发育的重要负调控因子4,解除MSTN基因的生长抑制功能是提高畜禽肌肉产量的一种有效途径。小鼠MSTN基因被敲除后，可加快肌肉细胞增殖及增加骨骼肌含量,而过表达MSTN基因小鼠的肌肉量明显降低5,6 。MSTN基因第3外显子编码的蛋白是MSTN成熟肽部分，也是该基因的主要功能域。陈晨等7 研究发现，MSTN基因第3外显子nt175180缺失突变使MSTN蛋白缺失一个蛋白结合位点，可导致小鼠出现肌肉肥大表型。钟东明等8 利用RACE技术克隆了大刺鳅MSTN基因全长cDNA序列，其编码蛋白的N末端具有分泌必需的信号肽序列。Bi等9 检测MSTN基因5UTR存在5bp插入突变与内蒙古白绒山羊胸深显著相关(P=0.003)。目前，牛、羊、猪、家禽及鱼类等主要农业经济动物MSTN基因序列已被相继鉴定且该基因的变异可引起肌肉产量及肉质性状的变化，然而，目前鲜见贵州白山羊MSTN基因分子结构特性及其分子系统进化方面的相关报道。本研究以贵州白山羊MSTN基因为研究对象，应用比较基因组学方法对该基因编码区核苷酸组成及蛋白结构特性进行了相对全面的生物信息学预测与系统进化分析，旨在为进一步解析贵州白山羊肌肉发育相关候选基因及其调控肉质性状的遗传机制提供借鉴与参考，同时也为贵州白山羊功能基因组学深入研究及特色山羊品种遗传资源合理保护和利用奠定理论基础。1材料与方法1.1序列获得通过美国国家生物信息中心NCBI网站（http:ll宋兴超，等：贵州白山羊肌肉生长抑制素（MSTN)基因生物信息学预测与系统进化分析AT含量均明显高于GC,见表1。17www.ncbi.nlm.nih.gov/)的Nucleotide数据库中筛查获得贵州白山羊MSTN基因（登录号：EF588022）核苷酸序列。同时，下载与贵州白山羊相似性较高的绵羊（M H 0 2 5940）、牛（JQ711180）、马鹿（EF629535）、猪（A Y2 0 8 12 1）、家马（KY746356）、人（NG-009800）、小家鼠（AY204900)、褐家鼠（NM-019151）、家犬（NM-001002959）、北极狐（AY606017）、赤狐（FJ966248）、貉（FJ96 6 2 50）、家鸡（NM_001001461）和绿头野鸭(AF440861)MSTN基因核苷酸与对应氨基酸序列。1.2分析方法将下载的贵州白山羊MSTN基因核苷酸序列导入在线软件 GENSCAN（h t t p:l/g e n e s.m i t.e d u/G ENS-CAN.html)，预测该基因结构组成。运用ExPASy(Ex-pert Protein Analysis System)在线服务平台 ProtParam(https:/web.expasy.org/protparam/)预测 MSTN基因编码蛋白质一级结构理化参数。运行里昂大学法国国家科学研究中心开发的在线程序(https:/npsa-prabi.ibcp.fr/），基于蛋白质二级结构分类识别（Discriminationofprotein secondary structure Class,DSC)、多元线性回归组合(Multivariate linear regression combination,MLRC)和PHD方法分析MSTN蛋白二级结构，并参考Skolnick等12 判断蛋白质分类方法综合预测其二级结构类型。通过 SignalP 4.1、T M H M M 2.0.Sc r a t c h Pr e d ic t Pr o t e in和 NetPhos 3.1 在线软件(https:/services.healthtech.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/）分别预测贵州白山羊MSTN蛋白潜在的信号肽、跨膜区、二硫键和磷酸化位点。利用CDART在线工具（https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/lexington/lexington.cgi?cmd=rps),SMART 软件(http:/smart.embl.del)和 Motif Scan 程序（https:/myhits.sib.swiss/cgi-bin/motif scan）分别分析贵州白山羊MSTN蛋白结构域和功能模体。利用DNASTARLasergene17.3软件中MegAlign程序进行贵州白山羊与其他物种MSTN基因核苷酸和编码氨基酸的相似性分析；基于MEGA5.0软件构建贵州白山羊与其他物种MSTN基因序列的系统进化树。2丝结果与分析2.1贵州白山羊MSTN基因结构特点MSTN基因结构分析表明，贵州白山羊基因包括完整的3个外显子、2 个内含子及部分5 UTR(222bp)，2个内含子均以“GT”开始，结束于“AG；编码序列(coding sequence,CDS)全长112 8 bp，起始密码子为ATG，T G A 为终止密码子，且其外显子和内含子碱基18外显子Exon编码区Coding sequence内含子Intron总内含子Total introns2.2贵州白山羊MSTN蛋白结构特征分析2.2.1一级结构理化参数贵州白山羊MSTN基因共编码37 5个氨基酸，由2 0 种常见氨基酸组成(表2)，其中,亮氨酸(9.9%)含量最高，色氨酸(1.6%)含量最低，带正电荷氨基酸(Arg+Lys)和带负电荷氨基酸(Asp+Glu)均为48 个。ProtParam在线软件预测表明，贵州白山羊MSTN蛋白化学分子式为C1912H3018N512O561S21，氨基酸频率/%Amino acidNumber丙氨酸 Ala(A)15精氨酸Arg(R)17天冬酰胺Asn(N)17天冬氨酸Asp(D)23半胱氨酸 Cys(C)13谷氨酰胺 Gln(Q)18谷氨酸Glu(E)25甘氨酸 Gly(G)20组氨酸 His(H)7异亮氨酸 Ile(I)242.2.2二级结构多种在线软件综合预测蛋白质二级结构表明，无规卷曲、延伸链和-螺旋为贵州白山羊表3贵州白山羊MSTN蛋白二级结构综合分析Table 3 Comprehensive analysis of secondary structure of MSTN protein in Guizhou white goat无规卷曲-螺旋方法Random coilMethod氨基酸数量Number of amino acid(aa)DSC221MLRC207PHD227Sec.Cons223特表1贵州白山羊MSTN基因外显子和内含子长度与碱基构成Table 1The length and base composition of exon and intron of MSTN gene in Guizhou white goat基因结构Gene structureTable 2Amino acid composition of MSTN protein in Guizhou white goat数量/个374.5赖氨酸 Lys(K)4.5甲硫氨酸 Met(M)6.1苯丙氨酸Phe(F)3.5脯氨酸 Pro(P)4.8丝氨酸Ser(S)6.7苏氨酸Thr(T)5.3色氨酸Trp(W)1.9酪氨酸Tyr(Y)6.4缬氨酸Val(V)MSTN蛋白的主要二级结构，属混合型二级结构，见表3。延伸链Extend strand比例/%氨基酸数量RatioNumber of amino acid(aa)58.9310955.208760.5311059.47100产长度/bpLength1372237533811 12811 834220273 861表2 贵州白山羊MSTN蛋白氨基酸组成FrequencyAmino acid4.0亮氨酸Leu(L)比例/%RatioNumber of amino acid(aa)29.0723.2029.3322.67研碱基构成/%Base compositionAG32.8022.3134.4020.5330.1821.0032.4521.2831.9018.1033.9414.8532.9716.39由6 0 2 4个原子组成，分子质量为42.8 2 7 35ku，理论等电点（PI）为7.0 1，属于弱碱性蛋白。贵州白山羊MSTN蛋白不稳定指数44.8 7,为不稳定蛋白质（计算指数 40：不稳定)；脂肪族氨基酸指数为8 4.45;亲水性总平均值(Grand average ofhydropathicity,GRAVY)为-0.411,初步推测该蛋白具有较强的亲水性。氨基酸究C22.3120.8019.4220.8317.0116.5816.782023年第45卷第5期TA+T22.5855.3824.2758.6729.4059.5825.4457.8932.9964.8934.6368.5733.8566.82数量/个Number3181424212161222Alpha helix氨基酸数量45813844G+C44.6241.3340.4242.1135.1131.4333.18频率/%Frequency9.98.32.13.76.45.65.61.63.25.9比例/%Ratio12.0021.6010.1311.73第5期2.2.3信号肽、跨膜区、二硫键与磷酸化位点分析信号肽预测表明，C、Y和S分别表示原始剪切位点（Rawcleavage site）、综合剪切点（Combined cleavage site）和信号肽（Signalpeptide）的分值，当C值较高且S分值由高转低的位点是典型信号肽的可能剪切点（图1)。由图1可知,贵州白山羊MSTN蛋白C端存在1段18个氨基酸的潜在信号肽，剪切位点为第18 19 位氨基酸位点(.LVA-GPV.)。SignalP-4.1prediction(euknetworks):MSTN1.00.80.60.40.20.0MOKLOIFVYIYLFMLLVAGPVDLNENSEOKENVEKKGLCNACLWRONNKSSRLEA1KIQILSKLRLETA010#MeasurePositionValuemax.C24max.Y19max,SmeansD1-18Name=MSTNSP=YEsCleavage site between pos,18 and 19:LVA-CP图1贵州白山羊MSTN蛋白信号肽分析Fig.1 Analysis of signal peptide for MSTN in Guizhou white goat TMHMM2.0分析表明，贵州白山羊MSTN蛋白不存在跨膜结构域，为非跨膜蛋白。ScratchProteinPre-dictor预测蛋白质二硫键发现，13个半胱氨酸残基(Cys)中，10 个Cys共形成5对二硫键，分别为:39 42、272281、137 138、30 9 339和313 340 位氨基酸。NetPhos3.1在线软件分析（分值0.7)显示，贵州白山羊MSTN蛋白含有16 个可被激酶磷酸化的位点，其中1个酪氨酸（Tyrosine，Y)位点、4个苏氨酸(Threonine,T)位点和 11 个丝氨酸(Serine,S)位点，包括5个蛋白激酶C(ProteinkinaseC,PKC)磷酸化位点，分别位于143位(FFKFSSKIQ)、144位(FKFSSKIQH)、205位(GIWQSIDVK)丝氨酸和18 7 位(GTRYTGIRS)、210位(IDVKTVLQN)苏氨酸,其余11个则为无特异性激酶位点。2.3贵州白山羊MSTN蛋白结构域和功能模体分析贵州白山羊MSTN蛋白存在2 个重要功能域：宋兴超，等：贵州白山羊肌肉生长抑制素（MSTN)基因生物信息学预测与系统进化分析2030PositionCutoffsignal peptide?0.3590.548120.9351-180.8890.7320.450YES19转化生长因子-生长分化因子8(TGF-GDF8)和转化生长因子b前肽超家族(TGFb-propeptidesuperfam-ily)，分别位于第2 6 8 37 5和42 2 36 位氨基酸；该蛋白包含1个信号肽，1个TGFb-propeptide结构域，1个转化生长因子-家族(TGFB)和2 个低复杂度结构域，分别位于1 18、37 2 6 7、2 8 1 37 5、99 110 和136145位氨基酸。贵州白山羊MSTN蛋白存在5个酪蛋白激酶I磷酸化位点(Caseinkinase II phospho-rylation site,CK2):5154(SRLE)、10 5 10 8(SLED)、C-score123126(TESD)、2 40 2 43(T FPE)、2 6 4 2 6 7(SRRD);S-scoreY-score40501个亮氨酸拉链模块(Leucine zipper pattern):216237(LKQPESNLGIEIKALDENGHDL)位氨基酸，符合L-x(6)-L-x(6)-L模块的结构特征;3个N-豆蔻酰基化位点(N-myristoylation site,MYRISTYL):3742(GLCNAC)、183188(GTRYTG)和 2 0 1 2 0 6(GIWQSI)位氨基酸;5个蛋白激酶C磷酸化位点（ProteinkinaseCphospho-rylation site,PKC):5052(SSR)、143 145(SSK)、6070191193(SLK)、2 6 0 2 6 2(T PK)和 2 6 4 2 6 6(SRR)位氨基酸；1个酪氨酸激酶磷酸化位点（Tyrosinekinasephosphorylation)：17 8 18 6（K PM K D G T RY）位氨基酸；1个EF-手型钙结合域（EF-handcalcium-bindingdomain):99111(DDSSDGSLEDDDY)位氨基酸;1个转化生长因子-前体肽(TGF-beta propeptide)和1个转化生长因子-样结构域（Transforminggrowth factorbeta like domain,TGF-beta):分别位于2 7 8 37 5和39 2 57位氨基酸。2.4不同物种MSTN基因相似性比对及系统进化树的构建贵州白山羊与绵羊、牛、马鹿、猪、家马、人、小家鼠、褐家鼠、家犬、北极狐、赤狐、乌苏里貉、家鸡和绿头野鸭核苷酸相似性分别为：99.47%、96.45%、96.2 8%、94.68%、9 3.7 1%、9 2.38%、8 9.12%、8 8.59%、9 1.2 2%、90.60%、9 0.7 8%、9 0.9 6%、8 2.54%和8 2.8 9%，氨基酸序列相似性分别为：10 0%、93.33%、94.93%、95.47%、94.40%、9 4.13%、9 2.0 2%、9 0.6 9%、9 3.0 7%、9 2.53%、93.07%、93.0 7%、8 7.7 3%和8 7.7 3%。由系统进化树可知，贵州白山羊与绵羊同属羊亚科，聚为一支，亲缘关系最近，与家鸡和绿头野鸭亲缘关系最远，见图2。203讨论基因是决定家畜重要经济性状的遗传基础，随着测序成本的逐渐下降及大数据组学的不断更新，美国国家生物信息中心数据库也注释了大量不同物种的关键基因序列，为进一步研究相关基因调控经济性状的功能提供了便利。本研究通过整合生物信息学与比较基因组学方法对NCBI数据库中贵州白山羊MSTN基因进行了较为全面的综合分析。首先，从该基因编码区核苷酸序列基本结构组成、编码蛋白质的理化参数、二级结构、信号肽、跨膜区及关键功能结构域等方面做简要预测，其次分析了该基因编码氨基酸序列在不同物种间的同源性，并基于氨基酸序列构建了15个物种的系统进化树，从分子水平探讨了它们之间的进化关系。该结果为深入研究MSTN基因调控不同物种骨骼肌生长发育的分子机制及改良畜禽肉质性状提供了比较全面的生物学基础信息。GenBank数据库中登录的贵州白山羊MSTN基因全长为52 11bp，由2 2 2 bp启动子区、3个外显子和2 个内含子(长度分别为18 34bp和2 0 2 7 bp)组成。编码区序列长度为112 8 bp，外显子1全长37 2 bp，翻译第1 12 4位氨基酸，外显子2全长37 5bp，翻译第12 5 2 49位氨基酸，外显子3全长38 1bp，翻译第2 50 37 5位氨基酸。贵州白山羊基因结构与其他哺乳动物一样，外显子和内含子连接处符合RNA剪接信号“GTAG”法则10 。贵州白山羊MSTN基因编码区A+T含量为57.8 9%，高于G+C含量，这与梁春年等11 和Stefaniuk等12 分别报道的耗牛和马的研究结果基本一致。除此之外，贵州白山羊特产研100贵州白山羊Caprahircus绵羊Ovisaries100牛Bos taurus4369274960100图2 不同物种MSTN基因编码核苷酸序列系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree based on the nucleotide sequence of MSTN gene among different species究马鹿Cervus elaphus xanthopygus猪Sus scrofa家马Equuscaballus80家犬（Canis lupusfamiliaris乌苏里貉Nyctereutes procyonoides北极狐Alopexlagopus100L97100MSTN蛋白包括1个由18 个氨基酸组成的N-端信号肽、1个TGFb-propeptide结构域，1个转化生长因子-家族（TGFB）和2 个低复杂度结构域，具有转化生长因子家族成员典型的结构域，这些预测的潜在特有结构域与绵羊13、马鹿14 及福建白兔15 MSTN蛋白研究结果一致。信号肽位于分泌蛋白的N端，它对分泌蛋白起着重要引导作用16 。Martinez-ruiz等17 研究表明，改造信号肽可以大大提高外源蛋白的表达量，因此，可对预测的贵州白山羊MSTN基因信号肽位置进行修饰，减少MSTN蛋白在贵州白山羊体内的表达，以进一步提高该品种的肌肉增长速度，提高产肉量。由MSTN基因编码氨基酸序列相似性比对结果推测，贵州白山羊与绵羊、牛和马鹿的亲缘关系最近，与啮齿目、鸡形目相对较远，这与相似性比对分析的结果相符，也与15个物种的形态学分类及实际演化顺序一致，符合物种的进化规律，而且也反映了不同物种MSTN编码蛋白结构的一致性对其生物学功能的重要意义。在肉用动物新品种选育及培育过程中，生长、体及肉质性状作为其重要的经济性状，是家养动物新品种选育工作的一项关键育种目标。体重和日增重是肉用山羊的关键性状，在肉类加工业中具有重要的经济价值。作为一种高原山地特色肉用山羊品种资源，如能挖掘调控生长性状关键基因或筛查获得与肌肉发育连锁的分子标记，基于分子水平探究其蛋白关键功能位点变异与性状间的关系，可为后续利用基因敲除和过表达技术解析基因功能以及运用基因编辑技术开展生2023年第45卷第5期赤狐Vulpesvulpes人Homosapiens小家鼠Musmusculus褐家鼠Rattus norvegicus家鸡Gallus gallus绿头野鸭Anas platyrhynchos第5期长性状的遗传改良提供分子育种策略。MSTN基因作为肌肉生长的负调控因子，在畜禽中的研究进展表明，该基因活性的降低或丧失会造成其肌肉与其他组织的比例大大提高18,19。在山羊MSTN基因研究中,Bi等2 0 研究表明，MSTN基因5 UTR中5bp缺失（TTTTA)与陕北白绒山羊体高和胸宽指数显著相关(0.0 1 P0.05），可作为正调控DNA标记用于优良个体的选择育种。Kolenda等2 1 研究发现，在卡缅涅茨羊和波美拉尼亚羊MSTN基因均存在多个SNP位点，并且某些多态性位点可以作为生长性状的遗传标记。Na等2 2 利用PCR产物直接测序方法在大足黑山羊、酉州黑山羊、波尔山羊和努比亚山羊群体的MSTN基因内含子1、2 和3中共检测到2 0 个SNPs，其中，联合基因型(CT-AA-TT-CC-CC)个体具有较高的初生重和断奶重(P0.05)。刘铮铸等2 3 基于PCR-RFLP方法分析了我国主要地方山羊品种MSTN基因内含子2 和外显子3的遗传变异。在贵州白山羊MSTN基因应用方面，可以进一步筛选MSTN基因突变的个体，然后通过分子标记辅助选择技术培育出产肉率高的优良个体。参考文献1许厚强.贵州地方畜禽遗传资源志M.北京：中国农业出版社,2 0 19.2国家畜禽遗传资源委员会.中国畜禽遗传资源志-羊志M.北京：中国农业出版社，2 0 12.3安清明，王星，黄永震，等.贵州白山羊ADIPOQ基因生物信息及组织表达特异性分析J.中国畜牧兽医，2 0 2 0，56(8)：84-90.4彭定威，李瑞强，曾武,等.编辑MSTN半胱氨酸基元促进两广小花猪肌肉生长J.遗传，2 0 2 1,43(3)：2 6 1-2 7 0.5 LIN J,ARNOLD H B,DELLA-FERA M A,et al.Myostatinknockout in mice increases myogenesis and decreases adipo-genesisJ.Biochemical and Biophysical Research Communi-cations,2002,291(3):701-706.6 REISZ-PORSZASZ S,BHASIN S,ARTAZA J N,et al.Lowerskeletal muscle mass in male transgenic mice with muscle-spe-cific overexpression of myostatinJ.American Journal of Physio-logy,Endocrinology and 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