骨水泥材料加压灌注对椎间盘退变影响的实验研究.pdf

收稿日期:2021-03-23;修订日期:2021-10-10基金项目:内蒙古自治区自然科学基金项目(编号:2015MS0870)作者简介:吴维勇(1992-),男,内蒙古籍,主治医师研究方向:中西医结合骨科通信作者:刘聪电子邮箱:103825905 实验研究骨水泥材料加压灌注对椎间盘退变影响的实验研究吴维勇1,王业林2,哈斯2,邢鹏2,王晓岚2,刘聪2(1.天津中医药大学,天津 301617;2.内蒙古自治区中医医院骨伤科,内蒙古呼和浩特 010000)摘要:目的 通过建立兔骨质疏松模型,探讨椎体灌注骨水泥(polymethyl methacrylic,PMMA)影响相邻椎间盘代谢的生物学机制。方法 选用成年雌性新西兰大白兔 45 只,其中 15 只作为正常对照组(A);剩余的 30 只以去势法建立兔骨质疏松模型,确定骨质疏松动物建模成功后,随机分为实验组(B)和实验组(C)各 15 只,手术部位选择第 6、7 腰椎,模拟经皮椎体成形术式。其中,B 组椎体穿刺成功并放置通道后,不注入任何物质;C 组分别向第 6、7 腰椎椎体注入约 0.5 mL 的 PMMA;对照组(A)不做任何处理。术后 8 周进行标本取材,并作如下研究:观察实验对象椎间盘髓核、纤维环等组织的病理变化,对其病理变化进行评分;测定实验对象的髓核组织水含量、葡萄糖胺聚糖 GAG 含量以及型胶原与蛋白聚糖的表达量;应用 DICOM 软件分别测试实验对象的椎间盘灰度值。结果 PMMA 灌注 8 周后,组织学观察发现实验组(C)的髓核和纤维环结构较实验组(B)以及对照组(A)发生显著的退变(P0.01);实验组(C)动物髓核含水量、GAG、型胶原和蛋白聚糖的表达均较实验组(B)以及对照组(A)有较明显下降(P0.01);影像学检查分析结果显示:实验组(C)的灰度值明显高于对照组(A)和实验组(B),且随时间推移,实验组(C)的增长量明显高于对照组(A)和实验组(B),均有显著性差异(P0.01)。结论PMMA 加压灌注椎体会影响相邻椎间盘的正常代谢并引发或加速组织结构的退变。关键词:骨质疏松;骨水泥;椎间盘中图分类号:R681.5 文献标识码:A 文章编号:1005-7234(2023)04-0503-05DOI:10.3969/j.issn.1005-7234.2023.04.001Experimental study on effect of bone cement on intervertebral disc degenerationWU Wei-yong1,WANG Ye-lin2,HA Si2,XING Peng2,WANG Xiao-lan2,LIU Cong2(1.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin301617,China;2.Department of Traditional Chinese MedicalOrthopedics,Inner Mongolia Traditional Chinese Medicine Hospital,Hohhot010000,China)Abstract:Objective To establish a rabbit osteoporosis model and explore the biological mechanism of vertebral body perfusioncement(polymethyl methacrylic,PMMA)affecting the metabolism of adjacent intervertebral disc.MethodsForty-five healthy NewZealand white rabbits were selected and 15 were selected as the normal control group(A).The remaining 30 rabbitswere established ascastor-induced osteoporosis model.Then they were randomly divided into experimental groups(B)and(C)after successful modellingofosteoporosis,with 15 rats in each group.The surgical procedure of percutaneous vertebroplasty was used to set the 6/7 lumbarvertebrae as the surgical vertebral body,and theexperimental group B wasonly performedvertebral puncture without injecting anysubstance;experimental group C was injected approximately 0.5 ml PMMA into vertebrae 6 and 7 respectively,and the control group Areceived no treatment.Specimens were taken 8 weeks after surgery and the following studies were conducted:The pathologicalchanges of the intervertebral disc nucleus pulposus,annulus fibrosus,and other tissues of the experimental subjectswere observed andtheir pathological changeswere scored;The content of water,glucosamine glycan GAG and the expression of type II collagen andProteoglycan in the nucleus pulposus of the experimental subjects were measured.DICOM software was appliedto test the grayscalevalues of the intervertebral discs of the experimental subjects.ResultsAfter 8 weeks of PMMA perfusion,the structure of nucleuspulposus and annulus fibrosus in theexperimental group(C)showed significant degeneration compared with theexperimental group(B)and control group(A)(P0.01);the water content of nucleus pulposus and the expression of gag,type II collagen and proteoglycan inthe experimental group(C)were significantly lower than those in theexperimental group(B)and control group(A)(P 0.01);theresults of imaging examination showed that the gray value of the controlgroup(A)and experimental group(B)was significantly lowerthanthat of the experimental group(C).The growth of experimental group(C)was significantly higher than that of thecontrol group(A)andexperimental group(B)over time,with significant statistical305颈腰痛杂志 2023 年第 44 卷第 4 期 The Journal of Cervicodynia and Lumbodynia 2023,Vol.44 No.4difference(P0.01).Conclusion Pressure-filled vertebral body of bone cement(PMMA)material can affect the normal metabolismof adjacent intervertebral disc,induce or accelerate the degeneration of tissue structures.Key words:osteoporosis;bone cement;intervertebral disc 近年来,经皮椎体后凸成形术(percutaneous ky-phoplasty,PKP)和经皮椎体成形术(percutaneous ver-tebraplasty,PVP)以其止痛快、创伤小、恢复快、安全性高的优点,逐渐成为治疗老年骨质疏松并发椎体压缩骨折的主要措施1-3。目前,椎体成形术的填充材料仍以聚甲基丙烯酸甲酯(polymethyl methacrylic,PMMA)骨水泥为主4。临床中发现,骨水泥对责任椎体加压灌注后常引起相邻椎间盘的退变,进而为患者带来不必要的伤害,而该领域的研究多以静态力学分析 PMMA 灌注后对相邻椎体的生物力学影响,而对活体椎体灌注后基因水平的分子生物学变化研究较少。那么,PMMA 灌注产生的高压、高热以及 PMMA 本身具有的生物毒性,究竟对相邻椎间盘会产生什么样的影响呢?本课题采用动物活体实验,模拟椎体灌注 PMMA 手术操作进行造模,检测椎体灌注术后相邻椎间盘的代谢改变。1 材料与方法1.1 实验动物及实验分组本实验采用普通级雌性成年新西兰大白兔 45只(8 月龄,体重 2.5 3.5 kg)作为实验对象,由内蒙古医科大学实验动物中心提供(SCXK(蒙)2015-001),随机等分为3 组:正常对照组(A),实验组(B)和实验组(C)。其中,实验组(B)和(C)制备骨质疏松模型,并模拟 PVP 手术操作。C 组腰椎椎体灌注PMMA 材料,B 组不灌注。1.2 仪器和试剂充电式起子电钻(D1206-10S,浙江博大公司),双能 X 射线骨密度仪(Lunar Prodigy,美国通用公司),C 型臂 X 线机(7200,德国西门子公司),病理切片机(RM2235,德国徕卡公司),台式高速冷冻离心机(CT15RE,日本日立公司),电泳仪和电泳槽(DYY-8C,中 国 六 一 仪 器 厂),光 学 显 微 镜(BM2000,江南永新公司),western boltting 红外荧光扫描系统(美国奥德赛 CLX),凝胶照相分析系统(基因有限公司),真空冷冻干燥机(YB-FD-1,中国亿倍公司),梯度 PCR 扩增仪(T100,美国伯乐公司),骨水泥(Osteopal V,德国 heraeus 公司),引物(上海生工生物工程有限公司设计),苏木素细胞染色液(迈新生物技术有限公司),伊红(北京索莱宝科技有限公司),RBS(迈新生物技术有限公司)。抗体信息:型号:CD29 抗体;产品号:bs-0486R;规格:100 L;型号:CD34 抗体;产品号:MA1-22646;规格:100 g;厂家:美国 Thermo Fisher Scientific 公司;型号:CD44 抗体;产品号:PA5-21419;规格:100L;厂家:美国 Thermo Fisher Scientific 公司。1.3 实验方法1.3.1 建造兔骨质疏松动物模型本组采用方忠等5研究中推荐的家兔去势法。制作骨质疏松模型,根据比较腰椎椎体骨密度值,验证是否成功建立骨质疏松模型6。1.3.2 手术过程取俯卧位,定位两侧髂嵴连线中点即为 L7,以此间区域为中心,电动去毛器扩大去除被毛,依无菌原则消毒铺单巾。透视下于目标椎体(L7)右侧两横突之间刺破皮肤,切口约 2.0 mm。透视观察,定位针尖位于椎体中部骨皮质。用电钻经 1.0 mm 注射针头空心内,穿入 0.8 mm 克氏针,缓慢推注至椎体内,穿刺角度于水平面呈35 45,外展25与横突平行。在克氏针到达椎体中部的过程中,用正侧位透视全程观察,并用去除针尖的直径 1.0 mm 一次性针头套入克氏针外部并旋入至推注部位,进行扩张并建立推注通道,经通道注 70%碘克沙醇注射液 0.5 mL,透视观察确认造影剂未进入椎管;实验组(B)直接冲洗伤口、无菌敷料包扎;实验组(C)将溶剂加入骨水泥粉,配置骨水泥,并置于 1 mL 注射器中,进而充入用 18 G 穿刺针改造成的推助器,待凝固成膏状后,用直径 0.8 mm 针芯将骨水泥推注入椎体内。向椎体内约注入 0.5 mL 骨水泥;透视观察推注效果满意,再采用同样步骤注入相邻椎体(L6)。注射器抽取生理盐水冲洗,切口较小不作缝合,无菌敷料包扎。灌注填充过程顺利,术中及术后影像检查显示,椎体内灌注填充的骨水泥位置良好,符合研究要求。1.3.3 标本取材每组实验动物分别于手术后 8 周处死。截取405颈腰痛杂志 2023 年第 44 卷第 4 期 The Journal of Cervicodynia and Lumbodynia 2023,Vol.44 No.4L6-7椎间盘及终板软骨,保证其完整,迅速置于液氮中,并随后转入-80 冰箱中保存待用。1.3.4 影像学检查术后 2、4、8 周应用 DICOM 软件分别测试对照组(A)、实验组(B)和(C)的椎间盘灰度值,采集数据并统计学分析。1.3.5 组织学检查H-E 染色观察:根据 Masuda 等7-8提出的标准,从纤维环、纤维环与髓核交界处、髓核细胞构成以及髓核基质方面,评价椎间盘病理变化。终板及髓核组织水含量的测定:测量终板及髓核组织的重量并记录得出湿重值 A,放入真空冷冻干燥机中干燥,以 24 h 为单位,重复多次,直至前后2 次重量测量值无差别即得干重值 B。计算含水量=(A-B)/A100/%。葡萄糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)含量检测:按 GAG 含量(ug/mg)=硫酸 GAG(ug)/组织干重(mg)公式,计算出干重髓核组织中 GAG 的含量。免疫印迹(western-blot)检测型胶原与蛋白聚糖的表达:在液氮中研磨组织样本后,加入苯甲基硫酞氟的细胞裂解液,在震荡及离心后,取上清液,用BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度,调整浓度,加入上样缓冲液,在 95 煮后制备好样品。制胶,将蛋白电泳分离并转到硝酸纤维素膜上,封闭膜,在加入一抗、二抗孵育后,行 ECL 法显影。1.3.6 统计学分析实验数据在 SPSS 20.0 软件中处理,所有资料数值以“xs”表示,方差分析用于进行多组均数的比较,t 检验用于分析两组之间各种均数的比较,以P0.05 为差异有显著意义。2 结果2.1 骨质疏松动物模型建立的骨密度测定结果对照组(A)在 6 个月后,其骨密度变化不大;而实验组(B)和(C)在去势并饲养 6 个月后,骨密度出现明显下降(P0.05)。详见表 1。表 1 各组骨质疏松模型建立前后骨密度比较(xs,mg/cm2)组别例数造模前造模后 6 个月对照组(A)150.2050.1090.2150.113实验组(B)150.2110.0310.1640.029a实验组(C)150.2020.0790.1570.044a 注:与造模前比较,aP0.052.2 PMMA 灌注 8 周后髓核和纤维环的 H-E 染色结果(见图 1、图 2)根据椎间盘组织学评价分级量表(见表 2),对标本进行评分:对照组(A)为(4.330.617)分,实验组(B)为(4.670.816)分,实验组(C)为(10.471.685)分;三组间比较,对照组(A)和实验组(B)的评分均显著低于实验组(C),差异有统计学意义(P50%),未见空泡细胞髓核基质1 级:正常胶冻状表现2 级:细胞外基质轻度浓集3 级:细胞外基质中度至重度浓集注:组织学评价分 4 方面。1 3 级分别对应 1 3 分,各观察指标相加后,正常椎间盘评 4 分,严重退变椎间盘评 12 分。2.3 PMMA 灌注 8 周后 western-blot 检测型胶原与蛋白聚糖的表达对照组(A)和实验组(B)的髓核含水量、GAG、蛋白聚糖和型胶原蛋白的表达量均明显高于实验组(C)(P0.05),详见表 3、图 3-4。2.4 PMMA 灌注8 周后应用 RadiAnt DICOM ViewerBETA 4.9.15 检测椎间盘灰度值对照组(A)和实验组(B)的灰度值明显低于实验组(C),且随时间推移,实验组(C)的增长量明显高于对照组(A)和实验组(B),差异有显著性(P0.05)。详见表 4。表 3 western-blot 检测型胶原与蛋白聚糖的表达(xs)组别例数含水量(%)GAG 的含量(ug/mg)型胶原蛋白表达水平蛋白聚糖表达水平A 组1580.333.41a19.184.43a1.330.21a0.910.20aB 组1579.465.22a18.263.32a1.230.12a0.880.12aC 组1558.652.727.782.310.520.100.430.16 注:a在同一个指标下,与 C 组比较,P0.01图 3 western-blot 检测术后 8 周 II 型胶原表达图 4 western-blot 检测术后 8 周蛋白聚糖的表达表 4 DICOM 检测不同时间各组椎间盘灰度值比较(xs)组别例数检测时间2 周4 周8 周A 组1592.442.58a94.142.19a94.213.03aB 组1595.243.31a96.332.27a96.134.54aC 组15107.222.55122.593.36b176.698.24bc 注:a在同一时间点与 C 组比较,P0.01;b在 C 组内与 2 周比较,P0.01;C在 C 组内与 4 周比较,P0.013 讨论目前,临床 PKP 或 PVP 所采用的灌注填充材料仍以 PMMA 为主。既往有文献报道,在椎体 PMMA灌注术后,病椎体相邻的终板软骨及椎间盘易出现一定程度的退变,相邻的椎体更易发生骨折。相关文献报道,PMMA 椎体灌注术后再发生的骨折中,约50%发生在相邻的椎体9。本实验对 PMMA 灌注产生的高压、高热以及 PMMA 生物毒性对相邻终板软骨和椎间盘产生的分子生物学影响进行了进一步的研究。软骨终板是纤维软骨,也是椎间盘的组成部分之一,其存在于椎体上下表面。正常情况下,由于椎间盘没有血供,发育成熟的软骨板和椎间盘纤维环均无血管和神经支配,椎体内血管经软骨板的弥散作用是其营养的最重要来源10,因此,随着年龄的增长,软骨终板逐渐变薄并出现钙化,继而出现椎间盘的退变11-12。当软骨板的通透性或髓核的渗透能力开始降低时,将出现椎间盘变性,椎体间的稳定结构遭破坏等现象。PMMA 灌注进入椎体并发生聚合后,凝聚为较稳固的高分子化合物,其强度、刚度及弹性模量均大于松质骨,具有固定和支持骨折部位椎体的作用13。但存在生物相容性差、无生物活性、聚合时产生高热、未聚合单体具有生物毒性等不足14-15。本组动物实验证实:PMMA 灌注8 周后,实验组(C)的动物髓核含水量和 GAG、型胶原和蛋白聚糖的表达均较实验组(B)以及对照组(A)明显下降(P0.01);同时,组织学观察发现,实验组(C)的髓核和纤维环结构较对照组(A)和实验组(B)发生了明显的退变,进一步影像学检查分析显示:对照组(A)和实验组(B)的灰度值明显低于实验组(C),且随着时间推移,实验组(C)的增长量明显高于对照组(A)和实验组(B),差异有统计学意义(P0.01),说明实验组(C)的椎间盘发生了退变,研究结果与相关文献报道16相似。考虑其原因:首先,PMMA 灌注后,单体聚合时强烈放热,将周围活组织细胞杀死,并且通过相邻椎体及椎板的直接传导,对纤维环组织及髓核中的液体产生热损害,直接导致间盘结构的退变;其次,PMMA 聚合时会产生热毒性,对周围组织产生持续的炎症反应,影响终板软骨细胞蛋白多糖的代谢,造成终板蛋白多糖含量和成分的流失,改变了终板软骨细胞的外基质,从而间接使相邻椎间盘发生退变;除此之外,骨水泥凝固改变了椎体间的应力环境,异常应力负荷的影响也会造成终板软骨损伤,损伤的软骨终板将阻碍椎间盘的营养需求17。过量的骨水泥凝固后,与椎体骨小梁弹性模量的差异常造成终板软骨的形态改变,对髓核产生较大压力,使其碎裂变形。并且,由于椎间盘受力传导不平衡和某些区域过度受力,进一步导致胶原纤维肿胀、扭转甚至断裂,使椎间盘提前发生退变。由此可见,椎间盘、软骨终板发生退变以及继发退变加速,可能与椎体成形术中的椎体加压填充过程存在密切关系。本动物实验结果初步印证了 PMMA 影响相邻椎间盘代谢的生物学机制。但不同于四肢负重动物,在人类直立时,脊柱负重因素影响的前提下,软骨终605颈腰痛杂志 2023 年第 44 卷第 4 期 The Journal of Cervicodynia and Lumbodynia 2023,Vol.44 No.4板承载的应力相对较高,加压注入骨水泥后,椎体内部应力负荷重新分布的结果可能会更明显地导致软骨终板损伤和椎间盘营养供给受阻。因此,根据本实验结果,临床采用该方法治疗椎体骨折的适应证应不包括椎间盘未见明显退变的患者,尤其是年龄较小的患者。为了适合临床工作需要,相关基础研究仍应关注于进一步改进 PMMA 性能或研发新的替代材料。参考文献:1 Zhu RS,Kan SL,Ning GZ,et al.Which is the best treatment ofosteoporotic vertebral compression fractures:Balloon kyphoplasty,percutaneous vertebroplasty,or non-surgical treatment?A bayesiannetwork meta-analysisJ.Osteoporos Int,2019,30(2):287-298.2 Hopkins TJ,Eggington S,Quinn M,et al.Cost-effectiveness ofballoon kyphoplasty and vertebroplasty versus conservative medicalmanagement in the USAJ.Osteoporos Int,2020,31(12):2461-2471.3 Wang J,Yang Y,Hu S,et al.Clinical effect comparison of closedreduction combined with vertebroplasty and kyphoplasty in the treat-ment of osteoporotic vertebral compression fractureJ.China ModMed,2019,26(22):83-85.4 Mauch JT,Carr CM,Cloft H,et al.Review of the imaging featuresof benign osteoporotic and malignant vertebral compression fracturesJ.AJNR Am J Neuroradiol,2018,39(9):1584-1592.5 方忠,杨琴,李锋,等.去势法兔骨质疏松模型建立的探讨J.中国骨质疏松杂志,2005,2:202-205.6 刘倩,张雪宁,王植,等.骨质疏松症影像评价新进展J.国际医学放射学杂志,2015,2:157-160.7 Masuda K,Aota Y,Muehleman C,et al.A novel rabbit model ofmild,reproducible disc degeneration by an anulus needle puncture:Correlation between the degree of disc injury and radiological andhistological appearances of disc degenerationJ.Spine,2005,30(1):5-14.8 张书丰,王弘,张涛,等.AKT/mTOR 信号通路在大鼠终板软骨细胞体外自然退变模型中的表达及意义J.中华医学杂志,2016,96(5):375-379.9 Chosa K,Naito A,Awai K.Newly developed compression fracturesafter percutaneous vertebroplasty:comparison with conservativetreatmentJ.Jpn J Radiol,2011,29(5):335-341.10 Yin S,Du H,Zhao W,et al.Inhibition of both endplate nutri-tional pathways results in intervertebral disc degeneration in a goatmodelJ.J Orthop Surg Res,2019,14(1):138.11 Li H,Yan J,Chen Y,et al.Non-invasive quantification of age-related changes in the vertebral endplate in rats using in vivo DCE-MRIJ.J Orthop Surg Res,2017,12(1):169.12 Arpinar VE,Rand SD,Klein AP,et al.Changes in perfusionand diffusion in the endplate regions of degenerating intervertebraldiscs:a DCE-MRI studyJ.Eur Spine J,2015,24(11):2458-2467.13 Haas SS,Brauer GM,Dickson G.A characterization of polymeth-ylmethacrylate bone cementJ.J Bone Joint Surg AM,1975,57(3):380-391.14 McMahon S,Hawdon G,Bar J,et al.In vivo response of bonedefects filled with PMMA in an ovine modelJ.Hip Int,2011,21(5):616-622.15 Kashirina A,Yao Y,Liu Y,et al.Biopolymers as bone substi-tutes:A reviewJ.Biomater Sci,2019,7(10):3961-3983.16 Qian J,Yang H,Jing J,et al.The early stage adjacent disc de-generation after percutaneous vertebroplasty and kyphoplasty in thetreatment of osteoporotic VCFs J.PLoS One,2012,7(10):e46323.17 白明,银和平,吴一民,等.骨水泥复合人工骨修复材料在经皮穿刺球囊扩张椎体后凸成形术中的应用J.中国矫形外科杂志,2016,24(22):2022-2026.705颈腰痛杂志 2023 年第 44 卷第 4 期 The Journal of Cervicodynia and Lumbodynia 2023,Vol.44 No.4