基于高通量测序分析玉米浸泡液细菌菌群结构及多样性.pdf
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1、为探究玉米浸泡液新酸、老酸在逆流浸泡过程中细菌群落的组成、微生物的多样性与淀粉提取浸泡工艺的联系,利用 Illumina MiSeq 高通量测序技术对玉米浸泡副产物中的新、老酸玉米浸泡液进行细菌 16S rRNA V3V4 测序,结果表明样品中新酸 2(L-2)、新酸 3(L-3)、新酸 4(L-4)、老酸 2(X-2)、老酸 3(X-3)、老酸 4(X-4)中有效序列分别为 42 102、41 679、39 779、39 922、39 800、38 896 条。在属的分类层次上,老酸中的优势细菌属包括乳酸杆菌属(Lactobacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、海洋芽孢杆菌属(O
2、ceanobacillus),新酸中的优势细菌属为乳酸杆菌属(Lactobacillus)。玉米浸泡液中的新酸老酸菌群结构和丰度有所不同,结果发现在玉米浸泡液中存在提升浸泡工艺的有益菌,也存在降低玉米淀粉质量的有害菌和腐败菌。关键词:玉米浸泡液新酸;玉米浸泡液老酸;高通量测序;细菌群落;微生物多样性Bacterial Community Structure and Diversity of Corn Soak Solution Based onHigh-throughput SequencingCHEN Li1,WANG Jingjing1,HE Mingjun1,LI Mingxuan1,L
3、IU Yang1,2*(1.School of Food Science and Engineering,Foshan University,Foshan 528225,Guangdong,China;2.Foshan Research Center for Quality Safety of the Whole Industry Chain of Agricultural Products,Foshan528000,Guangdong,China)粤遭泽贼则葬糟贼:To explore the relationship between the composition of bacterial
4、 community and the diversity ofmicroorganisms and the starch extraction and soaking process in the process of countercurrent soaking,this studyemployed Illumina MiSeq high-throughput sequencing technology to sequence the bacterial 16S rRNA V3-V4 inthe new and old acid corn soaking solutions in the b
5、y-products of corn soaking.The results showed that theeffective sequences of new acid 2(L-2),new acid 3(L-3),new acid 4(L-4),old acid 2(X-2),old acid3(X-3),andold acid 4(X-4)were 42 102,41 679,39 779,39 922,39 800,and 38 896,respectively.At thegenus level,the dominant bacterial genera in old acid in
6、cluded Lactobacillus,Bacillus and Oceanobacillus.Thedominant bacteria in the new acid was Lactobacillus.The structure and abundance of new acid and old acidbacteria in corn soaking solutions were different.It was found that there were beneficial bacteria that promoted thesoaking process in corn soak
7、ing solution,and there were also harmful bacteria and spoilage bacteria that reducedthe quality ofcornstarch.运藻赠 憎燥则凿泽:new acid in corn soaking solution;old acid in corn soaking solution;high-throughput sequencing;bacterial community;microbial diversity引文格式:陈丽,王敬敬,贺明君,等.基于高通量测序分析玉米浸泡液细菌菌群结构及多样性J.食品研
8、究与开发,2023,44(17):178-181,217.CHEN Li,WANG Jingjing,HE Mingjun,et al.Bacterial Community Structure and Diversity of Corn Soak Solution Based onHigh-throughputSequencingJ.Food Research and Development,2023,44(17):178-181,217.生物工程178食品研究与开发圆园23 年 9 月第 44 卷第 17 期玉米淀粉生产工艺包括湿法工艺和干法工艺,干法工艺中的脂肪和蛋白质含量高,但淀粉纯度
9、较低,所以大部分工厂普遍采用湿法工艺制备玉米淀粉1。湿法工艺又分为静止浸泡法和逆流浸泡法,静止浸泡法操作简单,但随着浸泡时间的延长,浸泡液中的渗透作用逐渐达到平衡,玉米粒中的可溶性物质不再析出,导致玉米淀粉提取率较低,所以此方法不适用于工厂。逆流浸泡法又称扩散法,由若干个浸泡罐、管道和泵组成,多个浸泡罐利用管道串联在一起,形成浸泡罐装置,通过装置的连接作用,使浸泡液沿着装玉米相反的方向流动2。逆流浸泡法可以使新鲜的玉米籽粒中所包含的可溶性物质与浸泡液溶液的浓度差始终保持在一个恒定的状态,充分提取玉米中的可溶性物质3,相比于静止浸泡法,逆流浸泡法能提高玉米淀粉的提取率。因此,逆流浸泡法被大多数工
10、厂采用4。玉米浸泡液是玉米粒在玉米淀粉生产过程中,通过湿法工艺得到的玉米加工副产物5。在浸泡过程中玉米浸泡液会产生大量微生物,特定的浸泡环境会使微生物大量繁殖,主要包括乳杆菌、短粗杆菌、芽孢杆菌、酵母菌等。其中乳酸菌在玉米淀粉提取阶段起主要作用,乳酸菌产生的乳酸,在浸泡过程中也起着重要的作用。玉米颗粒中的蛋白质,在维持浸泡过程中的 Ca 和 Mg 金属离子浓度的同时,还能促进乳酸引起的玉米粒的膨胀和转换,减少不溶性物质沉淀6。刘庆艾等7从玉米浸泡液筛选乳酸菌再加入到玉米浸泡液中,使得玉米淀粉提取率从 59.22%提高到63.23%,浸泡周期从传统的 20 h 减少为 10 h。丛泽峰等8的研究
11、表明人为添加乳酸菌到玉米浸泡液中,既会提高玉米浸泡液的质量,同时也会缩短浸泡周期。可见玉米浸泡液中的微生物多样性和菌群结构对于改善玉米淀粉提取工艺帮助较大。本研究利用 Illumina MiSeq 高通量测序技术对玉米浸泡副产物中的新、老酸玉米浸泡液进行细菌 16SrRNA V3V4 测序,获得玉米浸泡液新酸、老酸中细菌菌群结构的组成及微生物多样性,为玉米逆流浸泡阶段的研究和提取玉米淀粉工艺改进和优化提供参考。1材料与方法1.1材料与试剂随机采集市售的不同批次老酸玉米浸泡液和新酸玉米浸泡液,新酸的 SO2含量为 1 3001 500 mg/L,固形物少,老酸中 SO2含量为 80120 mg/
12、L,固形物多,浸泡温度均为 4952 益。X 代表老酸,L 代表新酸,每个样品取 3 个生物学重复,样品信息见表 1。E.Z.N.A.RSoil DNA Kit 试剂盒:美国 Omega Bio-tek 公司;琼脂糖:西班牙 biowest 公司;AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒:美国 Axygen 公司;建库试剂盒:美国Bioo Scientific 公司;MiSeq Reagent Kit 测序试剂盒:美国 Illumina 公司。1.2仪器与设备5430 R 小型离心机、5424R 高速台式冷冻离心机:德国 Eppendorf 公司;NanoDrop2000 超微量分光光度计:美国
13、Thermo Fisher Scientific 公司;DYY-6C 电泳仪:北京市六一仪器厂;BioTek ELx800 酶标仪:美国Biotek 公司;ABI GeneAmpR9700 型聚合酶链反应核酸扩增仪:美国 ABI 公司;Illumina Miseq 测序仪:美国Illumina 公司。1.3试验方法1.3.1样品前处理将玉米浸泡液灌装至 500 mL 无菌蓝盖瓶中,低温条件下运送至实验室,于-80 益冰箱保存,备用。1.3.2DNA 提取玉米浸泡液中微生物总 DNA 的提取按照 E.Z.N.A.RSoilDNAKit试剂盒操作指导书进行。吸取3滋L DNA利用超微量分光光度计测
14、定样品 OD 值,计算DNA纯度,以电泳仪检测核酸样本的完整性,将检测合格的 DNA 提取物置于-20 益备用。1.3.3聚合酶链反应核酸扩增参考邓高文等9的方法进行样品细菌 16S rRNA聚合酶链式反应扩增及高通量测序 Illumina MiSeq,使用 338F(5-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3)和 806R(5-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3)通用引物进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增。将 PCR 产物合格的样品送至上海美吉生物技术有限公司进行高通量测序。1.4数据分析采用 Illumina Miseq 的
15、Miseq PE300 平台测序,将测序得到的序列进行拼接和过滤,按照 97%的相似度进行操作分类,使用 OTU 分类单位(operational taxo原nomic units,OTU)10。表 1样品名称及分组信息Table 1Sample names and group assignment名称发酵罐样品编号玉米浸泡液新酸2 号L-2玉米浸泡液新酸3 号L-3玉米浸泡液新酸4 号L-4玉米浸泡液老酸5 号X-2玉米浸泡液老酸6 号X-3玉米浸泡液老酸7 号X-4生物工程179食品研究与开发圆园23 年 9 月第 44 卷第 17 期图 1基于门水平玉米浸泡液的细菌群落结构Fig.1Ba
16、cterial community structure in corn soaking solution atthe phylum level2结果与分析2.1玉米浸泡液菌群 琢 多样性分析玉米浸泡液细菌 琢 多样性指数测定结果见表 2。由表 2 可知,在不同的玉米浸泡液样本中进行测序,得到的有效序列 242 178 条,其中覆盖率均达到了0.99,试验数据表明覆盖率高,测序深度可靠,所测序结果能够真实反映玉米浸泡液中新酸、老酸样品的细菌群落组成。琢 多样性通常用以下指数来评估11,一是样品物种的丰度(包括 Chao 指数和 ACE 指数),二是物种的多样性(包括 Shannon 指数和 Si
17、mpson 指数),老酸中的 Chao 指数比新酸更高,可能是因为随着浸泡时间的延长,浸泡液中的 pH 值不断升高,浸泡环境呈酸性,导致不耐受酸性的细菌逐渐消失,所以新酸样品中细菌的群落丰度和多样性降低。另外 Shannon 指数和 Simpson 指数反映了样本物种的多样性,Shannon 指数逐渐增大,代表样本指数多样性越高。由测序结果可见,玉米浸泡液老酸中的Shannon 指数高于新酸,可见玉米浸泡液样品老酸中的菌群多样性大于新酸。2.2菌群结构分析2.2.1基于门水平玉米浸泡液中群落结构分析在门水平上,图 1 显示了根据丰度水平排名前 10的物种,其他物种均被合并为其他。从图 1 可以
18、看出,优势菌门有厚壁菌门(Firmi原cutes)、放线菌门(Actinobacteriota)、变形菌门(Pro原teobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidota)。在样品中均检测出厚壁菌门(Firmicutes),相对丰度均大于 50%,表明在玉米浸泡液的浸泡过程中,厚壁菌门占主导地位,这也是因为厚壁菌门的部分厌氧菌可以在低氧、酸性和高酒精的环境中可以生存12,其中属于厚壁菌门中的乳酸菌也可以在低氧、低酸的环境下生长,由此可见,厚壁菌门在玉米浸泡的第一阶段起着重要作用。2.2.2基于目水平玉米浸泡液中群落结构分析基于目水平玉米浸泡液的细菌群落结构见图 2。如图 2 所示,在目水
19、平上,根据物种注释结果,采用最大值排序法,选取在目水平最大丰度排名前 10 的物种,老酸中有乳酸杆菌目(Lactobacillales)、芽孢杆菌目(Bacillales)、棒状杆菌目(Corynebacteriales)、伯克霍尔德菌目(Burkholderiales)、类芽孢杆菌目(Paenibacil原lales)、梭菌目(Clostridiales)等,新酸中主要以乳酸杆菌目(Lactobacillales)为主。可见在玉米逆流浸泡的过程,新酸、老酸中主要以乳酸杆菌目为主。研究表明,在逆流浸泡阶段,乳酸菌占主导地位,乳酸菌在生产过程中产乳酸,乳酸可以破坏玉米籽粒中的蛋白质结构,使得可溶
20、性物质析出,从而提高玉米淀粉的产率13。在浸泡过程中,乳酸杆菌目这类菌种与亚硫酸共同作用,能改善浸泡周期过长的缺点,促进淀粉与蛋白质分离,提高玉米淀粉产量。此外,也有研究证明,破坏蛋白质与淀粉颗粒的结合,从而使蛋白能更好地溶出14。2.2.3基于属水平玉米浸泡液中群落结构分析基于属水平玉米浸泡液的细菌群落结构见图 3。从图 3 可以看出,老酸样品中相对丰度最高的属为乳酸杆菌属(Lactobacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)。新酸中主要测到了乳酸杆菌属(Lactobacillus),可见玉米浸泡液主要优势菌为乳酸杆菌属。乳酸菌在玉米浸
21、泡过程中发挥着重要作用,乳酸菌大多是厌氧菌或是部分厌氧的细菌15,表 2玉米浸泡液细菌 琢 多样性指数测定结果Table 2Bacterial 琢-diversity indexes in corn soaking solution1.00.80.60.40.20L-2L-3X-4L-4X-3X-2其他PatcscibacteriaCampilobacterotaAcidobacteriotaCyanobacteriaChloroflexiDcinococcotaBacteroiditaProteobacteriaActinobacteriotaFirmicutes1.00.80.60.40.
22、20L-2L-3X-4L-4X-3X-2其他ErysipelotrichalesPeptostreptococcales-TissierellalesPaenibacillalesLachnospiralesBacteroidalesClostridialesBurkholderialesCorynebacterialesBacillalesLactobacillales图 2基于目水平玉米浸泡液的细菌群落结构Fig.2Bacterial community structure in corn soaking solution atthe order level生物工程样品有效序列/条OTU数
23、/个ACE指数Chao指数Shannon指数Simpson指数覆盖率X-242 102386446.33367.131.240.980.99X-341 679888395.95377.641.870.990.99X-439 779346290.44269.441.350.990.99L-239 9224869.3560.000.050.560.99L-339 8001729.0726.000.010.260.99L-438 8963381.5154.330.020.480.99180食品研究与开发圆园23 年 9 月第 44 卷第 17 期在浸泡期间可以在厌氧条件下生长和繁殖,它在发酵过程中具
24、有重要的生物结构调节功能16,随着玉米浸泡发酵期延长,在发酵体系中乙醇的浓度和酸度不断地上升,含氧量逐渐下降,几乎所有无法承受高酸度、高乙醇浓度和厌氧条件的微生物均逐渐减少,乳酸菌成为绝对优势菌。优势乳酸菌从糖类中产生乳酸和乙酸,造成浸泡液中的 pH 值升高,高浓度的酸性环境会抑制其他细菌的生长繁殖,同时,乳酸菌可以产生细菌素等拮抗物质,通过与其他微生物竞争底物来影响其他微生物的生长17-19,乳酸菌还能降解其中的蛋白质,使浸泡液中的不可溶性物质转变为可溶物质,更利于后续的清洗工作20。因此,乳酸菌在浸泡过程中占有绝对优势。3结论本试验利用 Illumina MiSeq 高通量测序技术对玉米淀
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