高级动物生物化学蛋白质的分离纯化.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,一、分离纯化的意义,从生物材料中分离制备蛋白质，研究其结构与功能，对于了解生命活动的规律，阐明生命现象的本质有重大意义。,工业生产的需要：食品、发酵、纺织、制革等工业，需要大量的高活性的酶制剂。如用淀粉酶制造葡萄糖、麦芽糖、糊精以及糖浆等。,医疗的需要：如用猪胰岛素治疗糖尿病。,基因工程的需要,二、分离纯化的要求,1,、纯度：主要取决于研究的目的和应用上的要求。如作为研究蛋白和一级结构、空间结构，一级结构与功能的关系的蛋白质制剂、工具酶和标准蛋白、酶法分析的酶制剂，都要求均一；工业、医药方面应用的酶和蛋白质制剂，达到一定纯度即可，不要求均一。,2,、活性：要求大分子保持天然构象状态，有高度的生物活性。,3,、收率：希望收率越高越好，但在分离纯化过程中总有不少损失。而且提纯步骤越多，损失越大。,三、分离纯化的一般程序,蛋白质分子的分离纯化一般可分为以下几个阶段：,材料的选择和预处理,破碎细胞及提取（有时还需要进行细胞器的分离）,分离纯化：包括粗分级分离和细分级分离,其中前两个阶段为分离纯化的前处理。,第二节 蛋白质分离纯化的前处理,一、材料的选择与预处理,选择材料主要根据实验目的而定。工业生产上注意选择含量高、来源丰富、易获得、制备工艺简单、成本低的动植物组织或微生物做原料。科研选材则无需考虑上述问题，只要能达到实验目的即可。,实验材料选定后，常常需要进行预处理，如动物材料需要除去一些与实验无关的结缔组织、脂肪组织；植物种子需要除壳；微生物需要将菌体与发酵液分开。另外，必须尽可能保持材料的新鲜，尽快加工处理。若不立即进行实验或加工，应冷冻保存。,二、细胞的破碎,分离提取某一生物大分子，首先要求生物大分子从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态，不丢生物活性。因此应选择适当的方法将组织和细胞破碎。但若材料是体液（如血）或生物体分泌到体外的分泌物，则不必进行组织细胞的破碎。,组织细胞的破碎方法很多，不同的实验规模，不同的实验材料和实验要求，使用的破碎方法和条件也不同,。,一般动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆器破碎或用超声波处理破碎。,植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁，一般常用与石英砂和适当的提取液一起研磨的方法破碎或用纤维素酶处理也能达到目的。,细菌细胞的破碎比较困难，因为整个细菌细胞壁的骨架实际上是一借共价键连接而成的肽聚糖囊状大分子，非常坚韧。破碎的方法常有超声波震荡、与石英砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理（以分解肽聚糖）。,三、细胞器的分离,细胞器包括细胞核、线粒体、核糖体、内质网，植物细胞还有叶绿体。,如果要分离制备分布在这些细胞器中的生物大分子，为了防止其他细胞组分中的物质对制备物的干扰或污染，还需先将细胞器分离出来，然后在某一细胞器中分离某一物质。,细胞器的分离一般采用,差速离心法,，即将破碎后的细胞在适当的介质中进行离心，常用的介质有蔗糖、甘露醇、柠檬酸、聚乙二醇等。各种细胞组分按质量大小的不同，经过不同速度的离心后，沉降于离心管的不同部位，经多次分步离心后，即可获得所需组分。,四、提取,组织细胞破碎过程中，大量的胞内酶及细胞内含物被释放出来，必须立即将其置于一定条件下和溶剂中，让制备物充分溶解，并尽可能保持原来的天然状态，避免因长久放置造成制备物的分解破坏，这就是,提取,。,1,、蛋白质的提取,大多数蛋白质均能溶于水、稀盐、稀碱或稀酸溶液中，故蛋白质的提取一般以水溶液提取为主。通常采用类似生理条件下的缓冲液，如,20-50m mol/L,的磷酸盐缓冲液（,pH7.0-7.5,）或,0.1mol/L Tris-HCl,（,pH7.5-8.0,）缓冲液作提取液。,对于一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性较多的蛋白质，不溶于水、稀盐、稀碱、稀酸，常在提取液中加入适量的有机溶剂，如乙醇、丙酮、异丙醇、正丁醇等。,第三节 分离纯化,从细胞中提取得到的蛋白质往往是不纯的，含有大量杂质，必须进一步分离纯化，这一阶段可分为,粗分级分离和细分级分离,两步进行。,一、蛋白质的分离纯化,蛋白质分离纯化的方法很多，主要是根据蛋白分子之间特异性的差异，如分子大小，溶解度，电荷等建立起来的。,性质 方法,分子大小 透析、超滤、密度梯度离心、凝胶过滤,溶解度 等电点沉淀、盐析、有机溶剂沉淀,电荷 电泳、离子交换层析,吸附性质 吸附层析（羟基磷灰石层析、疏水作用层析）,对配体分子 亲和层析,的生物亲和力,主要是利用盐析法、等电点沉淀、有机溶剂沉淀等方法，使目的蛋白与其它较大量的杂蛋白分开，这些方法的特点是简便、处理量大、既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质，但分辨率低。,1、粗分级分离,（,1,）盐析,向蛋白质溶液中加入大量的中性盐,（,NH,4,),2,SO,4,，,Na,2,SO,4,，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀，这种现象称为盐析。,盐析作用是由于当盐浓度较高时，盐离子与水分子作用，使水的活度降低，原来溶液中大部分的自由水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质极性基团与水分子之间的作用，破坏蛋白质分子表面的水化层，使蛋白聚集沉淀。同时盐离子可以中和蛋白质的表面电荷，也促进蛋白的沉淀,。,不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极性基团的种类、数目以及排布的不同，其水化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不一样，因此调节蛋白质的中盐浓度，可以使不同的蛋白质分别沉淀。如：,血清,球蛋白,清蛋白,(,NH,4,),2,SO,4,50%饱和度,100%,饱和,析出,析出,分段盐析,（,2,）等电点沉淀,蛋白质是两性电解质，其溶解度与其净电荷数量有关，随溶液,pH,变化而变化。在溶液,pH,值等于蛋白质等电点时，蛋白质的溶解度最小。,不同的蛋白质有不同的等电点，因此通过调节溶液,pH,到目的蛋白的等电点，可使之沉淀而与其它蛋白质分开，从而除去大量杂蛋白。,（,3,）有机溶剂法,与水互溶的极性有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮等能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。,有机溶剂引起蛋白质变性的原因有两个：,降低水的,介电常数,，使蛋白质分子表面可解离基团的离子化程度减弱，水化程度降低，促进了蛋白质分子的聚集沉淀。,是极性有机溶剂与蛋白质争夺水化水，而使蛋白质分子沉淀。,室温下，这些有机溶剂不仅能使蛋白质沉淀，而且伴随着变性。若预先将有机溶剂冷却，然后在不断搅拌下将其逐渐加入蛋白质溶液中，防止有机溶剂局部浓度过高，则在很大程度上解决变性问题。,不同的蛋白质由于水化层厚度不同，发生沉淀需要的有机溶剂浓度不同，因此可利用不同浓度的有机溶剂分离不同的蛋白质。,2,、细分级分离,一般蛋白质样品经粗制分级后，体积较小，杂质大部分被除去。进一步提纯，通常使用高分辨率的,柱层析及电泳,方法。,常用的柱层析方法有分子筛层析、离子交换层析、疏水吸附层析、亲和层析。,常用的电泳方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳。,另外，结晶也是蛋白质分离纯化的方法之一，制备的结晶物常常作为蛋白质结构分析之用。,酶的活力测定,在酶的制备过程中，每一步骤都应测定留用以及准备弃去部分中所含酶的总活力和比活力，以了解经过某一步骤后酶的回收率、纯化倍数，从而决定这一步的取舍。,总活力,=,活力单位,/ml,酶液,总体积（,ml,）,比活力,=,总活力单位数,/,总蛋白（氮）,mg,纯化倍数,=,每次比活力,/,第一次比活力,回收率（产率）,=,（每次总活力,/,第一次总活力）,100%,第三节 纯度鉴定,生物大分子经过分离提纯，最后还要鉴定制品的纯度。,蛋白质和酶制品纯度鉴定通常采用的方法有：,SDS-,聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法、超速离心沉降分析法、免疫化学法、,N-,末端氨基酸分析法等。,纯的蛋白质在一定条件下进行电泳，将以单一的速度移动，它的电泳图谱只出现一条带。同样纯的蛋白质在离心场中，应以单一的沉降速度移动。,选用任何单独一种鉴定方法都不能最后确定蛋白质的纯度，必须同时采用,2-3,种不同的方法才能确定。,第四节 蛋白质的层析分离,应用广泛。特征：有一个固定相和一个流动相。由于待分离的各种物质在这两个相分配系数不同，当两个相作相对运动时，这些物质在两相间反复多次分配，结果使其相互分开。,根据两相的状态，层析法可分为：气相层析和液相层析；按层析原理可分为：吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析等。按操作形式分为：柱层析、薄层层析、纸层析等。,分配系数,:k=C,s,/C,m,物质在固定相与流动相浓度之比。质量分配系数：,D=k,V,s,/V,m,V,s,V,m,为固定相和流动相的体积。,一、层析的一般原理,32,16,16,8,8,16,8,12,4,12,4,12,2,2,8,如果柱顶加入,32mg,样品，样品的质量分配系数,D,为,1,，即样品在两相中是等量分配。经过,5,层的平衡分配后，样品在柱的分配情况见图。样品集中在中间。如果,D1,，样品集中在中间偏下。,离子交换层析,(,IEX),是根据电荷来分离分子的。,离子交换剂是通过化学反应将解离基团引入到惰性支持物上形成的。分为：,阳离子交换剂:解离基团带负电,结合阳离子;,阴离子交换剂:解离基团带正电,结合阴离。,蛋白质分子是两性物质。当,pHpI,，,分子带负电，可结合阴离子交换剂；当,pHpI,，分子带正电，可结合阳离子交换剂。如阳离子交换剂与带正电蛋白质分子之间有如下平衡：,二、离子交换层析,（一）基本原理,带电蛋白质分子与交换剂的结合是可逆的。由于,pH,可改变蛋白质的带电性质和带电量，盐离子会影响蛋白质在交换剂上吸附。所以用,一定浓度的盐溶液或一定,pH,的缓冲液,就可把蛋白质,从离子交换剂上,洗脱下来。对多组分混合物，每种分子所带的电荷不同，因此，可用不同的离子强度 或不同的,pH,溶液将蛋白质从交换剂上一一,洗脱下来。,（二）离子交换剂的基本类型,根据可供交换的离子的性质，离子交换剂可被分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。若按酸碱性的强弱，又可分为强酸、强碱、弱酸、弱碱几种类型的离子交换剂。,强酸和强碱型交换剂能在较广泛的,pH,范围内（,pH2,12,）,完全解离。弱酸型交换剂在低于,pH4,、弱碱型交换剂在高于,pH9,就难于解离，因而失去交换能力。因为一般蛋白质在,pH6,8,之间稳定，所以常用弱酸或弱碱型交换剂。,离子交换基团的结构和性质,类型,名称,结构式,性质,DEAE,二乙基氨基乙基,(,diethylaminoethyl),-,O-CH,2,-CH,2,-N,+,-(C,2,H,5,),2,弱碱性,QAE,季胺乙基,(,quaternary aminoethyl),-,O-CH,2,-CH,2,-N,+,-(C,2,H,5,),3,强碱性,Q,季胺,(,quaternary amine),-,CH,2,-N,+,-(CH,3,),3,强碱性,CM,羧甲基,(,carboxymehyl),-,O-CH,2,-COO,-,弱酸性,SE,磺乙基,(,sulfoethyl),-,O-CH,2,CH,2,-SO,3,-,强酸性,SP,磺丙基,(,sulfopropyl),-,O-CH,2,-CH,2,-CH,2,-,SO,3,-,强酸性,P,磷酸基,(,phosphate),-,O-PO,3,-,中酸性,S,磺酸基,(,sulfonate),-,CH,2,-SO,3,-,强酸性,可用来作为交换剂支持物的物质种类较多。早期用于分离氨基酸、小肽和其它小分子物质的离子交换树脂的支持物是,聚苯乙烯类,。,分离蛋白质的常用的亲水性支持物。有三大类：纤维素、葡聚糖凝胶,(,sephadex),、,琼脂糖凝胶,(,sepharose),和合成凝胶,(,Trisacryl,和,Fractogel),。,1,、离子交换纤维素,离子交换纤维素是以纤维素做支持介质的。具有松散的亲水性网络，较大的表面积，吸附容量大，通透性好。根据离子交换纤维素所含离子交换基团的性质可分为强酸、强碱型和弱酸、弱碱型。现将常用的离子交换纤维素列于下表中。,常用的离子交换纤维素,离子类型,解 离 基 团,特 点,DEAE-,O,CH2,CH2,N,+,(C,2,H,5,),在,pH8.6,应用,阴离子,解离基团,交换摩尔,(,m mol/g),特点,DEAE,O,CH,2,CH,2,N(C,2,H,5,),0.1,1.1,在,pH4,应用,P,O,PO,3,H,2,0.7,7.4,酸性较强,SE,O,CH,2,CH,2,SO,3,H,0.2,0.3,强酸性,在,Sephadex,上接上某种离子交换基团。这种凝胶既有离子交换剂的性质，又有分子筛效应。因此，其分离能力比单纯的层析凝胶或离子交换剂好。葡聚糖凝胶离子交换剂的交换量比相应的纤维素离子交换剂大，如,DEAE,Sephadex,的交换量大约是,DEAE,纤维素的,3.5,5.0,倍。,2、离子交换葡聚糖凝胶（,Sephadex,）,葡聚糖凝胶离子交换剂的性质,类别,离子交换基团,床体积,ml/g,分离范围,(Mr),交换量,总交换容量,(m mol/g),强阳离子交换剂,SE,Sephadex,C,25,C,50,-,CH,2,CH,2,SO,3,H,5,9,32,38,3,10,4,-2,10,5,3,10,4,-2,10,5,2.0,2-5,2.0,2-5,SP,Sephadex,C,25,C,50,-CH,2,CH,2,CH,2,SO,3,H,2.3,0.3,弱阳离子交换剂,CM,Sephadex,C,25,C,50,-,O-CH,2,COOH,6,10,32,40,3,10,4,-2,10,5,3,10,4,-2,10,5,4.5,0.5,强阴离子交换剂,QAE,Sephadex,A,25,A,50,5,8,30,40,3,10,4,-2,10,5,3,10,4,-2,10,5,3.0,4.0,弱阴离子交换剂,DEAE,Sephadex,A,25,A,50,-,C,2,H,4,N,+,(C,2,H,5,),2,H,5,9,25,83,3,10,4,-2,10,5,3,10,4,-2,10,5,3.5,4.5,类别,离子交换基团,床体积,ml/g,分离范围,(Mr),交换量,总交换容量,(m mol/g),-,O-C,2,H,4,N,+,(C,2,H,5,),2,将各种离子基团引入到交联琼脂糖,(Speharose CL),和大孔合成凝胶,(Trisacryl,或,Fractogel),上，则形成一系列离子交换剂。这类交换剂即坚硬、吸附容量大，形状球形，能维持较好的流速及分辨率。,3,、交联凝胶离子交换剂,（三）层析条件的选择,1,、离子交换剂的选择,选择离子交换剂之前要了解样品的性质：热稳定性、带电情况、,pH,和盐浓度对其活性和溶解度的影响。一般情况下，带负电的物质用阴离子交换剂，反之，则用阳离子交换剂。实验室中最广泛使用的是,DEAE,和,CM,交换剂。,2、交换颗粒大小的选择,粒子大小主要影响分辨率和流速。粗粒子：交换容量小、间隙大、分辨率底、流速较快。细粒子：分辨力高、交换容量大但是流速慢。,3、层析缓冲液的选择,选择正确的缓冲液可获得较好的层析效果。因为离子相互作用取决于,pH,，而维持介质的,pH,，通常是由缓冲液来实现的。所用缓冲液的种类、,pH,大小，决定 待分离组分的稳定性和溶解度。,为避免缓冲液的离子参与离子交换过程，采用缓冲液所带的电荷应与离子交换剂所带电荷相同。使用阳离子交换剂时，要用阴离子型缓冲液（磷酸、醋酸等）；使用阴离子交换剂时要用阳离子型缓冲液（,Tris,、胺盐、吡啶等）。,要得到好的分离效果，层析时要注意层析柱的高度和体积；上样量的大小；洗脱液体积；洗脱速度；分级物的收集量。,1,、柱床体积：至少要比结合所有样品所需要的要大,2,5,倍。离子交换层析所用的柱不用太长，以便缩短操作时间。,2,、样品,pH,和离子强度：与起始缓冲液具有相同的,pH,和离子强度。,3,、洗脱液体积和洗脱梯度的形状：对柱的分辨率影响很大。洗脱可用恒定组成的缓冲液来完成（简单洗脱）也可用改变,pH,或盐浓度，或二者均改变的洗脱液来完成。,pH,和盐浓度的改变又分为连续改变（梯度洗脱）和不连续改变（阶段洗脱）,。,（四）柱层析技术,交换剂的处理就是将交换剂转变为适合分离目的的离子类型。一般包括除杂质、溶胀，除细粒和改型。改型就是用适当的离子平衡，使交换剂带上希望的离子。阳离子和阴离子交换剂最后分别为,Na,和,Cl,型是最稳定形式。,4,、洗脱速度：太快或太慢都会降低柱的分辨率。,5,、分级物收集量：关系到能否充分代表层析柱的分辨率。一般总洗脱体积在,500,2000ml,时，每管收集,5,10ml,（五）离子交换剂的处理和再生,离子交换剂价格较贵，用后再经过再生处理，可反复多次使用。处理时避免用强酸或强碱长时间浸泡，以防载体的糖链结构遭水解破坏。,剂型,处理用的酸或碱浓度,浸泡时间,纤维素,Sephadex,Sepharose,合成凝胶,0.5,M HCl,或,NaOH,(,含,0.5M NaCl),0.1M HCl,或,NaOH,(,含,1M NaCl),1M NaAc(pH3.0),或,0.1M NaOH,(,含,1M NaCl),0.51.0M HCl,或,NaOH,(,含,1M NaCl),3,4h,0.5h,可在柱中再生,长时间浸泡无影响,各类离子交换剂的再生条件,血清蛋白常用离子交换层析分离。,IgG,可用,QAE,Sephadex A,50,或,DEAE,Sephadex A,50,分离。现在临床上有重要用途的许多血清蛋白，如白蛋白，,factor IX,复合物和专一性免疫球蛋白已用离子交换层析大规模生产。,（六）离子交换层系的应用实例,凝胶层析又称凝胶渗透层析、排阻层析，分子筛层析等。它主要用于分离分子大小不同的生物大分子及测定其分子量。凝胶层析设备简单，操作简便，每次层析后无需再生处理，因此，在生化研究中应用及其广泛。,三、凝胶过滤层析,凝胶层析载体是多孔凝胶。当溶质通过层析柱时，溶质分子不仅是向下运动，而且还在做无定向扩散运动。分子直径比凝胶孔径大的分子，不能进入凝胶颗粒的微孔里，只能经过凝胶颗粒之间的孔隙。这样的分子是随溶剂一起移动的，因而最先流出柱外；而分子直径比凝胶孔径小的分子，则能够自由进入凝胶颗粒的微孔之中，即进入凝胶相内。小分子向下移动的速度必然要落后于大分子。凝胶颗粒是固定相，洗脱液是流动相。,(,一,),基本原理,溶质分子在柱上移动的速度（即被凝胶颗粒阻滞的程度）决定于该分子在两相间的分配常数,K,d,。,K,d,由下式计算：,K,d,=(V,e,-V,o,)/V,p,式中,V,e,为某种物质从柱内完全洗脱出来时洗脱液的体积；,V,o,为胶粒之间空隙的总容积，也称外水体积；,V,p,为胶粒内部孔隙的总容积，称内水体积。若分子大，完全不能进入胶粒微孔，则最先流出柱，此时,K,d,=0,；若分子小，能完全进入胶粒微孔，则最 后流出柱，此时,Kd=1,对中等大小的分子，只能部分进入胶粒微孔，所以,K,d,值在,0,1,之间。不同溶质是按,K,d,由小到大的顺序流出柱。,凝胶过滤法的分辨率是凝胶层析中的另一个重要的特征性常数。从数学概念上考虑，分离分辨率可以表示为：,V1,、,V,2,是两种物质的洗脱体积，可以从加样品开始到洗脱峰的最高点为止的洗脱体积计算。,W,1,、,W,2,分别为两个物质的洗脱峰的宽度，可以由通过峰边拐点的两条切线与基线交点间的距离来计算。两个物质要完全分离，,必须大于或等于,1,。影响分辨率的因素很多，如凝胶粒度、上样量、流速、温度、,凝胶类型及层析柱的形状等。,=,2,（,V,2,-V,1,),W,1,+W,2,