黄精多糖理化性质及其对D-半乳糖诱导小鼠氧化损伤的保护作用.pdf

刘旺，白金波，张王娟，等.黄精多糖理化性质及其对 D-半乳糖诱导小鼠氧化损伤的保护作用 J.食品工业科技，2023，44（18）：425433.doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022100250LIU Wang,BAI Jinbo,ZHANG Wangjuan,et al.Study on the Physicochemical Properties of Polysaccharide from Polygonatumsibiricum and Its Protective Effect on D-Galactose-Induced Oxidative Damage in MiceJ.Science and Technology of Food Industry,2023,44(18):425433.(in Chinese with English abstract).doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022100250 营养与保健 黄精多糖理化性质及其黄精多糖理化性质及其对对 D-半乳糖诱导小鼠半乳糖诱导小鼠氧化损伤的保护作用氧化损伤的保护作用刘旺1,2,3，白金波1,2,3，张王娟1,2,3，刘春阳1,2,3，李木子1，张金和1，徐国兵4，解松子1,2,3,*（1.安徽中医药大学药学院，安徽合肥 230012；2.中药研究与开发安徽省重点实验室，安徽合肥 230012；3.中药饮片制造新技术安徽重点实验室，安徽合肥 230012；4.安徽省食品药品检验研究院，安徽合肥 230012）摘要：本研究从黄精根茎部位提取、分离纯化一种均一多糖组分，分析其理化性质和对氧化损伤的保护作用，并探讨其潜在的保护机制。采用水提醇沉、DEAE-纤维素阴离子交换柱与 Sephadex G-100 凝胶层析柱从黄精根茎提取、分离得到均一多糖组分 PSP。采用苯酚硫酸法、间羟基联苯法、高效凝胶渗透色谱和傅里叶红外光谱等分析PSP 的理化性质，并通过 D-半乳糖诱导氧化损伤小鼠模型探究 PSP 的体内抗氧化作用。结果表明，PSP 的碳水化合物含量为 94.42%14.73%，其分子量为 5566.41 Da，含有 型的呋喃环或吡喃环果糖，以及较长的支链和较多的分支。与模型组相比，PSP 高剂量组血清、脑组织、肝脏组织的SOD、GSH-Px 与T-AOC 水平显著升高（P0.05），MDA 水平显著降低（P0.05）；HE 染色发现 PSP 处理组的肝脏损伤明显得到改善，且肝脏中 Nrf2 和 HO-1 的表达显著增强（P0.05）。因此，结果表明黄精多糖 PSP 可能通过 Nrf2/HO-1 信号通路保护小鼠的氧化损伤。关键词：黄精，多糖，分离纯化，D-半乳糖，氧化损伤本文网刊:中图分类号：R963 文献标识码：A 文章编号：10020306（2023）18042509DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2022100250StudyonthePhysicochemicalPropertiesofPolysaccharidefromPolygonatumsibiricumandItsProtectiveEffectonD-Galactose-InducedOxidativeDamageinMiceLIUWang1,2,3，BAIJinbo1,2,3，ZHANGWangjuan1,2,3，LIUChunyang1,2,3，LIMuzi1，ZHANGJinhe1，XUGuobing4，XIESongzi1,2,3,*（1.College of Medicine,Anhui University of Traditional Chinese Medicine,Hefei 230012,China；2.Anhui Province Key Laboratory of Research&Development of Chinese Medicine,Hefei 230012,China；3.Anhui Province Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Decoction Pieces ofNew Manufacturing Technology,Hefei 230012,China；4.Anhui Institute of Food and Drug Inspection,Hefei 230012,China）Abstract：In this study,a homogeneous polysaccharide fraction was extracted and purified from the rhizome ofPolygonatum sibiricum,its physicochemical properties and protective effect against oxidative damage were analyzed,andits potential protective mechanism was initially explored.The homogeneous polysaccharide(PSP)was obtained by water 收稿日期：20221025 基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目（32001694）；安徽省自然科学基金青年项目（2008085QH393）；校级科学研究重点项目（2020zrzd14）；高层次人才支持计划项目（2019rczd002）。作者简介：刘旺（1996），男，硕士研究生，研究方向：中药活性多糖研究，E-mail：。*通信作者：解松子（1993），女，博士，副教授，研究方向：食源性多糖结构与功能，E-mail：xiesz_。第 44 卷 第 18 期食品工业科技Vol.44 No.182023 年 9 月Science and Technology of Food IndustrySep.2023 extraction,alcohol precipitation,and separation on DEAE-52 cellulose and Sephadex G-100 columns.The phenol sulfatemethod,m-hydroxybiphenyl method,high performance gel permeation chromatography and Fourier infrared spectroscopywere used to analyze the physicochemical properties of PSP.The in vivo antioxidant effects of PSP were investigated in amouse model of D-galactose induced oxidative damage.The results showed that the carbohydrate content of PSP was94.42%14.73%and its molecular weight was 5566.41 Da.PSP was also found to contain-type furan or pyran fructose,aswell as longer branched chains with more branches.Compared with the model group,the levels of SOD,GSH-Px and T-AOC significantly increased(P0.05),and MDA levels significantly decreased(P0.05)in serum,brain tissue and livertissue of the PSP high dose groups,HE staining revealed that liver damage was significantly ameliorated and the expressionof Nrf2 and HO-1 protein in the liver was significantly enhanced in the PSP-treated group(P0.05).It could be concludedthat PSP had a protective effect on oxidative damage in mice,and its protective mechanism might be related to theNrf2/HO-1 signaling pathway.Keywords：Polygonatum sibiricum；polysaccharide；isolation and purification；D-galactose；oxidative damage 神农本草经记载“黄精，味甘、平、无毒，主补中益气，除风湿，安五脏，久服轻身，延年不饥”1。中国药典2020 版收藏了滇黄精（Polygonatum kingianumColl.et Hemsl.）、黄精（Polygonatum sibiricum Red.）或多花黄精（Polygonatum cyrtonema Hua）3 种原生药，按形状不同，习称“大黄精”、“鸡头黄精”、“姜形黄精”2。黄精为百合科黄精属植物 Polygonatumsibiricum Red.的干燥根茎，属于药食兼用的中药材。现代药理学研究证明，黄精具有降血压、降血糖、抗氧化、抗菌和抗炎等功效3。黄精主要含有多糖、皂苷、多酚、黄酮、木质素、氨基酸、微量元素和挥发油等生物活性物质4，多糖作为黄精的主要化学成分，具有抗癌5、抗肿瘤6、免疫调节7、预防抑郁8和阿尔兹海默症9等作用。已有研究表明，黄精多糖具有较好的抗氧化活性，如体外清除 DPPH 自由基、超氧阴离子自由基、羟基自由基等活性10；体内研究发现黄精多糖能显著提高经训练所致疲劳大鼠或炎症性肠病小鼠血清中超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）的含量，并减少丙二醛（Malondialdehyde,MDA）的产生11。另外，黄精酒制前后的水溶性多糖可以改善氧化损伤细胞内总超氧化物歧化酶（Total-SOD）和谷胱甘肽酶（Glutathione peroxidase,GSH-Px）活性，抑制 MDA和活性氧（Reactive oxygen species,ROS）的升高，从而发挥抗氧化损伤作用12。目前，黄精多糖的抗氧化活性研究大多集中于黄精粗多糖，而对于黄精中均一多糖组分的抗氧化研究较为缺乏。本研究采用传统的水提醇沉法提取得到黄精的粗多糖，后经 DEAE-纤维素阴离子交换柱与 SephadexG-100 凝胶层析柱分离纯化得到均一多糖组分PSP。通过建立 D-半乳糖诱导的氧化损伤小鼠模型分析黄精多糖 PSP 对氧化损伤的保护作用，并对其潜在的保护机制进行初步探究，以期为黄精抗氧化作用机制的深入研究和天然抗氧化剂的开发奠定理论基础。1材料与方法 1.1材料与仪器SPF 级昆明种雄性小鼠 8 周龄 70 只（202 g）饲养于安徽中医药大学实验动物中心 动物许可证号：SCXK（豫）2019-0002，动物实验由安徽中医药大学实验动物伦理委员会审议通过，审批编号AHUCM-mouse-2021128；黄精（鸡头黄精）陕西秦岭山；D-半乳糖上海阿拉丁生化科技股份有限公司；维生素 C（分析纯）上海润捷化学试剂有限公司；正丁醇上海苏懿化学试剂有限公司；T-AOC（总抗氧化能力）、SOD（超氧化物歧化酶）、GSH-Px（谷胱甘肽酶）、MDA（丙二醛）试剂盒南京建成生物科技有限公司。HE 染液套装G1003，Servicebio；DEAE 纤维素 DE-52、葡聚糖凝胶 G-100北京索莱宝科技有限公司；葡聚糖分子量标品上海源叶生物科技有限公司。FD-1B-50 冷冻干燥机上海比朗仪器制造有限公司；YHZ-212 恒温振荡摇床苏州国飞实验室仪器有限公司；GFL-230 烤箱天津市莱玻瑞仪器设备有限公司；Nikon Eclipse E100 正置光学显微镜、Nikon DS-U3 成像系统日本尼康公司；凝胶色谱仪日本岛津公司；DHL-A 电脑数显恒流泵上海沪西分析仪器厂有限公司；Multiskan Spectrum 酶标仪赛默飞世尔科技公司；NIcolet in10 MX 傅立叶交换显微红外成像光谱仪美国尼高力仪器公司；UV-8000 紫外-可见分光光度计上海精密科学仪器有限公司；普通玻璃层析柱（1.660 cm）、（1.680 cm）上海琪特分析有限公司。1.2实验方法 1.2.1 粗多糖的提取多糖的提取参照课题组原有的提取方法13，并略作修改。称取 100 g 黄精粉末，加入 80%乙醇在 75 的条件下震荡 24 h 除去脂肪、低聚糖、色素类等小分子物质。用 4 层 200 目脱脂棉纱布过滤，滤渣在 50 的烘箱中干燥 24 h，后按 1:30 的料液比 80 水浴提取 2 h，过滤。按照原有比例向滤渣中加入相同水量，继续提取 2 h。合并滤液并浓缩至 300 mL 体积，向浓缩液中加入100 L-淀粉酶溶液（46 U/mL）于 60 反应 2 h除去淀粉。离心除去沉淀，在所得上清液中加入无水乙醇，使乙醇的终浓度达到 80%，4 静置 24 h。离 426 食品工业科技2023 年 9 月心取沉淀，采用 Sevage 法脱去沉淀中的蛋白质。将脱完蛋白的糖液浓缩，透析，冷冻干燥后得到黄精粗多糖。1.2.2 DEAE-纤维素阴离子交换柱（1.6 cm60 cm）对粗多糖进行初步分离将 200 mg 黄精溶解于5 mL 超纯水中，依次使用超纯水、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L NaCl 水溶液进行梯度洗脱（流速设置为5 mL/min，2 min/管），用自动收集器收集，采用苯酚硫酸法测定每管中洗脱液的吸光度，并绘制洗脱曲线。收集组分最高的洗脱液，冻干得到黄精多糖 P1组分。1.2.3 黄精多糖 P1 组分中成分的分离纯化将 50 mgP1 组分溶解于 3 mL 水中，采用 Sephadex G-100 凝胶层析柱（1.6 cm80 cm）对 P1 组分进行分离纯化，以超纯水作洗脱液，流速设置为 0.2 mL/min，采用苯酚硫酸法测定每管中洗脱液（2 mL）的吸光度，并绘制洗脱曲线，将最终所得组分收集合并冻干得到PSP。1.2.4 多糖的化学组成分析 1.2.4.1 碳水化合物测定参照李媛媛等14的方法，以葡萄糖作为标准品，采用苯酚硫酸法测定 PSP 组分中碳水化合物含量，获得葡萄糖的标准曲线回归方程为：Y=17.721X0.0641（R=0.9929）。其中，X 为葡萄糖溶液浓度，Y 为吸光度。1.2.4.2 糖醛酸含量测定参照赵志强等15的方法，以 D-半乳糖醛酸作为标准品，采用间羟基联苯法法测定 PSP 组分中糖醛酸的含量，获得 D-半乳糖醛酸的标准曲线回归方程为：Y=10.345X0.0303（R=0.998）。其中，X 为 D-半乳糖醛酸溶液浓度，Y 为吸光度。1.2.4.3 蛋白质含量测定参照张瑞平等16的方法，以牛血清白蛋白作为标准品，采用考马斯亮法测定PSP 中蛋白质含量，获得牛血清白蛋白的标准曲线回归方程为：Y=5.6699X+0.0444（R=0.9987）。其中，X 为牛血清白蛋白溶液浓度，Y 为吸光度。1.2.5 紫外分光光度法分析将 PSP 溶于纯水中，配制成 0.1 mg/mL 的溶液，在 200800 nm 的波长区间扫描。1.2.6 红外光谱分析参照刘贵珍等17的方法，采用 KBr 压片法制样。用红外光谱仪在 4000400 cm1区域进行扫描。利用 OriginPro 2021 软件进行数据处理。1.2.7 分子量测定使用岛津凝胶色谱柱，对多糖的均一性和分子量进行分析，分析柱采用TSK G4000PWXL柱（7.8 mm300 mm）。配制多糖溶液（5 mg/mL），以超纯水作流动相，流速为 0.6 mL/min，在 30 的环境下用 RID 检测器检测。根据由不同分子量的葡聚糖标准品制成的校准曲线来确定分子量。1.2.8 碘化钾试验精密称取 2 mg 黄精多糖样品溶于 1.2 mL 含 0.02%I2的 KI 溶液，稀释 10 倍，在 300700 nm 区域进行波长扫描，观察 350 nm 处是否存在吸收峰，以此判断多糖的侧链和分支结构。1.2.9 刚果红实验配制 PSP 溶液（2.5 mg/mL）与刚果红溶液（80 mol/L）按 1:1（v/v）的比例充分混合，通过加入 NaOH 溶液（4 mol/L），将混合物逐渐调整到不同 NaOH 浓度（0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45 和 0.5 mol/L）。通过紫外扫描（200600 nm）记录不同浓度的刚果红多糖溶液的最大吸收波长。1.3动物实验 1.3.1 氧化损伤小鼠模型的构建与给药70 只SPF 级小鼠适应性喂养一周，期间小鼠自由饮水、觅食普通饲料。适应期后，随机分为 5 组（每组 14只）：正常组（Control）、模型组（Model）、阳性组（Positive）、多糖低剂量组（PSP-L）、多糖高剂量组（PSP-H）。除正常组外，各组连续每天上午腹腔注射D-半乳糖（500 mg/kg）三周，下午 67 点灌胃黄精多糖 PSP，多糖低剂量组灌胃 50 mg/kg 的多糖溶液，多糖高剂量组灌胃 200 mg/kg 的多糖溶液；阳性对照组上午注射 D-半乳糖（500 mg/kg），下午灌胃维生素C（200 mg/kg）。1.3.2 样本采集小鼠禁食不禁水 12 h，称重，采集小鼠血液，在 4 放置 3 h，离心 15 min（3500 g），取血清，分装保存备用；采血后立即处死小鼠，取出其肝脏、脾脏、肾脏、脑等组织，将脏器表面的血液用预冷的生理盐水洗净，随后用滤纸擦干表层水分，称重并计算脏器指数。随机选取部分肝脏、脑组织加入的 4%多聚甲醛溶液固定；另一部分用液氮预冻后80 保存备用。按照公式（1）（3）计算脏器指数。肝脏指数(mg/g)=肝脏质量小鼠体重式（1）肾脏指数(mg/g)=肾脏质量小鼠体重式（2）脾脏指数(mg/g)=脾脏质量小鼠体重式（3）1.3.3 血清、肝脏、脑组织匀浆抗氧化指标测定血清、肝脏和脑组织匀浆液中的 SOD、T-AOC、GSH-Px、MDA 水平均按照试剂盒说明书方法测定。1.3.4 肝脏 HE 染色将浸泡在 4%多聚甲醛中的肝脏进行常规的 HE 组织化学染色，以观察肝组织的病理变化情况，细胞核呈蓝色，细胞质呈红色。1.3.5 免疫组化采用常规的免疫组化方法评估黄精多糖低、高剂量组处理的小鼠对 Nrf2、HO-1 蛋白的表达。将样本脱蜡和水化后，将组织切片浸入柠檬酸（pH6.0）以进行抗原修复。此后，将切片在室温下用血清密封 30 min，然后与一级抗 Nrf2 和抗 HO-1第 44 卷 第 18 期刘旺，等：黄精多糖理化性质及其对 D-半乳糖诱导小鼠氧化损伤的保护作用 427 抗体在 4 孵育过夜。用 PBS（PH7.4）洗涤 3 次后，在室温下用二抗（HRP 标记）覆盖切片 50 min，并加入二氨基联苯胺（DAB）进行显色反应，对细胞核复染，切片用苏木精染色溶液复染，后在光学显微镜下观察18。1.4数据处理所有实验统计数据图均采用 Origin 2021、Graphpad Prism 8 绘制而成，所有数据分析均采用单因素方差分析。2结果与分析 2.1PSP 的分离纯化黄精粗多糖 DEAE 的洗脱曲线见图 1a，经 DEAE-纤维素阴离子交换柱分离纯化后，收集水洗组分冷冻干燥后得水洗组分糖 P1，得率为 82.67%。采用Sephadex G-100 凝胶层析柱对 P1 组分进一步分离，所得组分冷冻干燥后命名为 PSP，洗脱曲线见图 1b，得率为 93.24%。制备 PSP 继续开展后续实验。00123450吸光度(490 nm)吸光度(490 nm)20406080管数(10 mL)(a)DEAE洗脱曲线(b)G100洗脱曲线管数(2 mL)0.50.40.30.20.10.0NaCl洗脱浓度(mol/L)2.01.51.00.50.050100图 1 多糖洗脱曲线Fig.1 Elution curve of polysaccharides 2.2PSP 的化学组成分析将样品所测得的吸光度值带入标曲测得样品中所含碳水化合物的含量为 94.42%14.73%、糖醛酸的含量为 6.21%0.71%、蛋白质的含量为 0.24%0.032%，表明 PSP 是纯度较高的多糖。2.3PSP 的分子量测定由 PSP 的 HPGPC 图谱（见图 2b）可推断，PSP是均一性较好的多糖组分。根据不同分子量葡聚糖标准品的保留时间（见图 2a）与其对数值，可获得标准曲线：Y=0.3927X+10.716（R=0.9951），将样品的保留时间代入，算得 PSP 的分子量为 5566.41 Da。600005000040000300002000010000010000强度05101518.475202530保留时间(min)3000 Da3000020000100000强度05101517.942202530保留时间(min)5000 Da3000020000100000强度05101517.567202530保留时间(min)6000 Da3000020000100000强度05101517.025202530保留时间(min)10000 Da20000100000强度05101516.317202530保留时间(min)20000 Da20000100000强度05101515.633202530保留时间(min)40000 Da(a)不同分子质量葡聚糖标准品的HPGPC图谱(b)PSP的HPGPC图谱05 10 15 20 25 30 35 400100002000030000强度PSP17.75保留时间(min)图 2 葡聚糖标准品和 PSP 的 HPGPC 图谱Fig.2 HPGPC spectra of dextran standards and PSP 2.4PSP 的紫外光谱与红外光谱分析紫外光谱扫描图见图 3a，PSP 在 260 和 280 nm处未见明显的特征吸收峰存在，说明 PSP 中没有核酸和蛋白质的存在19。红外光谱见图 3b，在 3392 cm1附近的强而宽的吸收峰是由 O-H 的拉伸振动引起的20，在 2936 cm1左右的峰值是 C-H 拉伸振动引起的，1635 cm1附近的条带是由 C=O 所引起的，表明 PSP 中有糖醛酸的存在21，这与化学组成分析结果相验证。1130 cm1和 1024 cm1的吸收峰是由呋喃糖的 C-O-C 的伸缩 2003004005006007008000.050.000.050.100.150.200.25吸光度波长(nm)(a)紫外光谱扫描 428 食品工业科技2023 年 9 月振动引起的22，在 932 和 815 cm1左右的吸收峰归属于含有 型糖苷键果糖的吸收峰 2123，在 644 和528 cm1附近的吸收峰表明 PSP 中存在吡喃糖环骨架13。2.5PSP 的碘化钾试验PSP 溶液与碘试剂混匀后用紫外光谱仪扫描，光谱图如图 4 所示，由于 PSP 与 I2-KI 的反应物最大吸收峰出现在 350 nm 处附近，而不是 565 nm 处，说明 PSP 中可能具有较长的侧链和较多的分支24。3004005006007000.00.51.01.52.02.5吸光度波长(nm)图 4 碘化钾紫外扫描图Fig.4 KI UV scan chart 2.6PSP 的构象分析刚果红溶液可以与具有三股螺旋结构的多糖形成络合物，在弱碱性条件下络合物的最大吸收波长会上升，而较强碱性条件下复合物的最大吸收波长会下降，这种最大吸收波长的特征性变化用于判断样品中的螺旋结构25。PSP 与刚果红溶液在碱性条件下最大吸收波长的变化见图 5，与单独的刚果红溶液相比，PSP 与刚果红的混合溶液在 00.15 mol/L 的NaOH 溶液中，其最大的吸收波长发生明显上升，表明 PSP 中有三股螺旋结构的存在26。2.7PSP 对氧化损伤小鼠体重及脏器指数的影响为测定 PSP 在体内对氧化损伤的保护作用，建立了 D-半乳糖诱导的小鼠氧化损伤模型。与对照组相比，D-半乳糖的注射显著降低了小鼠的体重，然而，低、高剂量组的多糖显著逆转了小鼠的体重减轻（P0.05）。有研究表明，D-半乳糖的注射可引发脏器功能减弱与失调的免疫反应27。如表 1 中所示，氧化损伤模型组的脾脏指数显著低于正常组（P0.05）；与模型组相比，高剂量保护组显著提高了小鼠的脾脏指数（P0.05）；低剂量和高剂量的PSP 均显著提高了肝脏指数（P0.05）。这些结果表明，多糖处理可改善由 D-半乳糖注射诱导所引起的体重减轻和肝脏及脾脏指数的降低。表 1 氧化损伤小鼠体重及脏器指数Table 1 Body weight and organ indices of mice with oxidativedamage组别第三周体重（g）肝脏指数（mg/g）肾脏指数（mg/g）脾脏指数（mg/g）正常组42.150.7761.212.0216.260.768.121.28模型组36.871.70#51.273.99#11.770.92#4.530.36#阳性组40.470.84*59.841.08*14.040.696.891.46多糖高剂量组 40.500.64*61.911.93*13.830.407.020.65*多糖低剂量组 40.200.85*57.950.70*13.342.346.821.04注：“#”表示与正常组相比存在显著差异（P0.05）；“*”表示与模型组相比存在显著差异（P0.05）。2.8PSP 对氧化损伤小鼠脑、肝、血清中 GSH-Px、MDA、SOD、T-AOC 含量的影响生物体的抗氧化能力与健康存在着紧密联系，当生物体的总抗氧化能力遭到破坏或降低时，容易引发各种疾病28。GSH-Px 作为机体内部一种重要的过氧化物分解酶，其主要的功能是保护细胞膜的结构及功能的完整，防止机体受过氧化物的干扰及损害29。SOD 是一种抗氧化金属酶，分布范围较广，几乎存在于所有生物细胞中，能够催化超氧阴离子自由基歧化生成氧和过氧化氢，在机体氧化与抗氧化平衡中起到至关重要的作用30，MDA 可以反映机体脂质过氧化速率和强度，能间接反映组织过氧化损伤程度3132，其含量的测定通常与 SOD 含量的测定互相配合33。T-AOC 反应测定对象中各种抗氧化物质和抗氧化酶等构成总抗氧化水平34。对小鼠脑、肝脏及血清中的 GSH-Px、MDA、SOD、T-AOC 测定发现（图 6a-d,e-h,i-l），与正常组相比，模型组小鼠脑脑组织中 GSH-Px 的含量显著 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 50060801001203392293616351424145611301024932815701644528585透过率(%)波数(cm1)(b)红外光谱扫描图 3 PSP 的紫外和红外扫描光谱Fig.3 UV spectra and FI-IR spectra of PSP 0.00.20.40.6480490500510520PSP+刚果红刚果红波长(nm)NaOH的浓度(mol/L)图 5 刚果红实验结果Fig.5 Results of Congo red with PSP 第 44 卷 第 18 期刘旺，等：黄精多糖理化性质及其对 D-半乳糖诱导小鼠氧化损伤的保护作用 429 下降（P0.05），MDA 的含量显著上升（P0.05），SOD 的含量显著下降（P0.05），T-AOC 显著下降（P0.05），均能够说明模型组小鼠的已产生氧化衰老症状，表明 D-半乳糖诱导小鼠氧化损伤模型造模成功。与模型组相比，虽然多糖低剂量组肝脏中 GSH-Px 与 SOD 的表达量无显著差异，但是其 T-AOC 表达显著提升（P0.05），MDA 的含量显著降低（P0.05）。此外，在脑和血清中 GSH-Px、SOD 与 T-AOC的表达均有显著提升（P0.05），MDA 的表达显著降低（P0.05）。多糖高剂量组小鼠的脑、肝脏及血清中的 GSH-Px、SOD 与 T-AOC 的表达均有显著提升（P0.05），MDA 的表达显著降低（P0.05），表明高剂量的黄精多糖对 D-半乳糖诱导的氧化损伤具有明显的保护作用。2.9PSP 对氧化损伤小鼠肝脏组织形态的影响经过 HE 染色，肝脏组织切片细胞中所存在的脂类物质被二甲苯溶解成为空泡（见图 7）。正常组的小鼠肝细胞排列齐整，形态饱满，细胞核呈圆形，周围的细胞质丰富，细胞膜清晰。模型组小鼠的细胞排列顺序紊乱、肝小叶的结构被破坏，可见大量的脂肪空泡，部分细胞核氧化应激损伤严重，颜色变浅或消失，表明模型小鼠的肝脏发生了严重的脂肪变性，肝脏氧化应激损伤程度严重。从小鼠肝脏的 HE 染色图可以看出，与模型组相比，多糖高剂量组的空泡数量明显减少，细胞排列整齐，大多数细胞核呈圆形，胞膜清晰，表明高剂量的黄精多糖对小鼠的肝脏细胞具有较好的保护作用18。2.10PSP 对氧化损伤小鼠肝脏 HO-1 和 Nrf2 蛋白表达的影响Nrf2/HO-1 信号通路是细胞抗氧化防御机制的一个重要组成部分，在保护机体免受氧化损伤中起着重要作用，当 ROS 过量产生时，Nrf2 被激活易位到 abcdefghijkl0100200300400500*#0.00.51.01.52.0*#0.000.020.040.060.080.10*#0100200300400500*#050100150*#0.00.51.01.52.02.5*#02004006008001000*#0.000.020.040.060.08*#050100150*#0246*#050100150200*#0.00.20.40.60.81.0*#正常组模型组阳性组多糖高剂量组多糖低剂量组正常组模型组阳性组多糖高剂量组多糖低剂量组正常组模型组阳性组多糖高剂量组多糖低剂量组正常组模型组阳性组多糖高剂量组多糖低剂量组正常组模型组阳性组多糖高剂量组多糖低剂量组正常组模型组阳性组多糖高剂量组多糖低剂量组正常组模型组阳性组多糖高剂量组多糖低剂量组正常组模型组阳性组多糖高剂量组多糖低剂量组正常组模型组阳性组多糖高剂量组多糖低剂量组正常组模型组阳性组多糖高剂量组多糖低剂量组正常组模型组阳性组多糖高剂量组多糖低剂量组正常组模型组阳性组多糖高剂量组多糖低剂量组GSH-PxMDA(nmol/mg protein)SOD(U/mg protein)T-AOC(mmol/g protein)GSH-Px(U/mg protein)MDA(nmol/mg protein)SOD(U/mg protein)T-AOC(mmol/g protein)GSH-Px(U/mg protein)MDA(nmol/mg protein)SOD(U/mg protein)T-AOC(mmol/g protein)(U/mg protein)图 6 小鼠脑、肝、血清中 GSH-Px、MDA、SOD、T-AOC 测定结果Fig.6 Results of GSH-PX,MDA,SOD and T-AOC measurements in mouse brain,liver and serum注：图中 ad，eh，il 分别为小鼠脑、肝、血清中 GSH-Px、MDA、SOD、T-AOC 测定结果。“#”表示与正常组相比，存在显著性差异 P0.05，“#”P0.01，“#”P0.001；“*”表示与模型组相比，存在显著性差异，P0.05，“*”P0.01，“*”P0.001。正常组模型组阳性组多糖高剂量组e多糖低剂量组abcd图 7 氧化损伤小鼠肝脏的 HE 染色Fig.7 HE staining of liver in mice with oxidative damage注：图中箭头所指示区域为肝小叶。430 食品工业科技2023 年 9 月细胞核，识别并激活 ARE，进而诱导 HO-1 等下游抗氧化基因的表达35。HO-1 是防止氧化应激最关键的蛋白。有研究表明，Nrf2/HO-1 信号通路的激活可能是预防 D-半乳糖诱导的小鼠氧化损伤的一个潜在途径36。小鼠肝脏 HO-1 染色情况如图 8 所示。a正常组b模型组c阳性组d多糖高剂量组e多糖低剂量组图 8 氧化损伤小鼠肝脏 HO-1 染色Fig.8 HO-1 staining of the liver in mice with oxidative damage 本文采用免疫组化的方法检测肝脏中 Nrf2 和HO-1 蛋白的表达（见图 9图 10）。结果表明，与正常组相比，模型组的 Nrf2 和 HO-1 蛋白的表达显著降低，表明模型组造模成功；与模型组相比，低、高剂量黄精多糖能够显著增加 Nrf2 和 HO-1 蛋白的表达（P0.05），表明黄精多糖很有可能是通过 Nrf2/HO-1信号通路发挥对肝脏的保护作用。3结论经凝胶色谱测得 PSP 的分子量为 5566.41 Da；PSP 的化学组成分析发现，PSP 中碳水化合物、糖醛酸及蛋白质的含量分别为94.4214.73%、6.210.71%、0.240.032%；红外光谱分析显示 PSP 中存在呋喃环与吡喃环构型，且存在 型糖苷键的果糖；碘化钾实验验证了 PSP 中存在较长的侧链和较多的分支。动物实验结果表明，与模型组比，高剂量的黄精多糖能够显著提高小鼠肝脏组织、脑组织、血清中GSH-Px、SOD 和 T-AOC 含量，降低 MDA 水平；肝脏的 HE 染色及免疫组化学分析显示，黄精多糖对肝脏的氧化损伤细胞有着显著的保护效果且能够显著增强 Nrf2、HO-1 的表达。由此可以推断，黄精多糖对 D-半乳糖诱导的氧化损伤具有一定的保护作用，且其发挥氧化损伤保护作用的机制可能与 Nrf2/HO-1信号通路有关。参考文献 1 杨德,薛淑静,卢琪,等.黄精药理作用研究进展及产品开发J.湖北农业科学，2020，59（21）：59.YANG De,XUE ShuJing,LU Qi,et al.Research progress and product development of Polygo-natum sibiricumJ.Hubei Agricultural Science，2020，59（21）：59.2 国家药典委员会.中华人民共和国药典S.北京:中国医药科 技 出 版 社,2020:319.National pharmacopoeia committee.Pharmacopoeia of the Peoples Republic of ChinaS.Beijing:Chi-na Medical Science and Technology Press,2020:319.3 ZHAO H,WANG Q L,HOU S B,et al.Chemical con-stituents from the rhizomes of Polygonatum sibiricum red.And anti-inflammatory activity in raw 264.7 macrophage cellsJ.NaturalProduct Research，2019，33（16）：23592362.a正