骨碎补总黄酮对口腔种植骨整合中牙槽骨成骨细胞增殖和凋亡的影响研究.pdf

:6792023年8 月第43卷第8 期口腔医学骨碎补总黄酮对口腔种植骨整合中牙槽骨成骨细胞增殖和调亡的影响研究申晓靖，刘海蓉，厉华李林林3,王乐为4,袁荣涛 郭庆圆,赵鹏！摘要目的探讨骨碎补总黄酮（total flavonoids of rhizomadrynariae,TFRD）对牙槽骨成骨细胞的增殖和凋亡的影响及其机制。方法去分离和培养大鼠牙槽骨成骨细胞。将细胞分为对照组、低剂量TFRD组（50 mg/L）、高剂量TFRD组（10 0 mg/L)；NCmimic和miR-93-5pmimic转染至成骨细胞后，与高剂量的TFRD孵育，分别记为TFRD+NCmimic 组和TFRD+miR-93-5pmimic组;CCK-8法检测细胞增殖；流式细胞术检测细胞调亡；采用RT-qPCR和Westernblotting分别检测miR-93-5p、成骨分化相关基因（Osteriex和RUNX2）和WNT通路相关基因（Dishevelled和-catenin）的表达水平；ALP染色和活性测试检测细胞成骨分化。结果TFRD处理后的牙槽骨成骨细胞增殖能力增加（P0.05），细胞凋亡率降低（P0.05）,A LP活性、Osteriex和RUNX2的表达增加（P0.05），mi R-93-5p 的表达降低（P0.05），FZD 6、D i s h e v e l l e d 和-catenin的表达增加（P0.05），激活WNT通路。过表达miR-93-5p逆转TFRD对成骨细胞的保护作用，导致细胞增殖能力降低（P0.05）细胞调亡率增加（P0.05），A LP活性和Osteriex和RUNX2的表达降低（P0.05），mi R-93-5p 的表达增加（P0.05），FZD 6、D i s h e v e l l e d 和-catenin表达减少（P0.05），抑制WNT通路。结论TFRD通过miR-93-5p/FZD6/WNT通路促进牙槽骨成骨细胞增殖，抑制凋亡。【关键词骨碎补总黄酮;成骨细胞；增殖;miR-93-5p;WNT通路中图分类号 R965.1文献标识码1A文章编号1003-9872(2023)08-0679-07doi10.13591/ki.kqyx.2023.08.002Effects of total flavonoids of rhizomadrynariae on proliferation and apoptosis of alveolar bone osteoblasts during osseointegra-tion of oral implantsSHEN Xiaojing,LIU Hairong,LI Hua,LI Linlin,WANG Lewei,YUAN Rongtao,GUO Qingyuan,ZHAO Peng.(Department of Stoma-tology,Qingdao Municipal Hospital,Qingdao 266000,China)Abstract:Objective To investigate the effects of total flavonoids of rhizomadrynariae(TFRD)on the proliferation and apoptosis ofalveolar bone osteoblasts and its mechanism.Methods Osteoblasts from rat alveolar bone were isolated and cultured.The cells weredivided into control group,low-dose TFRD group(50 mg/L)and high-dose TFRD group(100 mg/L).After transfection with NC mimicand miR-93-5p mimic,osteoblasts were incubated with high-dose TFRD,which were classified as TFRD+NC mimic group and TFRD+miR-93-5p mimic group,respectively.Cell proliferation was detected by CCK-8 method.Cell apoptosis was detected by flow cytometry.The expression of miR-93-5p,osteogenic dfferentiation-related genes(Osteriex and RUNX2),and WNT pathway-related genes(Di-shevelled and-catenin)were detected by RT-qPCR and Western blotting,respectively.Osteogenic differentiation was detected by ALPstaining and activity test.Results After TFRD treatment,the proliferation ability of alveolar osteoblasts was increased(P0.05);ap-optosis rate was decreased(P0.05);ALP activity and the expression of Osteriex and RUNX2 was increased(P0.05);the expressionof miR-93-5p was decreased(P0.05);the expression of FZD6,Dishevelled and-catenin was increased(P0.05),activating theWNT pathway.Overexpression of miR-93-5p reversed the protective effect of TFRD on osteoblasts,leading to the reduction of cell pro-liferation(P0.05),the increase of apoptosis rate(P0.05),the decrease of ALP activity and Osteriex and RUNX2 expression(P0.05),the increase of miR-93-5p expression(P0.05),the reduction of FZD6,Disevelled and-catenin expression(P0.05),andthe inhibition of WNT pathway.ConclusionTFRD promotes proliferation and inhibits apoptosis of alveolar bone osteoblasts throughmiR-93-5p/FZD6/WNT pathway.Keywords:total flavonoids of rhizomadrynariae;osteoblast;proliferation;miR-93-5p;WNT pathway基金项目：山东省中医药科技重点项目（Z-2022008）；山东省医药卫生科技发展计划项目（2 0 2 0 0 8 0 30 332）作者单位：1青岛市市立医院口腔科，山东青岛（2 6 6 0 0 0）；2 青岛西海岸新区人民医院口腔科，山东青岛（2 6 6 0 0 0）；3青岛市中医医院（海慈医疗集团）干部保健科，山东青岛（2 6 6 0 0 0）；4甘肃省陇南市武都区第一人民医院口腔科，甘肃陇南（7 46 0 0 0）通信作者：赵鹏E-mail:Stomatology,2023,43(8):679-685口腔种植技术已逐步应用于口腔修复、口腔外科、正畸美学等领域 。长期缺牙、牙周病、根尖周组织疾病或其他相关症状的患者，牙槽骨会发生吸收，导致牙槽骨骨量不足和骨缺损，影响口颌系统的.680.申晓靖，等.骨碎补总黄酮对口腔种植骨望槽骨成骨细胞增殖和调亡的影响研究健康和功能,增加种植体修复的难度和风险 2-5骨碎补总黄酮（total flavonoids of rhizomadrynariae,TFRD)是从骨碎补植物中提取的一类黄酮类化合物,其有效单体包括圣草苷、柚皮素和柚皮苷 6-7 。研究发现，,TFRD具抗氧化特性和抗骨质疏松等活性，已广泛应用于临床，具有较高的研发利用价值 8 。Chen等 9 通过体内和体外研究证明，TFRD治疗类风湿关节炎与抑制Th17分化和滑膜细胞炎症反应密切相关。此外,TFRD可通过PI3K/AKT/HIF-1/VECF信号通路调节胫骨缺损大鼠的成骨和血管生成，通过激活PDGF-BB/VEGF/RUNX2/OSX信号通路增强大鼠牵张成骨模型中CD31hiEmcn血管形成和随后的骨再生 10-1。然而,TFRD是否可调控解决口腔种植中的牙槽骨骨量不足和骨缺损问题，目前尚未见报道。既往研究表明，微小RNA（mi c r o RNA，mi RNA）通过诱导成骨细胞分化、增殖、表观遗传修饰和细胞调亡参与牙槽骨修复和牙周再生 12 1。mi R-93-5p 被发现抑制成骨细胞分化 13。FZD6/WNT信号通路已被证实可促进成骨细胞增殖和分化促进牙种植体的骨整合 14。因此，本研究主要探讨TFRD对牙槽骨成骨细胞增殖和凋亡的影响及miR-93-5p/FZD6/WNT信号通路的改变。1材料与方法1.1材料与仪器TFRD购自北京岐黄药业股份有限公司；miRNA反转录试剂盒购自日本Takara公司，荧光定量 PCR试剂盒 FastStart Universal SYBR GreenMaster(Rox)购自上海罗氏公司;5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐/硝基蓝四唑（BCIP/NBT）试剂盒购自中国碧云天生物技术公司；ALP试剂盒购自南京建成生物公司；Lipofectamine3000转染试剂、抗体均购自英国Abcam公司;DMEM培养基购自美国Gibco公司;BCA蛋白定量试剂盒购自美国ThermoFisherScientific公司;miR-93-5p正向和反向引物购自南京金斯瑞生物科技公司；miR-93-5p模拟物（mimic）及其阴性对照由大连宝生物公司设计合成；LightCycler480荧光定量PCR仪购自瑞士Roche公司；凝胶成像仪购自英国UvitecCambridge公司；Ax-ioVertA1倒置荧光显微镜购自德国ZEISS公司；SynergyHl全功能酶标仪购自美国Biotek公司。SPF级SD大鼠（150 18 0 g）,4 6 周龄，雌雄不限，购自青岛大任富城畜牧有限公司许可证号：SCXKL（鲁）2 0 14-0 0 7)。本研究经过青岛市市立医院伦理委员会审核（伦理批号：2 0 2 3-0 48），符合动物伦理原则。1.2牙槽骨成骨细胞的分离和培养采用腹腔注射10 0 mg/kg氯胺酮麻醉处死SD大鼠，置于7 5%乙醇中浸泡5min，随后无菌条件下分离大鼠下颌牙槽骨并去除附着的软组织、牙齿和软骨。将从SD大鼠下颌牙槽骨上收集的血块和软组织用PBS反复洗涤3次后，用解剖剪刀将牙槽骨剪切至1mm的骨片,PBS洗涤至它们变得白色和透明。随后，骨片被转移到0.2 5%胰蛋白酶溶液中消化2 0 min，10 0 0 g 离心5min，丢弃上清液后，与含有10%FBS的DMEM培养基孵育。将预消化的骨片置于培养皿底部，加人DMEM，在37 和5%CO,条件下孵育，每2 3d更换培养基。显微镜下观察细胞，直到密度达到8 0%左右，进行传代。牙槽骨成骨细胞传代3次后，用于后续实验1.3细胞处理和分组将牙槽骨成骨细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37、5%CO,饱和湿度的培养箱中生长。取TFRD0.25g加人2 5mL灭菌PBS中,制备成质量浓度为1g/L的TFRD溶液。采用DEME培养基将上述TFRD溶液稀释为浓度为2 5、50、10 0、150 和2 0 0 mg/L的TFRD，然后分别加人大鼠牙槽骨成骨细胞，记为2 5、50、10 0、150 和2 0 0mg/L的TFRD组用于CCK-8法检测细胞增殖。将牙槽骨成骨细胞分为对照组（不含TFRD的培养基培养的细胞），低剂量TFRD组（含有50 mg/L的TFRD培养基培养的细胞）和高剂量TFRD组（含有100mg/L的TFRD培养基培养的细胞）用于PCR，Westernblotting，A LP检测和流式细胞仪检测。根据Lipofectamine3000说明书将NCmimic和miR-93-5pmimic转染至含有10 0 mg/L的TFRD培养基培养的细胞中（TFRD+NC mimic组,TFRD+miR-93-5pmimic组），48 h 后与对照组、含有10 0 mg/L的TFRD培养基（TFRD组）一并进行后续实验1.4荧光定量PCR(RT-qPCR利用Trizol试剂提取各组大鼠牙槽骨成骨细胞总RNA，根据miRNA反转录试剂盒说明书进行反转录合成cDNA。按照FastStart Universal SYBRGreenMaster（Ro x）试剂盒说明书进行qPCR，反应体系包含2.5LcDNA,12.5LFastStartUniversalSYBR GreenMaster(Rox）,mi R-93-5p 正向和反向引物各0.2 5L,9.5L水（PCR等级），总体积2 5L。引物序列：miR-93-5p正向引物为5-CGCAAAGT-GCTGTTCGTGC-3,反向引物为5-AGTGCAGGGTC-.681第43卷第8 期口腔医学2023年8 月CGAGGTATT-3;U6正向引物为5-CTCGCTTCG-GCAGCACA-3，反向引物为5-AACGCT-TCACGAATTTGCGT-3。q PCR反应条件如下：952min;9515s,6 0 45s,共40 个循环,以U6为内参基因,根据2-4ACi法计算miR-93-5p的表达量。1.5蛋白质印迹(Western blotting)将各组大鼠牙槽骨成骨细胞样品中加人RIPA细胞裂解液，提取蛋白；用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。取定量的蛋白样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳后,转膜至聚偏氟乙烯膜（PVDF）上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h；然后分别与Osteriex、RU NX2、FZD 6、D i s h e v e l l e d、-catenin和GAPDH等一抗4孵育过夜，二抗IgG-HRP室温孵育2 h,ECL法检测。用凝胶图像处理系统Gel-Pro-Analyzer软件分析目标条带的灰度值。1.6ALP染色和活性检测采用5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐/硝基蓝四唑(BCIP/NBT)试剂盒进行ALP染色。收集培养7d后的各组大鼠牙槽骨成骨细胞，丢弃细胞培养液。PBS洗涤2 次后，用4%中性甲醛固定30 min。随后，加人BCIP/NBT避光10 min，洗涤终止染色，干燥过夜。显微镜下观察矿化结节。收集培养7 d后的各组大鼠牙槽骨成骨细胞，丢弃培养液，用PBS洗涤3次。用0.2%TritonX-100与成骨细胞孵育，置于4冰箱过夜。然后，收集细胞，使用ALP试剂盒进行ALP活性测定。1.7CCK-8检测细胞增殖将各组大鼠牙槽骨成骨细胞（110 3个/孔）接种于96 孔板中，根据实验分组处理细胞后，在正常培养条件下分别孵育2 4h、48 h 和7 2 h。随后，在每孔中加10 LCCK-8溶液,37 孵育2 h。通过酶标仪测定每个孔在450 nm的OD值。1.8流式细胞术检测细胞凋亡采用AnnexinV-FITCPI 细胞调亡试剂盒检测细胞凋亡率。各组大鼠牙槽骨成骨细胞用PBS清洗3次后加入胰酶消化，收集细胞。随后，用40 0L结合缓冲液重悬细胞，同时加人5LAnnexinV-FITC和10 LPI溶液，室温避光15min,通过流式细胞仪检测细胞调亡情况，1.9统计学分析采用SPSS22.0统计软件对数据进行分析。所有实验数据以均数标准差（xs）表示。两组间数据分析采用Studentst-test检验，多组间差异比较采用one-wayANOVA分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P0.05为差异具有统计学意义。2结果2.1TFRD促进成骨细胞增殖，抑制凋亡CCK-8结果（图1A）显示，与对照组比较，低剂量的TFRD（50 m g/L）和高剂量的TFRD（10 0mg/L)显著促进成骨细胞的增殖,且高剂量的TFRD促进效果显著优于低剂量的TRFD,差异具有统计学意义(P0.05);流式细胞术结果（图1B)显示,与对照组比较,低剂量和高剂量的TFRD显著抑制成骨细胞的调亡,且高剂量的TFRD抑制效果显著优于低剂量的TRFD,差异具有统计学意义（P0.05），见图1。A2.0r-1d-3d-5d#*4*H#*H(uuost)ao1.5A*H1.0#*H0.5*H0.0L对照组2550100150200TFRD/(mg/L)B对照组低剂量组高剂量组.540.21%0410101610100143470%2872.17%10100AnnexinV-FITCC10r864*#20对照组低剂量组高剂量组组别A：CCK-8 检测牙槽骨成骨细胞增殖情况；B：流式细胞术检测牙槽骨成骨细胞调亡情况；C：牙槽骨成骨细胞调亡统计结果；*：与对照组比较，P0.05；：与2 5mg/L的TFRD比较，P0.05；#：与低剂量组(50mg/L的TFRD)比较,P0.05图1TFRD对牙槽骨成骨细胞增殖和凋亡的影响Fig.1Effects of TFRD on osteoblast proliferation andapoptosis in alveolarbone2.2TFRD促进成骨细胞中ALP、O s t e r i e x 和RUNX2的表达ALP染色和活性检测结果（图2 A）显示，成骨细胞培养7 d后，低剂量和高剂量组的ALP活性明显高于对照组,且以剂量依赖方式增加ALP活性，682申晓靖，等.骨碎补总黄酮对口腔种植骨望中牙槽骨成骨细胞增殖和调亡的影响研究差异具有统计学意义（P0.05）；W e s t e r n b l o t t i n g 结果（图2 B和2 C）显示，与对照组比较，低剂量和高剂量组中Osteriex和RUNX2的表达增加，且呈剂量依赖方式，差异具有统计学意义（P0.05），见图2。2.3TFRD调控miR-93-5p、FZD 6、D i s h e v e l l e d 和-catenin 的表达RT-qPCR结果（图3A）显示,与对照组比较,低剂量和高剂量组中miR-93-5p的表达降低，且呈剂量依赖方式，差异具有统计学意义（P0.05）；Westernblotting结果（图3BD）显示，与对照组比较，低剂量和高剂量组中FZD6和WNT通路相关蛋白（Dishevelled和-catenin）的表达增加，且呈剂量依赖方式，差异具有统计学意义（P0.05）（图3）。A对照组低剂量组高剂量组B100r8060402050m0对照组低剂量组高剂量组C5Osteriex*#43RUNX2322GAPDH对照组0低剂量组高剂量组对照组低剂量组高剂量组对照组低剂量组高剂量组A：牙槽骨成骨细胞ALP染色情况（200）；B：牙槽骨成骨细胞中ALP活性检测情况；C：W e s t e r n b l o t 检测牙槽骨成骨细胞中Osteriex和RUNX2的蛋白表达水平；*：与对照组比较，P0.05；#：与低剂量组比较,P0.05图2 TFRD对牙槽骨成骨细胞中ALP、O s t e r i e x 和RUNX2的表达的影响Fig.2Effects of TFRD on ALP,Osteriex,and RUNX2 expression in alveolar bone osteoblastsB4FZD643.52.53.0331.0Dishevelled2.022-catenin1.50.5*#1.0GAPDH0.50.00.000对照组低剂量组高剂量组对照组低剂量组高剂量组对照组低剂量组高剂量组对照组低剂量组高剂量组对照组低剂量组高剂量组A：RT-q PCR检测牙槽骨成骨细胞中miR-93-5p的表达水平B：W e s t e r mb l o t 检测牙槽骨成骨细胞中FZD6、D i s h e v e l l e d 和-catenin的蛋白表达水平；*：与对照组比较，P0.05；#：与低剂量组比较，P0.05图3TFRD对牙槽骨成骨细胞中miR-93-5p、FZD 6、D i s h e v e l l e d 和-catenin的表达的影响Fig.3Effects of TFRD on the expression of miR-93-5p,FZD6,Dishevelledand-catenin in alveolar bone osteoblasts2.4TFRD通过miR-93-5p调控成骨细胞增殖和调亡与对照组比较,TFRD组中成骨细胞增殖能力显著增加（P0.05），细胞凋亡显著降低（P0.05）；与TFRD+NCmimic组比较,TFRD+miR-93-5p组中成骨细胞增殖能力下降（P0.05），细胞调亡率上升（P 0.0 5），差异具有统计学意义，见图4。2.5TFRD通过miR-93-5p调控成骨细胞中ALP、Osteriex和RUNX2的表达与对照组比较,TFRD组成骨细胞中ALP活性显著增加（P0.05）；与TFRD+NCmimic组比较，TFRD+miR-93-5p组成骨细胞中ALP活性下降（P0.05）；与对照组比较,TFRD组成骨细胞中Osteriex和RUNX2的表达显著增加（P0.05）；与TFRD+NCmimic组比较,TFRD+miR-93-5p组成骨细胞中Os-teriex和RUNX2的表达减少（P0.05）见图5。2.6TFRD通过miR-93-5p调控FZD6/WNT通路与对照组比较,TFRD组成骨细胞中miR-93-5p显著减少（P0.05）；与TFRD+NCmimic组比较，TFRD+miR-93-5p组成骨细胞中miR-93-5p增加683.2023年8 月第43卷第8 期口腔医学A2.0-1d-3d5d1.51.0#0.5#0.0对照组TFRD组TFRD+NCmimic组TFRD+miR-93-5pmimic组TFRD+B对照组TFRD组TFRD+NCmimic组miR-93-5pmimic组10Annexin V-FITCC10r8#对照组TFRD组TFRD+NCTFRD+mimic组miR-93-5pmimic组A：CCK-8 检测牙槽骨成骨细胞增殖情况;B：流式细胞术检测牙槽骨成骨细胞调亡情况；C：牙槽骨成骨细胞调亡统计结果；*：与对照组比较,P0.05;#：与TFRD+NCmimic比较,P0.05图4miR-93-5p对TFRD调控牙槽骨成骨细胞增殖和凋亡的影响Fig.4Effect of miR-93-5p on TFRD regulation ofosteoblast proliferation and apoptosis in alveolar bone(P0.05）；与对照组比较，TFRD组成骨细胞中FZD6、D i s h e v e l l e d 和-catenin的表达显著增加，激活WNT通路（P0.05）；与TFRD+NCmimic组比较,TFRD+miR-93-5p组成骨细胞中FZD6、D i s h e v e l l e d和-catenin的表达减少，抑制WNT通路的激活(P0.05),见图 6。3讨论种植体被广泛用于临床牙列缺损及牙列缺失的修复治疗。据研究，骨再生过程中牙槽骨成骨细胞的增殖和分化可有效提高种植体的骨结合率 15在正常生理条件下，成骨细胞在成骨过程中经历4个主要阶段，即细胞增殖、基质成熟、矿化和凋亡 16 。基质成熟阶段以ALP和COL1A1表达增加为特征，矿化阶段以OCN表达和ALP活性增加为特征 17 。RUNX2是成骨细胞分化的标志，它激活下游成骨基因的表达，在调节骨代谢和骨形成中发挥重要作用 18 。Osteriex是成骨细胞分化和骨形成的转录因子,仅在骨组织发育过程中特异性表达,与成骨细胞的分化和成熟直接相关 19。因此有效促进牙槽骨成骨细胞的增殖和分化,抑制凋亡,有助于种植体的骨整合。近年来中医药在种植体骨整合治疗方面的研究越来越多，有研究表明TFRD可以促进成骨细胞增殖和ALP的活性，从而增加骨形成 2 0 。黄晓菲等 2 1 发现,TFRD对大鼠牙髓干细胞B()100rA对照组TFRD组TFRD+NCmimic组TFRD+miR-93-5pmimic组8060402050.um对照组TFRD组TFRD+NCmimic组CTFRD+miR-93-5pmimic组55Osterlex44RUNX23322GAPDH对照组TFRD组对照组TFRD组对照组TFRD组TFRD+NCmimic组TFRD+miR-93-5pmimic组TFRD+NCmimic组TFRD+NCmimic组TFRD+miR-93-5pmimic组TFRD+miR-93-5pmimic组A：牙槽骨成骨细胞ALP染色情况（200）；B：牙槽骨成骨细胞中ALP活性检测情况；C：W e s t e r n b l o t 检测牙槽骨成骨细胞中Osteriex和RUNX2的蛋白表达水平；*：两组间比较，P0.05图5miR-93-5p对TFRD调控牙槽骨成骨细胞中ALP、O s t e r i e x 和RUNX2的表达的影响Fig.5Effect of miR-93-5p onTFRD regulation of ALP,Osteriex,and RUNX2 expression in alveolar bone osteoblasts684申晓靖，等.骨碎补总黄酮对口腔种植骨槽骨成骨细胞增殖和调亡的影响研究1.5r44433FZD631.0Dishevelled220.5-cateninGAPDH0.0L0对照组对照组对照组对照组对照组TFRD组TFRD组TFRD组TFRD组TFRD组TFRD+NCmimic组TFRD+NCmimic组TFRD+miR-93-5p mimic组A:RT-qPCR检测牙槽骨成骨细胞中miR-93-5p的表达水平;B：W e s t e r mb l o t 检测牙槽骨成骨细胞中FZD6、D i s h e v e l l e d 和-catenin的蛋白表达水平；*：两组间比较，P0.05图6miR-93-5p对TFRD调控牙槽骨成骨细胞中miR-93-5p、FZD 6、D i s h e v e l l e d 和-catenin的表达的影响Fig.6Effects of miR-93-5p on TFRD regulation of miR-93-5p,FZD6,Dishevelledand-catenin expressioninalveolarboneosteoblasts成骨分化有促进作用，其可能作用依赖于PI3KVAKT信号通路。此外，TFRD可降低大鼠牙槽骨周围的骨钙素水平，增加牙槽骨密度并降低牙周炎症 2 2 。然而,有关TFRD对牙槽骨成骨细胞的研究还尚未见报道。本研究发现，TFRD处理显著促进牙槽骨成骨细胞的增殖,且10 0 mg/L的TFRD疗效最好。因此，选择50 mg/L（低剂量）和10 0 mg/L（高剂量）的TFRD用于后续研究。结果显示，TFRD处理显著抑制成骨细胞调亡，促进成骨分化相关基因ALP、O s t e r i e x 和RUNX2的表达，且高剂量的TFRD疗效显著优于低剂量的TFRD。以上数据表明,TFRD促进种植体骨整合的机制可能与其促进牙槽骨成骨细胞增殖和分化,抑制细胞凋亡有关。既往研究发现，miR-93-5p在骨质疏松患者的成骨细胞中表达上调，其表达水平与骨矿物质密度呈线性相关 2 3。此外miR-93通过调控Osterix削弱成骨细胞的矿化和成熟 2 4。早先我们的研究发现，FZD6是miR-93-5p的下游靶标。FZD6是WNT/-catenin信号通路重要成分。FZD6通过激活WNT信号通路，促进成骨细胞的增殖和分化 14,2 5。本研究发现,miR-93-5p的表达水平随着TFRD浓度的升高而降低,FZD6的表达水平随着TFRD浓度的升高而增加，WNT信号通路被激活，Dishevelled和-catenin的表达显著增加。过表达miR-93-5p逆转TFRD对成骨细胞的增殖、调亡和成骨分化的作用，提示TFRD调控成骨细胞增殖、调亡和分化的作用机制可能与miR-93-5p/FZD6/WNT通路有关。综上所述，TFRD通过调控miR-93-5p/FZD6/WNT通路促进牙槽骨成骨细胞的增殖和成骨分化，抑制成骨细胞凋亡。此外，TFRD有广泛的药理活性,其可作为潜在的口腔工程和骨整合的新型候选药物。然而，本研究仅停留在细胞实验探讨TFRD的作用及其机制，仍需动物实验进行深人验证，以期为临床应用提供坚实的理论基础参考文献1van Oirschot BAJA,Zhang Y,Alghamdi HS,et al.Surface engi-neering for dental implantology:Favoring tissue responses alongthe implantJ.Tissue Eng Part A,2022,28(11/12):555-572.2Zhao K,Wang F,Huang W,et al.Comparison of dental implantperformance following vertical alveolar bone augmentation withalveolar distraction osteogenesis or autogenousonlay bone grafts:Aretrospective cohort 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