机械加载上调Piezo1促进废用性骨质疏松小鼠的血管生成.pdf

论 著文章编号（23）5-0514-07机械加载上调 Piezo1 促进废用性骨质疏松小鼠的血管生成孟尧1，王雪彤2，李心乐1，张平1，3，4（1.天津医科大学基础医学院人体解剖与组织胚胎学系，天津300070；2.天津医科大学基础医学研究中心，天津300070；3.卫生部激素与发育重点实验室，天津市代谢性疾病重点实验室，天津300134；4.天津市脊柱脊髓重点实验室，天津300052）摘要 目的：探究机械加载通过调控Piezo1对废用性骨质疏松（DOP）小鼠血管形成的影响。方法：63只SPF级雌性C57BL/6小鼠按照随机数字表法分成假手术组（Sham组，n=21）、废用性骨质疏松组（DOP组，n=21）和废用性骨质疏松机械加载组（DOPL组，n=21）。通过鼠尾悬吊方式建立DOP小鼠模型，并使用本课题组自行研制的机械加载装置对小鼠进行为期2周的力学刺激治疗（条件为1 N，5 Hz，6 min/d）。墨汁灌注和细胞免疫荧光实验观察骨血管生成情况，免疫组织化学染色和Western印迹方法检测DOP小鼠骨组织内Piezo1表达情况。通过沉默细胞内Piezo1来验证其对H血管生成的影响。结果：与Sham组相比，DOP组骨量减少（t=9.553，P0.001），而DOPL组骨量增加（t=-9.365，P0.001）。同Sham组相比，DOP组 骨组织内血管下降（t=9.764，P0.001）；而与DOP组相比，DOPL组骨组织内血管增加（t=10.001、9.764，均P0.001），CD31和Emcn的表达升高（t=4.453、9.223，均P0.01）。免疫组化显示，与DOP组相比，DOPL组Piezo1表达升高（t=6.557，P0.01）；Western印迹分析结果表明，与DOP组相比，DOPL组Piezo1表达增加（t=4.803，P0.01）。沉默Piezo1降低了机械加载对H血管相关因子CD31和Emcn表达的促进作用。结论：机械加载可以通过促进Piezo1表达促进血管生成，抑制废用性骨质疏松小鼠骨量丢失。关键词机械加载；废用性骨质疏松；血管生成；H血管；Piezo1中图分类号R68文献标志码Mechanical loading promotes angiogenesis by up-regulating Piezo1 in disuse osteoporosis miceMENG Yao1，WANG Xue-tong2，LI Xin-le1，ZHANG Ping1，3，4（1.Department of Anatomy and Histology，School of Basic Medical Sciences，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China;2.BasicMedical Research Center，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China；3.Key Laboratory of Hormones and Development（Ministryof Health），Tianjin Key Laboratory of Metabolic Diseases，Tianjin 300134，China;4.Tianjin Key Laboratory of Spine and Spinal Cord，Tianjin 300052，China）AbstractObjective：To explore the effect of mechanical loading on angiogenesis in disuse osteoporosis（DOP）mice by regulating Piezo1.Methods：According to the method of random grouping，sixty-three SPF female C57BL/6 mice were divided into sham operation group（Shamgroup，n=21），disuseosteoporosisgroup（DOPgroup，n=21），and disuse osteoporosis mechanical loading group（DOPL group，n=21）.TheDOP mouse model was established by tail suspension，and the mechanical loading equipment which designed by our research groupwas used to treat the mice for two weeks（1 N，5 Hz，6 min/d）.The bone angiogenesis was observed by ink perfusion and cellimmunofluorescence.The expression of Piezo1 was detected by immunohistochemical staining and Western blotting in the bone tissue ofDOP mice.The effect of Piezo1 on H vessels was further verified by silencing intracellular Piezo1.Results：Compared with Sham group，bone mass in DOP group was decreased（t=9.553，P0.001），while the bone mass of the DOPL group mice was increased（t=-9.365，P0.001）.Compared with Sham group，the blood vessels in bone tissue of DOP group was decreased（t=9.764，P0.001）.Compared withDOP group，DOPL group improved the decrease of blood vessel increase in bone tissue（t=10.001，9.764，both P0.001），and increased theexpressions of CD31 and Emcn（t=4.453，9.223，both P0.01）.Compared with the DOP group，immunohistochemistry showed that theDOPL group enhances Piezo1 expression（t=6.557，P0.01）.Western blotting analysis showed that，compared with the DOP group，theDOPL group further validated the increased Piezo1 expression（t=4.803，P0.01）.Silencing Piezo1 reduced the promotion of mechanicalloading on the expression of H vascular related factors CD31 and Emcn.Conclusion：Mechanical loading can promote angiogenesis andinhibit bone loss in disuse osteoporosis mice through Piezo1.Key wordsmechanical loading；disuse osteoporosis；angiogenesis；H vessels；Piezo1基金项目 国家自然科学基金资助项目（8 1 7 7 2 4 0 5，8 1 5 7 2 1 0 0）作者简介 孟尧（1 9 9 7-），女，硕士在读，研究方向：骨质疏松的治疗机制研究；通信作者：张平，E-m a il：p iz h a n g 2 0 0 8 1 6 3.c o m。天津医科大学学报Journal of Tianjin Medical University第29卷5期23年9月 29熏 5Sep.23514废用性骨质疏松（DOP）多发生于长期卧床或失重状态下（如宇航员），造成严重的骨量丢失，骨代谢失衡，使骨脆性增加，现已成为一个重要的健康问题1。研究表明，骨组 织中有一种特殊的高表达CD31和内皮黏蛋白Emcn的毛细血管（H血管），它是骨重建与血管生成耦联的重要载体，而DOP小鼠模型会导致H血管数量减少2。因此，促进H血管形成可能成为治疗废用性骨质疏松的关键因素。机械加载是一种加载频率低、加载强度小、作用于膝关节等滑膜关节的温和机械刺激，能模拟人体主动运动的物理治疗手段3。前期研究发现机械加载可以促进血管形成、骨形成，用于骨质疏松4-5、骨关节炎6、股骨头坏死7、乳腺癌骨转移8的治疗。Piezo1是一种在生物体内广泛分布的机械敏感离子通道蛋白9，可以将细胞膜上感受到的机械信号转化为电化学信号10。研究表明Piezo1在血管系统中发挥着不可或缺的作用，对 促进血管重塑有重要意义11。前期工作发现机械加载可以通过促进成骨和成血管形成来治疗绝经后骨质疏松4-5，但机械加载对 废用性骨质疏松血管生成的调控作用与其作用媒介尚不清楚。本实验采用鼠尾悬吊方式建立废用性骨质疏松小鼠模型，探究Piezo1是否可能作为机械加载调控靶点来改善骨微环境中的血管形成，为物理治疗废用性骨质疏松提供新的见解。1材料与方法1.1材料1.1.1实验动物使用63只SPF级雌性C57BL/6小鼠（16周龄，体重1820 g，中国军事医学科学院动物中心）。实验小鼠根据随机数字表法分为3组：假手术组（Sham组，n=21）、废用性骨质疏松组（DOP组，n=21）和废用性骨质疏松机械加载组（DOPL组，n=21）。在25C的室温且无病原体条件下，将小鼠置于12 h的明暗循环中，自由摄取饲料和水。所有实验根据天津医科大学实验动物管理规定进行，并经天津医科大学伦理委员会批准。1.1.2主要仪器和试剂ST2细胞系购买自美国Lonza公司。石蜡切片机（RM255）购买自德国Leica公司。光学显微镜BX53购买自日本Olympus公司。DMEM培养基购自美国Gibco公司。EGM-2培养基购自美国Lonza公司。抗体Piezo1购自美国Cell Signaling Technology公司。CD31一抗购自中国proteintech公司。Emcn、-actin一抗购自美国Sigma公司。墨汁购自中国北京索莱宝公司。胎牛血清、青霉素、链霉素和胰蛋白酶购自美国Invitrogen公司。Piezo1 siRNA基因干扰载体的构建和筛选自上海吉玛公司。1.2方法1.2.1鼠尾悬吊小鼠模型如前所述进行尾部悬吊12。实验小鼠配备了定制的绑带，并悬挂在定制笼子中的高架滑轮系统中。调整小鼠的位置，保证头低位30尾悬吊，后肢不接触地面，前肢与笼子的地板接触并保持可以用前肢在笼子里行走（图1A）。1.2.2机械加载在机械加载治疗过程中，用1.5%异氟烷对 小鼠进行吸入式麻醉。小鼠侧卧于加载台上，使用自主研发的机械加载装置（内源性干细胞治疗仪，专利号：ZL201621010131.9）实施治疗13。每天对 双侧膝关节分别进行侧向加载（图1B），加载力为1 N，加载频率为5 Hz，小鼠每侧膝关节加载时长为3 min，共6 min，持续治疗2周。加载时，加载面与膝关节内外侧面相接触，调节合适的松紧度保证治疗效果并确保膝关节血运通畅，合格标准为在踝关节动脉可感受到节律性跳动。同时假手术组和废用性骨质疏松造模组 小鼠被麻醉并定位在加载台上，而不接受机械加载治疗，实验结束后全部小鼠处死并取材。1.3组织学分析1.3.1组 织处理小鼠在造模2周后进行人道主义处死。剥离小鼠后腿，剔除皮肤、软组 织及韧带，分离股骨、胫骨组 织。将骨组 织标本浸没于10%中性福尔马林中固定2 d后，在14%的EDTA中脱钙2周。将骨组织标本用石蜡包埋，进行冠状位切片，厚度为5 m。1.3.2免疫组 织化学染色使用石蜡包埋的小鼠股骨标本（每组n=6），石蜡切片经过脱蜡和水化后加入适量内源性过氧化物酶阻断剂，室温孵育10 min。然后将切片与抗Piezo1的一级抗体在4下孵育过夜，滴加适量反应增强液，室温孵育20 min后滴加适量强酶标山羊抗兔IgG聚合物，室温孵育20 min。最后滴加适量的配置新鲜DAB液（浓缩DAB液50 L+DAB底物液1 mL），室温孵育210 min，出现明显棕色即可。在正置显微镜下观察、拍照 并AB注：A：鼠尾悬吊实物图；B：机械加载实物图图1鼠尾悬吊和机械加载示意图Fig 1Mice tail suspension and mechanical loading diagram孟尧，等.机械加载上调Piezo1促进废用性骨质疏松小鼠的血管生成第5期515测量，选取股骨远端生长板近端（距生长板近端约0.8 mm）1.6 mm2的长方形区域为目标区域，拍照 定量分析Piezo1的水平。1.3.3墨汁灌注首先麻醉动物，将治疗2周的动物（每组n=6）腹腔注射10%水合氯醛（每只小鼠3 mL/kg的剂量注射）进行麻醉。然后将小鼠四肢固定用肝素生理盐水灌注心脏（每只小鼠生理盐水用量约为30 mL）。抽取墨汁灌注液并进行左心室灌注至动物皮肤黏膜全部变黑为止（每只小鼠灌注液用量约为50 mL）。灌注成功后，处死动物，将动物静置于4，24 h。进行石蜡切片处理，切片厚度为15 m。使用中性树胶封片并在正置显微镜下进行观察、拍照，然后进行统计学分析。1.4细胞学实验1.4.1细胞分离培养人道主义处死动物，分离小鼠（每组n=3）双侧髂骨、股骨、胫骨，剥离皮肤、肌肉及周围韧带，保留完整髂骨、股骨和胫骨，将其用灭菌1PBS溶液清洗后浸于含有2%胎牛血清的MEM-溶液中。使用灭菌的剪刀剪开髂骨、股骨、胫骨的两端。暴露骨髓腔，采用5 mL含有2%胎牛血清的MEM-溶液的注射器冲取骨髓，使用含有2 mLFicoll无菌离心管过筛细胞，室温下离心。离心后，弃上清液，进行细胞计数，再次离心，获得骨髓来源细胞。1.4.2内皮祖细胞的诱导实验将得到的骨髓单个核细胞使用含有20%胎牛血清的EGM-2培养基，重悬并种于6孔板中，恒温培养箱孵育48 h后换液，更换新的EGM-2培养基。诱导时长大约10 d，在倒置显微镜下动态观察直至细胞形成典型的铺路石样形态。1.4.3细胞转染Piezo1siRNA基因干扰载体（正义链：5-GUCUACAAGAACUUCGAGATT-3，反义链：5-UCUCGAAGUUCUUGAGACTT-3）。NC组为siRNANC基因干扰载体（正义链：5-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3，反义链：5-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3）。将处于对 数生长期的内皮祖细胞和ST2细胞接种在无菌6孔板中，密度调整为1105个/cm2。约2436 h后，当细胞密度达到60%80%时，加入转染试剂和无双抗体培养基。4 h后，更换完整的培养基进行下一步实验。为了验证Piezo1的沉默效率，使用构建的Piezo1 siRNA转染ST2细胞，通过细胞免疫荧光和Western印迹检测Piezo1siRNA的沉默效率。1.4.4细胞免疫荧光首先使用预冷的80%乙醇溶液固定细胞浸泡30 min，再更换遇冷的无水乙醇浸泡30 min，1 mL/孔，然后用0.5%Triton X-100室温浸泡10 min进行细胞穿透，PBS清洗后，加入10%胎牛血清进行封闭，室温孵育1 h，PBS清洗后将细胞置于Piezo1一抗（1500）中孵育过夜（4），再使用荧光二抗（1500）室温孵育1 h，最后用DAPI染色液染核后，在载玻片上滴加适量抗荧光淬灭剂进行封片，并在荧光显微镜下观察细胞。分别使用不同通道拍摄并Merge图像。1.5Western印迹分析在RIPA裂解缓冲液中提取股骨蛋白，采用一抗Piezo1（11 000）和-actin（110 000）在4C过夜孵育。二抗室温（110 000）孵育90 min后，将增强型化学发光试剂盒中显影液和定影液11混合后反复冲洗目的条带，使用化学发光成像系统曝光并通过Image J软件分析各组 蛋白条带的灰度值。1.6统计学处理使用IBM SPSS Statistics 25统计软件进行数据分析，并采用Graphpad Prism7软件进行统计图制作。符合正态分布的计量数据采用表示。单因素方差分析（ANOVA）用于多组间的比较，最小显著差法（LSD-t检验）用于两组比较。P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1机械加载改善DOP小鼠的骨量的检测HE染色显示（图2），与Sham组 相比，DOP组 骨小梁的面积和总面积的比值显著降低（t=9.553，P0.001）。而DOPL组 结果显示，与DOP组 相比，骨小梁的面积和总面积的比值增加（t=-9.365，P0.001）。注：*P0.001；Sham组：假手术组；DOP组：废用性骨质疏松组；DOPL组：废用性骨质疏松机械加载组图2股骨远端的HE染色形态学检查（100，Bar=200 m）Fig 2Morphological examination of distal femur by HE staining（100，Bar=200 m）Sham组DOP组DOPL组3020100Sham组DOP组DOPL组骨小梁的面积/总面积（%）*第29卷天津医科大学学报5162.2机械加载对DOP小鼠血管生成的影响墨汁灌注实验结果显示（图3），与Sham组相比，DOP组骨组 织血管面积显著下降（t=9.764，P0.001）；而与DOP组 相比，DOPL组 骨组 织血管面积显著增加（t=10.001，P0.001）。荧光双染实验结果显示（图4），与Sham组 相比，DOP组CD31（t=6.377，P0.001）与Emcn（t=6.258，P0.001）的表达水平降低，同时，其共表达水平也降低（t=9.223，P0.001）；而与DOP组 相比，DOPL组 中CD31（t=6.619，P0.001）和Emcn（t=4.624，P0.01）的表达水平升高，并且其共表达水平也相应升高（t=4.453，P0.01）。2.3机械加载对DOP小鼠Piezo1信号表达的促进作用与Sham组 相比，DOP组 股骨远端Piezo1的表达水平下降（t=7.604，P0.01）；与DOP组 相比，DOPL组Piezo1的表达显著升高（t=6.557，P0.01），如图5所示。Western印迹结果显示，与Sham组相比，DOP组Piezo1蛋白表达水平降低（t=15.977，P0.001）；与DOP组 相比，DOPL组Piezo1蛋白的表达水平升高（t=4.803，P0.01），如图6所示。注：*P0.001；Sham组：假手术组；DOP组：废用性骨质疏松组；DOPL组：废用性骨质疏松机械加载组图3墨汁灌注实验检测机械加载对小鼠血管生成的影响（200，Bar=100 m）Fig 3The effect of mechanical loading on angiogenesis was detected by ink perfusion experiment in mice（200，Bar=100 m）注：*P0.001；*P0.01；Sham组：假手术组；DOP组：废用性骨质疏松组；DOPL组：废用性骨质疏松机械加载组图4荧光双染实验检测机械加载对小鼠H血管生成的影响（100，Bar=200 m）Fig 4The effect of mechanical loading on H vessels was detected by fluorescence double staining experiment in mice（100，Bar=200 m）MergeDOP组DOPL组806040200Sham组DOP组DOPL组Sham组DOP组DOPL组50403020100Sham组DOP组DOPL组Sham组DOP组DOPL组Sham组EmcnCD31DAPI100806040200Sham组DOP组DOPL组100806040200血管面积/总面积*阳性面积/总面积（%）CD31阳性面积/总面积（%）Emcn阳性面积/总面积（%）*孟尧，等.机械加载上调Piezo1促进废用性骨质疏松小鼠的血管生成第5期5172.4机械加载通过调控Piezo1影响H血管的生成免疫荧光结果表明，与未转染Piezo1 siRNA组相比，Piezo1 siRNA转染后可以显著降低细胞中Piezo1表达（t=16.203，P0.001，图7）。Western印迹进一步验证了这一实验结果（t=14.617，P0.001，图8）。免疫荧光染色检测CD31和Emcn的表达，结果显示，与未转染Piezo1 siRNA组 相比，Piezo1 siRNA转染后小鼠内皮祖细胞中CD31（t=-7.508、-4.809、-13.538，均P0.01）和Emcn（t=4.999、11.319、9.421，均P0.01）表达显著减少，并且CD31和Emcn的共表达降低（t=12.949、2.580、7.727，均P0.05）；而在转染Piezo1 siRNA后，DOP组 与DOPL组 在CD31和Emcn的表达及共表达方面无统计学差异，如图9所示。注：*P0.01；Sham组：假手术组；DOP组：废用性骨质疏松组；DOPL组：废用性骨质疏松机械加载组图5免疫组织化学检测各组Piezo1的表达（400，Bar=50 m）Fig 5The expression of Piezo1 in each group was detected by immunohistochemistry（400，Bar=50 m）注：*P0.001；NC组：对 照 组；Piezo1 siRNA组：沉默Piezo1组图8Western印迹检测Piezo1沉默效率Fig 8Westernblotting was used to detect the silencing efficiency ofPiezo1DOP组DOPL组Sham组Plezo10.80.60.40.20.0Sham组DOP组DOPL组Sham组DOP组DOPL组Piezo1-actin1.51.00.50.0Sham组DOP组DOPL组Piezo1 siRNA组NC组Piezo1DAPIMerge806040200Piezo1 siRNA组NC组注：*P0.01；*P0.001；Sham组：假手术组；DOP组：废用性骨质疏松组；DOPL组：废用性骨质疏松机械加载组图6Western印迹检测各组Piezo1表达水平Fig 6Western blotting was used to detect the expression of Piezo1in each group注：*P0.001；NC组：对 照 组；Piezo1 siRNA组：沉默Piezo1组图7免疫荧光检测各组Piezo1沉默效率（200，Bar=100 m）Fig 7The silencing efficiency of Piezo1 in each group was measured by immunofluorescence（200，Bar=100 m）Piezo1 siRNA组NC组Piezo1-actin1.51.00.50.0Piezo1 siRNA组NC组*Piezol相对 表达*Piezo1阳性细胞（%）Piezo1在ST2中相对 表达骨组织Piezo1相对 表达*第29卷天津医科大学学报5183讨论DOP是由于运动能力受限或功能障碍而引起骨量减少，骨破坏与骨形成失衡的一种继发性骨质疏松14。主要表现为骨痛、骨脆性增加、骨折风险提高，给患者、家庭以及社会造成巨大负担15。总之，骨质疏松迫切需要一种无创温和的治疗手段来预防和治疗该疾病的发生、发展。研究表明，骨质疏松的治疗是一个综合康复的过程，全身振动的运动训练方式是一种非药物性抗骨质疏松有效的方法16。这种运动训练可以减少长时间卧床导致的骨丢失，达到增加骨密度的目的17。机械加载作为一种可模拟主动运动的被动物理康复治疗方式，能够促进成骨抑制破骨并减缓骨质疏松的骨质流失，影响骨髓间充质干细胞分化，调节血管生成，达到治疗绝经后骨质疏松的目的4-5。本实验聚焦于DOP鼠尾悬吊小鼠模型，模拟空间微重力环境，探究机械加载对 废用性骨质疏松小鼠血管形成的影响。笔者认为机械加载可能是通过周期循环的力学刺激和骨应力变化，引起骨髓腔内压改变、骨质内液体流动与分子转运，从而改善DOP小鼠由于失重导致的骨质流失和血管减少。该实验证明了膝关节机械加载可能作为一种有效的物理康复治疗方式来缓解废用性骨质疏松。Piezo1作为一种机械敏感离子通道蛋白，能够感受相应力学信号，在骨疾病治疗中具有重要作用18。有研究表明在生物力学环境中，Piezo1可以促进骨组织血管生成，达到促进骨折愈合的目的19。在此基础上，本实验探究机械加载刺激下Piezo1蛋白的表达情况，通过免疫组 织化学染色与Western印迹实验证明了机械加载可以促进DOP小鼠中Piezo1表达。研究发现H血管作为骨髓中一类特殊的血管，耦联了血管生成和骨形成，可能是治疗骨质疏松的重要靶点20。并且，笔者之前的研究发现机械加载可以促进绝经后骨质疏松小鼠中H血管的表达，达到治疗骨质疏松的目的4-5。本研究机械加载可以促进DOP小鼠骨量增加和血管生成，并通过内皮祖细胞免疫荧光实验发现机械刺激改善了DOP小鼠中H血管相关因子CD31和Emcn的表达，同时，促进DOP小鼠中CD31和Emcn的共表达。为了验证Piezo1对CD31和Emcn的影响，笔者注：*P0.05；*P0.001；Sham组：假手术组；DOP组：废用性骨质疏松组；DOPL组：废用性骨质疏松机械加载组图9荧光双染检测Piezo1 siRNA对H血管生成的影响（100，Bar=200 m）Fig 9The effect of Piezo1 siRNA on H vessels was detected by fluorescence double staining（100，Bar=200 m）MergeDOP组DOPL组806040200Sham组DOP组DOPL组Sham组EmcnCD31DAPI100806040200Piezo1 siRNASham组DOP组DOPL组Sham组DOP组DOPL组Sham组DOP组DOPL组806040200NormalPiezo1 siRNACD31阳性面积/总面积（%）Emcn阳性面积/总面积（%）阳性细胞/总面积（%）*ns*ns*ns孟尧，等.机械加载上调Piezo1促进废用性骨质疏松小鼠的血管生成第5期519沉默了内皮祖细胞中的Piezo1，通过免疫荧光实验观察到，沉默Piezo1抑制了CD31和Emcn的表达和共表达，证明Piezo1对H血管的形成具有调控作用。并且，笔者发现沉默Piezo1后，DOP组与DOPL组在CD31和Emcn的表达及共表达方面无统计学差异，该结果表明机械加载是通过Piezo1为媒介来调控H血管相关因子CD31和Emcn的表达。以上结果表明，机械加载可能通过促进骨组织中Piezo1的表达，促进H血管相关因子CD31和Emcn的表达以及血管形成，达到治疗DOP的目的。综上所述，本研究表明机械加载通过促进Piezo1的表达，调控骨血管生成。但机械加载对 骨血管微环境的调控机制尚不明确，还需进一步探究。本研究提示机械加载可以作为DOP的一种新的治疗方法，为临床治疗DOP提供理论依据。参考文献：1ROLVIEN T，AMLING M.Disuse osteoporosis：clinical and mechanistic insightsJ.Calcif Tissue Int，2022，110（5）：592-604.2 LIANG S，LING S，DU R，et al.The coupling of reduced type H vessels with unloading-induced bone loss and the protection role ofPanax quinquefolium saponin in the male miceJ.Bone，2021，143：115712.3 LI X，LIU D，LI J，et al.Wnt3a involved in the mechanical loading onimprovement of bone remodeling and angiogenesis in a post menopausal osteoporosis mouse modelJ.FASEB J，2019，33（8）：8913-8924.4 ABDURAHMAN A，LI X，LI J，et al.Loading-driven 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