福建漳州草莓根腐病发病土壤微生物群落结构.pdf

第 48 卷 福建热作科技 Vol.48 No.2 第 2 期 Fujian Science&Technology of Tropical Crops 2023 9 福建漳州草莓根腐病发病土壤微生物群落结构 戴瑞卿，赖宝春*，曾天宝 漳州市农业科学研究所，福建漳州 363005 摘要?采用 Illumina Miseq 高通?测序技术?析福建漳?同县区草莓发病后土壤微生物群落结构的?结?发?颜厝镇和安厚镇草莓发病土壤和?常土壤?品优势细菌门均是?形菌门?Proteobacteria?拟杆菌门?Bacteroidetes?酸杆菌门?Acidobacteria?和放线菌门?Actinobacteria?优势真菌门均是子囊菌门?Ascomycota?被孢霉门?Mortierellomycota?和担子菌门?Basidiomycota?颜厝镇草莓发病土壤?品细菌和真菌的丰富度和多?性降?安厚镇草莓发病土壤细菌和真菌丰富度和多?性升高?发病土壤?效磷和?效钾含?显著高于?常土壤?而土壤 pH?于?常土壤?Spearman?析结?表明?拟杆菌门?土壤的?效磷和?效钾含?呈负相关?绿弯菌门?土壤的 pH 值呈?相关?担子菌门?土壤的?效磷和?效钾呈负相关?被孢霉门?土壤的?效磷和?效钾含?呈?相关?研究表明草莓?腐病发病?土壤微生物群落结构改?土壤微生态失衡?关?效?治草莓?腐病提供理论依据?关键词?高通?测序?土壤微生物群落?草莓?腐病?土壤理?性质 中图分类号?S436.68+4 文献标识码?A 文章编号?10062327?2023?02000906 草莓 Fragaria ananassa Duchesne.属于蔷薇科多?生草本植物?丰富的营养和较高的?济?值.近?来?的草莓产?一直处于世界首?1?随着产业的发展?草莓?部病害逐?加重?由土传病原真菌引起的?腐病是最重要的草莓?部病害之一?对草莓的生产?极大的危害?重阻碍了草莓产业的发展2-3?同地区草莓?腐病发生的原因和病原菌存在较大差异?病原真菌是草莓?腐病发生的原因之一?病原真菌?要?菌属 Rhizoctonia sp.?镰刀菌属 Fusarium sp.?拟盘多毛孢属 Pestalotiopsis sp.?疫霉属 Phytophthora sp.等4?土壤微生物是土壤生态系统的重要组?部?植物的生长?土壤微生物群落结构?多?性?着紧密的联系5-6?植物?际是一个复杂的微生态系统?是?系?土壤?微生物?者紧密结合并相互交流的场所?际微生物通过参?生态系统中物质转?和循?植物相互作用?对植物的?常生长和土壤肥力的提高?同的影响?因?土壤微生物群落结构的?草莓?腐病发生密?相关7-8?目前?关于草莓土壤微生物的研究大部?于?验室的?离?养及鉴定等传统的研究方法?能反?的微生物类别较?限?而高通?测序技术?以更加真?效地反映土壤?品的微生物群落结构9-10?本研究采用 Illumina MiSeq 高通?测序技术?析漳?草莓?腐病发病土壤和?常生长土壤微生物群落结构差异?探明?草莓?腐病发生的关系?效?治草莓?腐病提供依据?1 材料?方法 1.1 供试材料 2020?3?从福建省漳?高?区颜厝镇?YC?和?和县安厚镇?AH?的草莓种植地设置采?点?别从草莓?常生长?CK?和草莓?腐病发生?重的地块中?随机选?3 个小区作?3 次重复?个小区选?5 株长势较?一?的草莓?去除植株残?再将草莓植株连同?部土壤一同拔出?将收集到的土壤混匀视?1 个?品?将采集获得的土壤?品一部?生工生物工程?份?限公司进行高基金项目?福建省科技计划项目?2019N0053?作者简介?戴瑞卿?1990?女?硕士?研究?习员?主要从事有益微生物筛选?植物病害生物防治研究?邮箱?*通讯作者?赖?春?1979?女?硕士?副研究员?主要从事有益微生物筛选及植物病害生物防治研究?邮箱?第 48 卷 福建热作科技 Vol.48 No.2 第 2 期 Fujian Science&Technology of Tropical Crops 2023 10通?测序?剩余土壤自然风?随后用 100 目网筛过筛?用于土壤理?性质的测定?1.2 土壤理化性质测定 土壤碱解氮含?采用碱解扩散法测定?土壤?机质含?采用重铬酸钾容?法凌稀释热法测定?土壤?效磷含?采用碳酸氢?提凌钼锑抗比色法测定?土壤?效钾含?采用乙酸铵?提凌火焰光度计法测定?土壤 pH 采用无 CO2蒸馏水?提凌pH 计电?法测定11?1.3 样品 DNA 提取?品 DNA 提?由生工生物工程?份?限公司提供?参照 E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit试剂?Omega?M5635-02?操作说明进行抽提?用琼脂糖凝胶电泳检测 DNA?整性?Qubit 3.0 DNA检测试剂?Life?Q10212?定?检测 DNA?本浓度?1.4 16S rDNA文库构建及测序 以 检 测 合 格 的 DNA?品?模 板?341F?5-CCTACGGGNGGCWGCAG-3?和 805R?5-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3?引物进行土壤细菌16S rRNA?因的V3-V4区目标?段的扩增?同?以检测合格的DNA?品?模板?ITS1F?5-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3?和ITS2R?5-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3?引物进行土壤真菌ITS区目标?段的扩增?使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂?AXYGEN,AP-GX-50G?胶回收PCR产物?用Qubit 3.0荧光定?仪?Invitrogen,Q32866?进行16S rDNA文?浓度测定?按1:1等?混合后?采用Illumina公司的Hiseq 2500?测序进行高通?测序?1.5 测序数据处理?分析 利用软?Mother?version 1.30.1?计算各土壤?品的Chao指数?香?指数和辛?森指数等?析土壤?品的Alpha多?性?采用RDP classifier贝叶?算法?version 2.12?进行物种?类?在门和属水?对各土壤?品的物种组?及差异进行?析?利用Usearch软?version 11.0.667?在相似度?97%的?础?对非重复序列进行OTU聚类?利用Canoco软?进行?同土壤?品的冗余?析?用R软?进行?视?采用Excel和SPSS软?进行数据统计?析?2 结果?分析 2.1 土壤理化性质 对颜厝镇和安厚镇草莓发病区土壤和?常土壤的理?性质进行?析?结?发?个地区的草莓发病土壤pH值显著?于?常土壤?效磷?效钾?机质和碱解氮含?显著高于?常土壤?表1?表 1 土壤样品理化性质 供式土?pH?效磷?mg/kg?效钾?mg/kg?机质?mg/kg?碱解氮?mg/kg?YC 6.200.08b 416.621.00a 404.571.27b 24.521.00b 293.490.94b YCCK 7.110.05a 154.481.12c 221.371.17c 18.721.05c 118.260.97c AH 5.210.09d 268.201.09b 685.231.18a 26.340.96a 414.741.53a AHCK 5.650.07c 141.491.16d 214.460.77d 19.670.61c 121.705.69c 注?YC?YCCK?AH?AHCK分别表示颜厝镇草莓发病区土壤?颜厝镇草莓正常生长区土壤?安厚镇草莓发病区土壤?安厚镇草莓正常生长区土壤?同一列的?同的小写字母表示?同土壤样品间在P0.05水?具有显著差异?2.2 微生物群落多样性分析 原始数据?质控处理后?别获得807159条高质?细菌序列?段和649322条高质?真菌序列?段?细菌序列?均长度?418 bp?真菌序列?均长度?231 bp?别对?个地区草莓发病和?常土壤的细菌和真菌多?性指数进行差异?析?表2?结?表明?YC草莓发病土壤细菌和真菌的Chao指数和香?指数均?于?常土壤?辛?森指数高于?常土壤?而AH草莓发病土壤细菌和真菌的Chao指数和香?指数均高于?常土壤?辛?森指数?于?常土壤?表明YC草第 48 卷 福建热作科技 Vol.48 No.2 第 2 期 Fujian Science&Technology of Tropical Crops 2023 11 莓发病土壤细菌和真菌丰富度和多?性?少?而AH草莓发病土壤细菌和真菌丰富度和多?性增加?表 2 草莓根际土壤细菌和真菌 多样性 供式土?细菌 真菌 Chao 指数 香?指数 辛?森指数 Chao 指数 香?指数 辛?森指数 YC 255128c 6.080.04c 0.0160.002a 65510c 2.880.12c 0.1760.019a YCCK 269224b 6.280.12b 0.0130.003b 68913b 3.730.12b 0.1150.037b AH 279231a 6.530.10a 0.0110.003b 7366a 3.980.14a 0.0980.037b AHCK 246340c 5.980.06d 0.0180.001a 5629d 2.590.13d 0.1960.025a 2.3 微生物群落结构组成 2.3.1 细菌群落结构组?在门水?个地区草莓发病和?常土壤细菌门?要?形菌门?Proteobacteria?蓝细菌门?Cyanobacteria?拟杆菌门?Bacteroidetes?酸杆菌门?Acidobacteria?放线菌门?Actinobacteria?疣微菌门?Verrucomicrobia?绿弯菌门?Chloroflexi?芽单胞菌门?Gemmatimonadetes?浮霉菌门?Planctomycetes?和壁菌门?Firmicutes?等?中?形菌门?拟杆菌门?酸杆菌门和放线菌门?优势门?形菌门相对丰度?40.26%48.35%?拟杆菌门相对丰度?6.34%19.38%?酸杆菌门相对丰度?8.46%11.13%?放线菌门相对丰度?2.70%5.54%?在优势菌门中?常土壤相比?YC 草莓发病土壤?形菌门和酸杆菌门的相对丰度降?而拟杆菌门和放线菌门的相对丰度升高?AH 草莓发病土壤?形菌门?拟杆菌门?酸杆菌门和放线菌的相对丰度均高于?常土壤?表明草莓?腐病的发生会影响土壤细菌群落的组?在属水?个地区草莓发病土壤和?常土壤优势细菌属?较明显的差异?YC 草莓发病土壤的优势菌属鞘氨醇单胞菌属?Sphingomonas?假单胞菌属?Pseudomonas?和芽孢杆菌属?Bacillus?的相对丰度高于?常土壤?而黄杆菌属?Flavobacterium?和?鞘氨醇杆菌属?Novosphingobium?相对丰度?于?常土壤?AH 草莓发病土壤优势菌属鞘氨醇单胞菌属和芽单胞菌属?Gemmatimonas?和伯克霍尔德菌属的相对丰度高于?常土壤?而黄杆菌属和?鞘氨醇杆菌属和芽单胞菌属对丰度?于?常土壤?2.3.2 真菌群落结构组?在门水?个地区的草莓?常和发病土壤真菌门?要?子囊菌门?Ascomycota?被孢霉门?Mortierellomycota?和担子菌门?Basidiomycota?子囊菌门相对丰度?15.68%22.61%?被孢霉门相对丰度?1.98%15.42%?担子菌门相对丰度?1.08%5.63%?在优势菌门中?YC 和 AH 发病土壤子囊菌门的相对丰度均?于?常土壤?YC 发病土壤被孢霉门的相对丰度高于?常土壤?AH 发病土壤被孢霉门的相对丰度?于?常土壤?结?表明草莓?腐病的发生会影响土壤真菌群落的组?在属水?个地区草莓发病土壤和?常土壤优势真菌属种类差异明显?中 YC 草莓发病土壤优势菌属玛利亚霉菌属?Mariannaea?的相对丰度高于?常土壤?而帽状菌属?Pilidium?和被孢霉属?Mortierella?相对丰度?于?常土壤?AH 发病?际土壤的优势菌属被孢霉属?鞘孢属?Chalara?和玛利亚霉菌属相对丰度高于?常土壤?而帽状菌属相对丰度?于?常土壤?2.4 土壤微生物 OTU 聚类分析 在相似度?97%的条?获得了?个地区草莓发病土壤和?常土壤 4 个?品的细菌和真菌 OTU数?YC 草莓发病土壤?YC 草莓?常土壤?AH 草莓发病土壤?AH 草莓?常土壤?别获得 2853?2889?2920?2834 个细菌 OTU 和 782?1074?1128?929 个真菌 OTU?如?1 所示?2 个地区草莓发病土壤和?常土壤 4 个?品之间共?2319 个细菌 OTU 和 355 个真菌 OTU?YC 草莓发病土壤?YC 草莓?常土壤?AH 草莓发病土壤?AH 草莓?常土壤各自独?14?29?36?22 个细菌 OTU 和 53?185?158?87个真菌 OTU?第 48 卷 福建热作科技 Vol.48 No.2 第 2 期 Fujian Science&Technology of Tropical Crops 2023 12表 3 草莓根际土壤微生物在门和属水?上的丰度变化/%微生物?类水?YC YCCK AH AHCK 门 属 细菌?形菌门 小计 42.08 48.35 43.84 40.26 鞘氨醇单胞菌 14.05 11.33 9.86 8.07?鞘氨醇杆菌属 4.34 5.23 2.16 4.56 Thermomonas 0.30 1.03 0.18 0.43 假单胞菌属 3.56 1.78 0.92 2.52 伯克霍尔德菌属 2.01 2.48 3.55 0.92 酸杆菌门 小计 8.46 10.03 11.13 8.54 Aridibacter 1.39 2.26 1.17 1.74 放线菌门 小计 5.25 2.70 5.54 2.83 链霉菌属 1.64 0.96 1.33 0.89 拟杆菌门 小计 10.23 6.34 19.38 16.09 Niastella 0.25 0.62 0.23 0.57 Flavisolibacter 1.36 1.05 1.14 1.07 Pedobacter 0.18 1.27 0.37 1.61 黄杆菌属 4.95 5.63 1.31 8.23 壁菌门 小计 3.07 0.52 1.85 0.74 芽孢杆菌属 2.57 1.35 1.39 0.44 芽单胞菌门 小计 3.11 2.62 4.39 3.17 芽单胞菌属 3.16 2.62 4.58 3.75 蓝细菌门 小计 2.07 0.78 2.76 0.73 Streptophyta 1.58 0.42 1.36 0.27 真菌 子囊菌门 小计 15.68 18.98 20.49 22.61 帽状菌属 1.62 8.09 1.23 7.46 鞘孢属 0.53 1.03 2.41 0.86 玛利亚霉菌属 2.45 1.72 2.32 1.41 被孢霉门 小计 15.42 6.62 1.98 2.92 被孢霉属 1.52 3.81 3.23 1.76 2.5 土壤理化性质?微生物群落相对丰度的相关性 在门水?对?个地区草莓发病土壤和?常土壤微生物群落进行冗余?析?RDA?初?析了土壤理?因子对土壤微生物群落的影响?2?RDA?析结?表明?个轴总共解释了 63.63%的群落?中横轴解释了 44.47%的群落?而纵轴解释了 19.16%的群落?采用 Spearman 相关性?析?对?个地区草莓发病土壤和?常土壤4个?品间的?要微生物?土壤理?性质进行关联?析?表 4?结?表明?优势细菌群拟杆菌门和绿弯菌门以及优势真菌群子囊菌门?担子菌门和?土壤理?性质存在显著相关性?而?形菌门?放线菌门和酸杆菌门?所?理?性质?存在显著相关性?拟杆菌门?碱解氮?效磷和?机质含?呈显著负相关?P0.05?效钾含?呈极显著负相关?P0.01?绿弯菌门?机质含?呈显著?相关?P0.05?pH 呈极显著?相关?P0.01?子囊菌门?pH 和?效钾含?呈显著负相关?P0.05?担子菌门?碱解氮含?呈显著负相关?P0.05?效磷?效钾和?机质含?呈极显著负相关?P0.01?被孢霉门?碱解氮含?呈显著?相关?P0.05?效磷?效钾和?机质含?呈极显著?相关?P0.01?A 图 1 草莓根际土壤细菌?A?真菌?B?Venn 图 B 第 48 卷 福建热作科技 Vol.48 No.2 第 2 期 Fujian Science&Technology of Tropical Crops 2023 13?中 AN?AP?AK?SOM?别表示土壤碱解氮?效磷?效钾?机质 图 2 草莓根际土壤理化性质?微生物群落?门水?的冗余分析 表 4 土壤理化性质?微生物之间的 Spearman 关联分析 微生物种群 土壤理?性质 pH AN AP AK SOM 细菌?形菌门 0.301 0.084 0.335-0.118-0.265 拟杆菌门 0.391-0.622*-0.503*-0.811*-0.643*酸杆菌门-0.112 0.027 0.014 0.426 0.301 放线菌门-0.286 0.650 0.706 0.755 0.671 绿弯菌门 0.455*0.126-0.175 0.252 0.391*真菌 子囊菌门-0.289*0.203 0.136-0.231*-0.049 担子菌门-0.021-0.406*-0.699*-0.573*-0.545*被孢霉门-0.084 0.427*0.671*0.734*0.629*注?AN?AP?AK?SOM分别表示土壤碱解氮?有效磷?速效钾?有机质?*表示在P0.05水?上显著相关?*表示在P0.01水?上极显著相关?3 结论?讨论 土壤微生物作?生态系统的重要组?部?是植物?土壤养?循?代谢的重要因素9,12?土壤中存在大?的微生物?中细菌的种类和数?最多?是微生物中的重要类群13?细菌对动植物和土壤等?多方面的影响?在土壤养?循?肥力保持和提高?植物生长发育及病虫害?治等方面?着重要的作用2,13-14?本研究中?形菌门?拟杆菌门?酸杆菌门和放线菌门?草莓?际土壤的优势门?中?形菌门的相对丰度最高?42.83%48.21%?次是拟杆菌门?相对丰度?6.75%19.77%?形菌门?广泛?能够?多种植物?际微?境?在拟南芥?玉米?枸杞等植物?际土壤中均?见?形菌门2,15?形菌门还是一种?潜在?病性的细菌?相对丰度增加会导?结?道菌群失调16?拟杆菌门是引起土壤烃类污染的?要菌群?相对含?增加?能引起土壤?境抵抗力?降?增加植物病害发生率17?在优势菌门中?高?区颜厝镇草莓发病土壤拟杆菌门相对丰度升高?而?形菌门相对丰度降?和县安厚镇草莓发病土壤?形菌门和拟杆菌门的相对丰度均高于?常土壤?说明土壤中细菌丰度的?草莓?腐病的发生?着重要的关系?土壤中存在许多?益生?真菌?对植物的生长?着重要的作用18?本研究中?2 个地区草莓土壤的优势真菌门?子囊菌门?被孢霉门和担子菌门?研究表明?被孢霉门能够在养?水?较?的土壤中发挥积极作用19-20?被孢霉菌作?益真菌?以提高植物对养?的吸收?促进植物生长?外?被孢霉菌的存在?利于?益菌群的生长?影响土壤养?的?效性?提高作物产?21-22?本研究中?高?颜厝发病土壤的被孢霉菌相对含?于?常土壤?很?能是草莓?腐病的发生影响了?益菌群的生长?进而RDA1(44.47%)RDA2(19.16%)第 48 卷 福建热作科技 Vol.48 No.2 第 2 期 Fujian Science&Technology of Tropical Crops 2023 14影响土壤养?和植物的生长?土壤?机质组?以及土壤养?土壤微生物群落结构好多?性息息相关?土壤养?失调会改?土壤微生态?境?耕作施肥?合理会引起土壤酸?进而增加植物病害的发生的概率9,23?本研究中?发病草莓土壤?效磷和?效钾含?显著高于?常土壤?而土壤 pH?于?常土壤?Spearman?析表明?拟杆菌门?土壤?效磷和?效钾含?呈负相关?绿弯菌门?土壤 pH 呈?相关?子囊菌门?土壤 pH 和?效钾含?呈负相关?担子菌门?土壤?效磷和?效钾呈负相关?被孢霉门?土壤?效磷和?效钾含?呈?相关?表明土壤理?性质对微生物的群落结构存在较强影响?草莓?际土壤微生物群落结构?多种土壤?境因子的影响?土壤养?和 pH 失调?能导?土壤微生物群落结构失衡?进而诱发草莓?腐病的发生?参考文献 1?珊,张涛,杨俊,等.草莓?菌?腐病的病原菌鉴定J.植物病理学?,2016,46(3):289-293.2赵?,赵密珍,王钰,等.?于高通?测序研究草莓?际微生物群落结构和多?性J.土壤,2019,51(1):51-60.3朱晓琴,?自力,裴冬丽,等.河南省商丘?草莓?腐病病原菌的?离和鉴定J.植物保?学?,2017,44(2):349-350.4盛茹媛,肖长坤,郑书恒,等.镰刀菌引起的?京?草莓?腐病病原鉴定J.中?蔬菜,2012,(12):52-56.5蒋?龙,余妙,李丽,等.西洋参?腐病发生?际土壤细菌群落结构?关系研究J.中草药,2018,49(18):4399-4407.6WANG Y,WANG P.Study on the change and allelopathy effect of boju continuous cropping rhizosphere environmentJ.Agro Food Industry Hi-Tech,2017,28(3):109-113.7方敏,徐晓蓉,唐明,等.马缨杜鹃?系微生物群落结构及?J.微生物学?,2019,59(8):1522-1534.8DUINEVELD B M,KOWALCHUK G A,KEIJZER A,et al.Analysis of bacterial communities in the rhizosphere of chrysanthemum via denaturing gradient gel electrophoresis of PCR-amplified 16S rRNA as well as DNA fragments coding for 16S rRNAJ.Applied and Environmental 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