汉防己甲素对支气管哮喘小鼠气道重塑的影响及机制探讨.pdf

天津医药 2023 年 9 月第 51 卷第 9 期汉防己甲素对支气管哮喘小鼠气道重塑的影响及机制探讨王生成1，李琪2，蔡潇阳1，唐咏婕1摘要：目的探究汉防己甲素对支气管哮喘小鼠气道重塑及高迁移率族蛋白B1（HMGB1）/Toll样受体4（TLR4）/核因子B（NF-B）信号通路的影响。方法构建支气管哮喘小鼠模型，将建模成功的40只小鼠随机分为模型组，汉防己甲素低（20 mg/kg）、高（40 mg/kg）剂量组和地塞米松（10 mg/kg）组，每组10只。另取10只小鼠不建模作为对照组。各组小鼠给予相应干预2周。ELISA法检测血清肿瘤坏死因子-（TNF-）、白细胞介素（IL）-6、IL-1水平；苏木素-伊红染色观察肺组织病理学变化并进行肺损伤评分；测定小鼠支气管管壁厚度和支气管平滑肌厚度；荧光定量PCR（qPCR）和蛋白印迹法（Western blot）检测肺组织HMGB1、TLR4、NF-B mRNA和蛋白表达水平。结果对照组小鼠肺组织支气管无病理损伤。与对照组相比，模型组小鼠支气管管壁及平滑肌增厚，黏膜上皮增生、皱襞增多，管腔缩小，气管内黏液渗出明显；血清TNF-、IL-6、IL-1水平，肺损伤评分，支气管管壁及支气管平滑肌厚度，HMGB1、TLR4、NF-B mRNA和蛋白表达水平显著升高（P0.05）。与模型组相比，汉防己甲素低、高剂量组小鼠肺组织病变程度逐渐减轻，血清TNF-、IL-6、IL-1水平，肺损伤评分，支气管管壁及支气管平滑肌厚度，HMGB1、TLR4、NF-B mRNA和蛋白表达水平依次降低（P0.05）；汉防己甲素高剂量组和地塞米松组小鼠各项指标比较差异均无统计学意义（P0.05）。结论汉防己甲素可减轻支气管哮喘小鼠气道重塑程度和炎性因子水平，保护肺组织，其机制可能与抑制HMGB1/TLR4/NF-B信号通路有关。关键词：粉防己碱；哮喘；气道重塑；HMGB1蛋白质；Toll样受体4；NF-B中图分类号：R562.25，R349.6文献标志码：ADOI：10.11958/20222063Effect and mechanism of tetrandrine on airway remodeling in bronchial asthma miceWANG Shengcheng1,LI Qi2,CAI Xiaoyang1,TANG Yongjie11 Department of Respiratory Medicine,Danzhou Peoples Hospital,Danzhou 571700,China;2 Department of Respiratory Medicine,the First Affiliated Hospital of Hainan Medical CollegeCorresponding AuthorE-mail:Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of tetrandrine on airway remodeling and high mobility group protein box1(HMGB1)/Toll-like receptor 4(TLR4)/nuclear factor-B(NF-B)signaling pathway in bronchial asthma mice.MethodsA mouse model of bronchial asthma was established,and 40 model mice were randomly divided into the model group,thetetrandrine low dose(20 mg/kg)group,the high dose(40 mg/kg)group and the dexamethasone(10 mg/kg)group,with 10mice in each group.Another 10 mice without modeling were useed as the control group.Each group was given correspondingintervention for 2 weeks.Serum levels of tumor necrosis factor-(TNF-),interleukin(IL-6)and IL-1 were determinedby ELISA.Hematoxylin-eosin staining was used to observe lung histopathological changes,and lung injury score wasperformed.The thickness of bronchial tube wall and bronchial smooth muscle were determined.Expression levels ofHMGB1,TLR4,NF-B mRNA and protein in lung tissue were detected by fluorescence quantitative PCR(qPCR)andWestern blot assay.ResultsNo pathological damage was found in bronchus of lung tissue in the control group.Comparedwith the control group,the bronchial tube wall and smooth muscle of lung tissue in the model group were thickened,mucosalepithelium hyperplasia,and lumen shrank and tracheal mucus exudated significantly.Serum levels of TNF-,IL-6 and IL-1,lung injury score,bronchial wall thickness,bronchial smooth muscle thickness,HMGB1,TLR4,NF-B mRNA andprotein expression levels were increased significantly(P0.05).Compared with the model group,the degree of lung lesionswas gradually reduced in the low and high dose tetrandrine groups,and serum levels of TNF-,IL-6,IL-1,lung injuryscores,bronchial wall and bronchial smooth muscle thickness,HMGB1,TLR4,NF-B mRNA and protein expression weresuccessively decreased.There were no significant differences in above indexed between the tetrandrine high dose group andthe dexamethasone group(P0.05).ConclusionTetrandrine can reduce the degree of airway remodeling and the level of基金项目：国家自然科学基金资助项目（81860001）作者单位：1儋州市人民医院呼吸内科（邮编571700）；2海南医学院第一附属医院呼吸内科作者简介：王生成（1984），男，主治医师，主要从事呼吸系统疾病诊治方面研究。E-mail：通信作者E-mail：实验研究943Tianjin Med J,September 2023,Vol.51 No.9支气管哮喘是一种由气道平滑肌细胞、上皮细胞、嗜酸性粒细胞等多种细胞参与的呼吸道炎症疾病1。由于气道炎症迁延不愈，导致组织增生，气道重塑；而气道重塑的发生会进一步引起不可逆的气道阻塞，使得哮喘变得更加难以治愈2。高迁移率族蛋白B1（high mobility group protein box 1，HMGB1）是一种内源性炎性因子，由坏死细胞或巨噬细胞等在炎症刺激下释放，释放出细胞外可以激发免疫反应或参与信号转导过程3。Toll样受体4（Toll likereceptor 4，TLR4）是一种免疫识别受体，可参与炎症的启动和调节过程4。研究发现，HMGB1与TLR4结合可激活核因子B（NF-B）炎症通路，引起下游的炎性因子释放5。HMGB1/TLR4/NF-B信号通路在哮喘大鼠气道炎症及气道重塑方面发挥重要作用6。汉防己甲素又称粉防己碱，是一类具有良好生物活性的天然双苄基四氢异喹啉生物碱，具有抗炎效果7。研究表明，汉防己甲素能有效改善尘肺患者的临床症状和肺通气功能，减轻炎症反应，改善病情8。但汉防己甲素可否通过HMGB1/TLR4/NF-B信号通路发挥对哮喘的治疗效果尚不明确。本研究分析汉防己甲素对支气管哮喘小鼠气道重塑及HMGB1/TLR4/NF-B信号通路的影响，以期为支气管哮喘的临床防治提供参考。1材料与方法1.1材料1.1.1实验动物50只SPF级BALB/c小鼠（雌雄各半），68周龄，体质量1822 g，购自四川横竖生物科技股份有限公司，生产许可证号：SCXK（川）2021-0007，小鼠饲养于温度为24 2、相对湿度为65%3%、12 h光暗交替的饲养房中，自由饮食。本研究经儋州市人民医院伦理委员会批准（批准编号：DYLS2022-5-4）。1.1.2药物、试剂与仪器汉防己甲素（原料药，纯度99.5%）购自西安飞达生物技术有限公司；地塞米松片购自广东华南药业集团有限公司；卵清蛋白（OVA）、氢氧化铝、HE染色试剂盒、PCR试剂盒、蛋白检测试剂盒均购自雅安普莱美生物科技有限公司；肿瘤坏死因子-（TNF-）、白细胞介素（IL）-6、IL-1酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒、Trizol试剂、蛋白裂解液、ECL发光液均购自深圳灵赋拓普生物科技有限公司；兔源HMGB1、TLR4、NF-B、GAPDH一抗，羊抗兔二抗均购自武汉时胜生物科技有限公司。超声雾化器（型号JWS-CWN）、显微镜（型号XSZ-107）均购自上海聚慕医疗器械有限公司；酶标仪（型号K3-PLus）、荧光定量PCR（qPCR）仪（型号MA-1640Q）、凝胶成像系统（型号WD-9413B）均购自杭州比格飞序生物科技有限公司。1.2方法1.2.1模型的建立及分组给药采用OVA致敏法构建支气管哮喘小鼠模型9。各组小鼠于第1、14天腹腔注射致敏液（20 g OVA和1 mg氢氧化铝溶于0.2 mL生理盐水），第20天开始使用超声雾化器用3%OVA生理盐水喷雾激发小鼠哮喘发作，喷雾每日1次，每次30 min，连续7 d，小鼠出现腹肌痉挛、呼吸加快、站立不稳等现象提示建模成功10。将建模成功的40只小鼠按照随机数字表法分为模型组，汉防己甲素低（20 mg/kg）、高（40 mg/kg）剂量组11和地塞米松（10 mg/kg）组12，每组10只。另取10只小鼠作为对照组，以等量生理盐水代替致敏液和喷雾，重复同样实验操作。汉防己甲素低、高剂量组小鼠分别给予20、40 mg/kg汉防己甲素灌胃给药11（将汉防己甲素以生理盐水溶解成浓度分别为2、4 g/L的混悬液，灌胃体积10 mL/kg）；地塞米松组小鼠给予10 mg/kg地塞米松灌胃给药12（将地塞米松片以生理盐水溶解浓度为1 g/L的混悬液，灌胃体积10 mL/kg）；模型组和对照组小鼠给予等体积生理盐水灌胃。各组给药每日1次，连续2周。1.2.2ELISA法检测血清中TNF-、IL-6、IL-1水平给药结束 24 h 后，戊巴比妥钠麻醉小鼠，腹主动脉取血，4、4 700 r/min离心14 min，取上层血清。ELISA法检测血清中TNF-、IL-6、IL-1水平。1.2.3标本采集采血后处死小鼠，分离肺组织，切取左肺组织和部分支气管，4%多聚甲醛固定，切取部分右肺组织冻存于液氮中。1.2.4HE染色观察肺组织病理学变化及肺损伤评分将左肺组织于4%多聚甲醛固定24 h后，常规石腊包埋，切片（厚度5 m），HE染色，光镜下观察。同时根据肺间质水肿、肺泡水肿、中性粒细胞浸润、肺泡内充血沉积4项指标病理变化情况进行肺损伤评分13：每项指标04分，无明显变化记0分，轻度变化记1分，中度变化记2分，重度变化记3分，严重变化记4分，总分为16分。肺损伤评分总分为4项指标评分之和。每只小鼠取3张切片，每张切片随机选取6个视野观察，记录肺损伤评分，取平均值。1.2.5支气管管壁厚度和支气管平滑肌厚度测定取1.2.4中HE染色的肺组织切片，置于光镜下观察，挑选有完整横断面的支气管进行测量，用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件分别测量肺组织中支气管基底膜周径（Pbm）、支气管管壁总面积（Wat）、支气管平滑肌面积（Wam）。根据上述测量指标计算支气管管壁厚度和支气管平滑肌厚度。支气管管壁厚度（m）=Wat/Pbm，支气管平滑肌厚度（m）=Wam/Pbm，以这2个指标代表小鼠气道重塑程度，比值越大，表明气道重塑程度越高。1.2.6qPCR检测肺组织中HMGB1、TLR4、NF-B mRNA表达水平取1.2.3中小鼠右肺组织，Trizol试剂提取总RNA，逆转录合成cDNA，采用qPCR法检测HMGB1、TLR4、NF-Binflammatory factors in mice with bronchial asthma,and protect lung tissue,which may be related to the inhibition ofHMGB1/TLR4/NF-B signal pathway.Key words:tetrandrine;asthma;airway remodeling;HMGB1 protein;Toll-like receptor 4;NF-kappa B944天津医药 2023 年 9 月第 51 卷第 9 期mRNA 表达水平，内参基因为 GAPDH。反应体系：cDNA2 L，缓冲液5 L，dNTPs 4 L，上、下游引物各1 L，DNA聚合酶1 L，ddH2O 16 L，共30 L。反应程序：95 预变性10 min；95 10 s，55 35 s，72 60 s，40个循环；72 延伸10 min。引物由湖北逸挚诚生物科技有限公司合成，引物序列见表1。采用2-Ct法计算目的mRNA相对表达量。1.2.7蛋白印迹法检测肺组织中HMGB1、TLR4、NF-B蛋白表达水平取1.2.3中小鼠右肺组织，匀浆后加入蛋白裂解液提取总蛋白，BCA蛋白检测试剂盒定量总蛋白。取适量蛋白，上样，电泳分离，转膜，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，然后加入兔源HMGB1（1620）、TLR4（1550）、NF-B（1750）、GAPDH（1720）一抗，4 下孵育过夜，再加入羊抗兔二抗（1 1 700），室温孵育1 h，ECL发光液显色。以GAPDH为内参，使用Image J软件进行灰度值分析，计算目标蛋白相对表达量（目标蛋白与内参GAPDH灰度值之比）。1.3统计学方法使用SPSS 26.0软件进行数据分析，计量资料以xs表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较行SNK-q检验，P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1各组血清TNF-、IL-6、IL-1水平变化与对照组相比，模型组小鼠血清中TNF-、IL-6、IL-1水平升高（P0.05）；与模型组相比，汉防己甲素低、高剂量组小鼠血清中TNF-、IL-6、IL-1水平依次降低（P0.05）；汉防己甲素高剂量组和地塞米松组上述 3 项指标水平差异无统计学意义（P0.05）。见表2。2.2各组肺组织病理学改变及肺损伤评分变化HE染色显示，对照组小鼠支气管管壁完整、平滑肌厚度正常、黏膜平整，基层细胞排列整齐；模型组小鼠支气管管壁及平滑肌厚度明显增厚，黏膜上皮增生、皱襞增多，管腔缩小，气管内黏液渗出明显；汉防己甲素低、高剂量组的上述病理学变化程度逐渐减轻；汉防己甲素高剂量组与地塞米松组小鼠肺组织病理学变化相近；见图1。对照组、模型组、汉防己甲素低剂量组、汉防己甲素高剂量组、地塞米松组小鼠肺损伤评分分别为（0.000.00）、（9.950.87）、（6.370.52）、（3.060.45）、（3.200.42）分，差异有统计学意义（n=10，F=508.567，P0.01）。与对照组相比，模型组小鼠肺损伤评分升高（P0.05）；与模型组相比，汉防己甲素低、高剂量组小鼠肺损伤评分依次降低（P0.05）；汉防己甲素高剂量组与地塞米松组小鼠肺损伤评分差异无统计学意义（P0.05）。2.3各组支气管管壁和平滑肌厚度改变与对照组相比，模型组小鼠支气管管壁及平滑肌厚度增厚（P0.05）；与模型组相比，汉防己甲素低、高剂量组支气管管壁及平滑肌厚度依次降低（P0.05）；汉防基因名称HMGB1TLR4NF-BGAPDH引物序列（53）上游：AGGATGCTTCTGTCAACT下游：TCAGCTTGGCAGCTTTTC上游：GGTGAGAAATGAGCTGGTA下游：TCTGCTAAGAAGGCGATAT上游：ACAGCACAGATACCACTAAG下游：CTGCCTCATAGAAGCCATCC上游：CCACTTGAAGGGTGGAGC下游：TGTAGTCGCAGGACACAA产物大小/bp198559159112Tab.1Primer sequence for qPCR表1qPCR引物序列组别对照组模型组汉防己甲素低剂量组汉防己甲素高剂量组地塞米松组FTNF-45.123.05106.089.13a84.587.07b70.245.11bc68.935.14bc128.734IL-634.923.9579.388.15a66.025.11b49.854.04bc51.664.02bc101.994IL-123.571.7985.736.03a70.145.88b56.524.86bc55.834.91bc216.221Tab.2Comparison of serum levels of TNF-,IL-6 andIL-1 between the five groups of mice表2各组小鼠血清中TNF-、IL-6、IL-1水平比较（n=10，ng/L，xs）P0.01；a与对照组比较，b与模型组比较，c与汉防己甲素低剂量组比较，P0.05；表35同。模型组汉防己甲素低剂量组汉防己甲素高剂量组地塞米松组对照组Fig.1Pathological changes of lung tissue of mice in each group(HE staining,200)图1各组小鼠肺组织病理学变化图（HE染色，200）945Tianjin Med J,September 2023,Vol.51 No.9己甲素高剂量组与地塞米松组支气管管壁及平滑肌厚度差异无统计学意义（P0.05）。见表3。2.4汉防己甲素对肺组织中HMGB1、TLR4、NF-BmRNA表达水平的影响与对照组相比，模型组小鼠肺组织中HMGB1、TLR4、NF-B mRNA表达水平显著升高（P0.05）；与模型组相比，汉防己甲素低、高剂量组小鼠肺组织中 HMGB1、TLR4、NF-BmRNA表达水平依次降低（P0.05）；汉防己甲素高剂量组与地塞米松组上述指标差异无统计学意义（P0.05）。见表4。2.5汉防己甲素对肺组织中HMGB1、TLR4、NF-B蛋白表达水平的影响与对照组相比，模型组小鼠肺组织中HMGB1、TLR4、NF-B蛋白表达水平显著升高（P0.05）；与模型组相比，汉防己甲素低、高剂量组小鼠的肺组织中HMGB1、TLR4、NF-B蛋白表达水平依次降低（P0.05）；汉防己甲素高剂量组与地塞米松组上述指标差异无统计学意义（P0.05）。见图2、表5。3讨论3.1支气管哮喘小鼠模型的建立支气管哮喘会引发肺功能进行性损伤和下降，最终导致气道阻塞，这一系列变化被称为气道重塑14。气道重塑是引起气道阻塞和气道高反应性的重要机制，是影响哮喘反复发作及肺功能进行性下降的重要因素15。因此，有效缓解哮喘气道重塑反应在支气管哮喘的治疗中具有重要作用。本研究发现支气管哮喘小鼠血清TNF-、IL-6、IL-1水平升高，肺损伤评分增加，支气管管壁及支气管平滑肌厚度增厚。病理学结果显示，对照组小鼠肺组织支气管无病理损伤；模型组小鼠肺组织支气管管壁及平滑肌厚度明显增厚，黏膜上皮增生、皱襞增多，管腔缩小，气管内黏液渗出明显。提示建模成功的小鼠炎性因子增多且气道发生重塑。3.2汉防己甲素对支气管哮喘的保护作用汉防己甲素是中药汉防己的提纯物，具有抗炎、抗过敏、抗肿瘤等多重功效，临床常应用于治疗关节痛、肺纤维化、矽肺等疾病16。Song等17研究发现，汉防己甲素可抑制肺巨噬细胞中的NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白 3 炎症小体来减轻矽肺病的症状。Jiao等18研究表明，汉防己甲素通过抑制NF-B和细胞外信号调节激酶1/2途径，改善高氧诱导的新生大鼠肺损伤。本研究结果显示，汉防己甲素处理后的支气管哮喘小鼠肺组织病变程度减轻，血清TNF-、IL-6、IL-1水平，肺损伤评分，支气管管壁厚度，支气管平滑肌厚度降低，且汉防己甲素剂量越高，改善效果越明显。由此表明汉防己甲素能降低支气管组别对照组模型组汉防己甲素低剂量组汉防己甲素高剂量组地塞米松组F支气管管壁厚度37.521.5563.854.67a53.074.59b45.563.57bc46.823.52bc68.310支气管平滑肌厚度12.810.2422.040.76a18.250.68b15.160.41bc14.720.42bc453.229Tab.3Comparison of bronchial tube wall thickness andbronchial smooth muscle thickness between thefive groups of mice表3各组小鼠支气管管壁厚度和支气管平滑肌厚度比较（n=10，m，xs）组别对照组模型组汉防己甲素低剂量组汉防己甲素高剂量组地塞米松组FHMGB11.020.082.580.26a1.940.14b1.430.09bc1.400.10bc162.704TLR41.000.062.220.20a1.810.10b1.390.07bc1.370.07bc172.847NF-B1.040.051.830.13a1.580.11b1.320.08bc1.350.08bc99.582Tab.4Comparison of mRNA expression levels ofHMGB1,TLR4 and NF-B in lung tissuebetween the five groups of mice表4各组小鼠肺组织中HMGB1、TLR4、NF-B mRNA表达水平比较（n=10，xs）HMGB1TLR4NF-BGAPDHABCDEA：对照组；B：模型组；C：汉防己甲素低剂量组；D：汉防己甲素高剂量组；E：地塞米松组。Fig.2Western blot results of HMGB1,TLR4 and NF-B in lungtissue of mice in each group图2各组小鼠肺组织中HMGB1、TLR4、NF-B蛋白印迹图Tab.5Comparison of HMGB1,TLR4 and NF-Bprotein expression levels in lung tissues between thefive groups of mice表5各组小鼠肺组织中HMGB1、TLR4、NF-B蛋白表达水平比较（n=10，xs）组别对照组模型组汉防己甲素低剂量组汉防己甲素高剂量组地塞米松组FHMGB10.220.041.340.11a0.920.09b0.550.07bc0.520.05bc317.980TLR40.190.030.890.10a0.690.07ab0.440.04bc0.420.03bc198.726NF-B0.170.030.980.12a0.750.07b0.320.04bc0.300.05bc243.889946天津医药 2023 年 9 月第 51 卷第 9 期哮喘小鼠炎性因子水平，改善气道重塑程度。3.3汉防己甲素可能通过抑制HMGB1/TLR4/NF-B 通路保护支气管哮喘小鼠肺组织HMGB1/TLR4/NF-B是促成炎症损伤的重要信号通路，作为应激信号，HMGB1可通过与晚期糖基化终末产物受体、TLR4等受体识别结合，激活NF-B等信号通路，发挥其生物学效应19。朴颖等20研究发现，通过抑制HMGB1/TLR4/NF-B通路可减轻OVA诱导的过敏性哮喘豚鼠的气道炎症。Zhang等21研究发现，维生素D通过抑制HMGB1/TLR4/NF-B通路减轻哮喘小鼠的炎症反应和肺组织中的细胞凋亡。本研究发现，支气管哮喘小鼠肺组织中 HMGB1、TLR4、NF-B mRNA和蛋白表达升高；汉防己甲素处理后的支气管哮喘小鼠肺组织中三者mRNA和蛋白表达降低，且汉防己甲素剂量越高效果越明显。表明汉防己甲素可抑制HMGB1/TLR4/NF-B通路，结合朴颖等20-21的研究结果，笔者认为汉防己甲素可能通过抑制HMGB1/TLR4/NF-B通路保护支气管哮喘小鼠肺组织。综上所述，汉防己甲素可减轻支气管哮喘小鼠气道重塑程度和炎性因子水平，保护肺组织，其机制可能与抑制HMGB1/TLR4/NF-B信号通路的激活有关。但本研究仅限于动物实验，与临床应用还有很大差距。参考文献1 BATRAKOVA 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