二甲亚砜对中国鲎NAGase的抑制作用.pdf

D O I:1 0.1 6 3 7 8/j.c n k i.1 0 0 3-1 1 1 1.2 1 1 3 0第4 2卷第4期2 0 2 3年7月水产科学F I S HE R I E S S C I E N C EV o l.4 2N o.4J u l.2 0 2 3二甲亚砜对中国鲎NAG a s e的抑制作用林建城,吴建洪,林娟娟(莆田学院 环境与生物工程学院,福建省新型污染物生态毒理效应与控制重点实验室,生态环境及其信息图谱福建省高等学校重点实验室,福建 莆田3 5 1 1 0 0)摘 要:节肢动物的周期性蜕皮与N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶(E C 3.2.1.5 2,NAG a s e)密切相关。从中国鲎内脏分离提取N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶,利用酶抑制作用动力学方法研究二甲亚砜对中国鲎N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶的影响。试验结果显示:二甲亚砜对中国鲎N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶有较强的抑制作用,0.1m o l/L二甲亚砜可使酶活性下降3 8.0%,该抑制作用为可逆过程;动力学研究显示,二甲亚砜对N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶的抑制作用是属于竞争性-非竞争性混合型抑制,二甲亚砜对游离酶(E)的抑制常数(KI)和对酶-底物络合物(E S)的抑制常数(KI S)分别为0.2 0 0m o l/L和1.0 6 3m o l/L,KIKI S,表明底物对N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶在二甲亚砜溶剂中的失活具有保护作用,随着底物浓度增大,二甲亚砜对酶的失活作用降低;酶蛋白的紫外吸收光谱和内源荧光发射光谱显示,随着二甲亚砜溶剂浓度升高,N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶酶蛋白紫外吸收值亦在升高,但其内源荧光发射强度减弱,两者峰值均无位移,在0.6 5m o l/L二甲亚砜溶剂中酶蛋白荧光强度接近于0,表明N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶在二甲亚砜溶剂中蛋白空间构象发生了变化导致了酶失活现象。试验结果表明,二甲亚砜对中国鲎N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶发挥明显的抑制作用,这可能会进一步影响中国鲎的蜕皮。关键词:二甲亚砜;中国鲎;N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶;抑制作用;构象变化中图分类号:S 9 4 8文献标识码:A文章编号:1 0 0 3-1 1 1 1(2 0 2 3)0 4-0 7 1 9-0 7收稿日期:2 0 2 1-0 7-2 0;修回日期:2 0 2 2-0 1-1 5.基金项目:福建省自然科学基金资助项目(2 0 1 8 J 0 1 4 6 7);福建省新型污染物生态毒理效应与控制重点实验室开放课题项目(P Y 1 6 0 0 9);莆田市科技计划项目(2 0 2 1 Z P 0 9).作者简介:林建城(1 9 6 6),男,教授,硕士;研究方向:海洋生物酶学.E-m a i l:p t l j c 6 6 0 4 0 2s i n a.c o m.有机溶剂对近海水生生物的生长构成了严重危害,受到越来越多的关注1。二甲亚砜作为“万能溶剂”被广泛应用于各个领域,其排放量与日俱增,可能会对近海海域造成污染。二甲亚砜在近海海域海水中已有广泛分布,其主要来自浮游植物的释放,以溶解态和颗粒态两种形态存在2-3,东海和黄海冬季海水中溶解态和颗粒态的二甲亚砜浓度分别为(1 0.1 07.5 4)n m o l/L和(8.7 27.8 0)n m o l/L3。王英红等4研究表明,21 0-7%二甲亚砜可使斑马鱼(D a n i or e r i o)受精卵2 4、4 8h及7 2h孵化率显著降低,低含量二甲亚砜对斑马鱼胚胎发育以及成鱼生殖可产生影响。二甲亚砜溶剂除了对环境中生物直接产生毒性作用外4-5,近年来,二甲亚砜对节肢动物和昆虫类N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶(E C 3.2.1.5 2,NAG a s e)的影响也得到较多关注。龚敏等6研究显示,二甲亚砜溶液可导致凡纳滨对虾(L i t o p e n a e u sv a n n a m e i)N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶活性下降,2.0m o l/L的二甲亚砜可使该酶活性丧失7 1.6 4%;张继平等7研究了二甲亚砜溶液对锯缘青蟹(S c y l l as e r r a t a)N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶的失活作用,当二甲亚砜浓度达到4.0m o l/L时,酶活性可丧失9 7%,并建立了酶在二甲亚砜溶液中失活作用的动力学模型。相似的,二甲亚砜对昆虫类黄粉虫(T e n e b r i om o l i t o r)N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶活性也可产生抑制作用,随着二甲亚砜浓度增大,酶活性呈逐渐下降趋势8。可见,当生物体处于二甲亚砜溶剂环境中,体内N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶的生理生化会受到较大影响。中国鲎(T a c h y p l e u st r i d e n t a t u s)是生活在近海的一种节肢动物,人为的捕杀和近海日趋严重的污染,对其生存产生了严重威胁,属于濒危物种。在中国鲎生长发育周期中要经历多次蜕壳,蜕壳是中国鲎的重要生理现象,蜕壳一次中国鲎会较大幅度生长一次。Z o u等9研究表明,节肢动物周期性蜕壳生理与其内脏或外壳膜的几丁质酶生理生化密切相关;而黄乾生等1 0研究认为,凡纳滨对虾的蜕壳生长发育与虾肝胰腺N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶密切相关。目前认为几丁质酶至少由内切几丁质酶、外切几丁质酶及具外切酶性质的N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶3个不同组分组成,中国鲎消化道具有较高的内、外切几丁质酶活性,而且鲎几丁质酶还易受p H、温度、金属离子等环境因素的影响1 1-1 2。因此,有机污染物也可能通过调节海洋生物几丁质酶活性,从而对其生理代谢和生长发育直接产生影响。目前尚未见关于二甲亚砜对鲎N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶活性影响的报道。笔者拟探讨二甲亚砜溶剂对中国鲎N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶的影响,阐明二甲亚砜对N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶的抑制机理和抑制作用类型,揭示该酶在二甲亚砜溶剂中酶活性和酶分子构象之间的构效关系,为二甲亚砜可能直接对中国鲎蜕壳生理产生影响提供理论依据。1 材料与方法1.1 试验材料从莆田市城南市场某采购者赎回一已宰杀过的中国鲎,作为试验材料。参照文献1 2 的方法分离纯化中国鲎N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶,分别通过3 0%和8 0%饱和度(NH4)2S O4沉淀分级分离、葡聚糖凝胶柱S e p h a d e xG-2 0 0层析以及离子交换柱D E A E-3 2层析,获得酶制剂,双蒸馏水透析后经聚丙烯凝胶酰胺电泳P AG E和S D S-P AG E检定酶的纯度,纯酶制剂用于试验研究。N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶的分离纯化试剂S e p h a d e xG-2 0 0是P h a r m a c i a产品,纤维素D E-3 2来自Wh a t m a n,对硝基苯-N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷、二甲亚砜等药品与试剂均为国产分析纯。1.2 试验方法1.2.1 二甲亚砜对中国鲎N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶活性的影响N-乙酰-D-氨基葡萄 糖苷酶活性 参照文 献1 2-1 3 的方法测定。2m L酶测活体系中包含:0.5mm o l/L对硝基苯-N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷底物0.2 m L,0.1 5 m o l/L醋 酸-醋 酸 钠 缓 冲 体 系(p H5.4)1m L,双蒸水0.7 8m L,2 0L纯酶。在3 7 下催化反应1 0m i n,以0.5m o l/L氢氧化钠终止反应,设立空白对照,在4 0 5n m波长下测定反应液光密度D(4 0 5n m)。此条件下,每分钟催化底物反应产生1m o l/L对硝基酚所需的酶量定义为1酶活性单位(U)。在上述测活体系中,加入不同浓度二甲亚砜溶剂,测定酶经二甲亚砜作用后的剩余酶活性,研究二甲亚砜对鲎N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶活性的影响。试验重复3次,采用E x c e l 2 0 1 0软件进行统计及试验数据分析,结果以平均值标准差表示。1.2.2 二甲亚砜对中国鲎N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶的抑制机理在测活体系中,底物浓度(cS)不变,改变N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶质量浓度(E),分别测定不同浓度二甲亚砜溶剂对酶活性的影响,酶促反应速率(v)以酶活性大小表示,以v对E作图,分析二甲亚砜溶剂对N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶的抑制机理。1.2.3 二甲亚砜对中国鲎N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶的抑制作用类型采用L i n e w e a v e r-B u r k作 图 法。在 测 活 体 系中,N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶质量浓度不变,改变底物浓度(0.2 00.8 0mm o l/L),分别测定不同浓度二甲亚砜溶剂对N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶活性的影响,以测定的1/v对1/cS作图,计算二甲亚砜溶剂作用下酶的米氏常数(Km a p p)和最大反应速率(vm a p p),分析二甲亚砜对N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶的抑制作用类型;以上述各直线斜率(y)对相应的二甲亚砜浓度(x)作图,求得抑制常数(KI)。1.2.4 二甲亚砜对中国鲎N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶空间构象的影响测定N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶经不同浓度二甲亚砜溶剂作用后的紫外吸收光谱,分析N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶在二甲亚砜溶剂中的紫外吸收光谱变化规律;此后,在2 3 2.2n m波长的激发光谱下,测定经不同浓度二甲亚砜溶剂作用后中国鲎N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶的荧光发射光谱。根据蛋白的光谱吸收特征及其变化规律,分析二甲亚砜溶剂对鲎N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶空间构象的影响。2 结果与分析2.1 中国鲎内脏N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶的分离纯化分离纯化后获得的中国鲎N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶制剂,经P AG E和S D S-P AG E鉴定,电泳图谱均显示一蛋白谱带(图1),说明经分离纯化后027水 产 科 学第4 2卷N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶已达到电泳纯,可用此纯酶制剂进行试验。图1 中国鲎N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶的P AG E(a)及S D S-P A G E(b)图谱F i g.1 P A G E(a)a n dS D S-P A G E(b)o f t h ep u r i f i e dN-a c e t y l-D-g l u c o s a m i n i d a s e(N A G a s e)f r o mT.t r i d e n t a t u s2.2 二甲亚砜对中国鲎N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶的影响中国鲎N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶在二甲亚砜溶剂中呈现失活现象(图2),随着二甲亚砜浓度的升高,酶活性逐渐下降,呈明显的浓度效应,0.1m o l/L二甲亚矾可使中国鲎N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶活性下降3 8.0%,导致酶活性丧失5 0%的二甲亚砜浓度(I C5 0)为0.2 1m o l/L,在5m o l/L二甲亚砜 溶 剂 中N-乙 酰-D-氨 基 葡 萄 糖 苷 酶 几 近失活。图2 二甲亚砜对中国鲎N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶活性的影响F i g.2 E f f e c t o fd i m e t h y l s u l f o x i d eo nt h ea c t i v i t yo fN-a c e t y l-D-g l u c o s a m i n i d a s e f r o mT.t r i d e n t a t u s2.3 二甲亚砜溶剂对中国鲎N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶抑制机理的判断试验结果表明,以N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶经不同浓度二甲亚砜作用后的剩余酶活性v对E作图,得到了5条直线,经t检验分析,同一酶质量浓度下,各试验组酶活性之间均存在极显著差异(P0.0 1)(图3);同时,各直线在坐标轴上经过同一原点,随二甲亚砜浓度增大,各直线的斜率(k)逐渐变小,说明经二甲亚砜溶剂作用后N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶的催化效率降低,但有效酶量不变。而只有酶的测活体系中加入的是可逆抑制剂时,在抑制剂浓度恒定下,酶活性会按比例受到抑制,从而得到一条斜率较低的直线,随着抑制剂浓度增大,直线斜率减小1 4。据此可以判断二甲亚砜溶剂对鲎N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶的失活作用是可逆的,这与二甲亚砜对凡纳滨对虾6和锯缘青蟹7N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶的抑制机理的试验分析与判断结果一致。图3 二甲亚砜对中国鲎N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶抑制机理的判断F i g.3 D e t e r m i n a t i o no f t h e i n h i b i t o r ym e c h a n i s mo fd i m e t h y ls u l f o x i d eo nN-a c e t y l-D-g l u c o s a m i n i d a s e f r o mT.t r i d e n t a t u s直线04,二甲亚砜浓度分别为0、0.1 5、0.3 0、0.4 5、0.6 5m o l/L;同列中标有不同大写字母的数值间差异极显著(P0.0 1).C o n c e n t r a t i o n so fd i m e t h y ls u l f o x i d ef o rc u r v e s04 w e r e0,0.1 5,0.3 0,0.4 5a n d0.6 5m o l/L,r e s p e c t i v e l y;m e a n sw i t hd i f-f e r e n tc a p i t a ll e t t e r si nt h es a m ec o l u m na r ev e r ys i g n i f i c a n td i f f e r e n c e s(P0.0 1).2.4 二甲亚砜溶剂对中国鲎N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶抑制作用类型的判断通过L i n e w e a v e r-B u r k作图,获得了5条直线,并在第二象限同时相交于一点(图4)。结果显示,随着二甲亚砜溶剂浓度升高,各相对应的直线斜率也逐渐增大,各直线在x轴的截距逐渐减小,而在y轴上的截距随着二甲亚砜浓度的增大而增大,说明不同二甲亚砜浓度下N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶的Km a p p和vm a p p均发生变化,随着二甲亚砜浓度升高,酶的vm a p p逐渐减小,Km a p p反而逐渐增大,表127第4期林建城等:二甲亚砜对中国鲎NAG a s e的抑制作用明N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶在二甲亚砜微扰下,削弱了底物与酶之间的亲和力,降低了酶的催化效率。可判断二甲亚砜溶剂对鲎N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶的抑制效应是属于竞争性-非竞争性混合型抑制机制。图4 二甲亚砜对中国鲎N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶抑制作用的L i n e w e a v e r-B u r k关系F i g.4 L i n e w e a v e r-B u r kp l o t s f o r i n h i b i t o r y e f f e c t o f d i m e t h y l s u l f o x i d eo nt h ea c t i v i t yo fN-a c e t y l-D-g l u c o s a m i n i d a s e f r o mT.t r i d e n t a t u s直线04,二甲亚砜浓度分别为0、0.1 5、0.3 0、0.4 5、0.6 5m o l/L.C o n c e n t r a t i o n so fd i m e t h y l s u l f o x i d e f o rc u r v e s04w e r e0,0.1 5,0.3 0,0.4 5a n d0.6 5m o l/L,r e s p e c t i v e l y.以图4各直线斜率(k)对相应二甲亚砜浓度作图,获得1条交于第二象限x轴的直线(图5 a):y=0.2 1 5x+0.0 4 3,在x轴的交点值即是二甲亚砜溶剂对N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶的抑制常数(KI),KI为0.2 0 0m o l/L;类似地,求出图3中各直线在y轴的截距,以各截距对相应二甲亚砜浓度作图,获得1条直线(图5 b):y=0.0 9 5x+0.1 0 1,其在横坐标的交点即为二甲亚砜对酶-底物中间络合物(E S)的抑制常数(KI S),KI S为1.0 6 3m o l/L;KIKI S,KI S是KI的5倍多,说明二甲亚砜对N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶抑制的强度随底物浓度增大而减小,游离酶在二甲亚砜中比在酶-底物中间络合物中更易失活。在二甲亚砜溶剂导致鲎N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶的失活效应中,底物对硝基苯-N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷对酶能起到保护作用1 4。2.5 二甲亚砜对中国鲎N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶空间构象的影响中国鲎N-乙酰-D-氨基葡萄 糖苷酶在2 7 5n m波长处有紫外吸收峰,在0.1 5m o l/L二甲亚砜溶液作用下酶蛋白的紫外吸收值得到较大幅度提高,后随二甲亚砜浓度的增大,酶蛋白的紫外吸收值增幅有所减小,但达到峰值的波长不变(图6),说明二甲亚砜存在时N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶蛋白的共价结构并未受到破坏,其分子构型没有发生改变。酶蛋白的紫外生色基团主要来自酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸,本试验中二甲亚砜引起中国鲎N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶蛋白紫 图5 二甲亚砜对中国鲎N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶抑制常数的测定F i g.5 T h ed e t e r m i n a t i o no f i n h i b i t i o nc o n s t a n t s o fd i m e t h y l s u l f o x i d eo nt h eN-a c e t y l-D-g l u c o s a m i n i d a s e f r o mT.t r i d e n t a t u s图6 中国鲎N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶在二甲亚砜中的紫外吸收光谱F i g.6 U Va b s o r p t i o ns p e c t r ao fN-a c e t y l-D-g l u c o s a m i n i d a s e f r o mC h i n e s eh o r s e s h o ec r a bT a.t r i d e n t a t u si nd i m e t h y l s u l f o x i d e曲线04,二甲亚砜浓度分别为0、0.1 5、0.3 0、0.4 5、0.6 5mm o l/L.C o n c e n t r a t i o n so fd i m e t h y l s u l f o x i d e w e r e0、0.1 5、0.3 0、0.4 5、0.6 5m o l/Lf o rc u r v e s04,r e s p e c t i v e l y.227水 产 科 学第4 2卷外吸收值升高的现象,可能是由于二甲亚砜溶液改变了酶蛋白空间构象使得紫外生色基团暴露所致。N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶酶蛋白在缓冲溶液中的荧光发射峰在3 2 9.1n m波长处,酶蛋白经二甲亚砜溶剂作用后,其荧光发射强度出现减弱现象,0.1 5m o l/L的二甲亚砜溶剂可使酶蛋白荧光强度下降6 8.0%,而该酶蛋白在0.6 5m o l/L二甲亚砜中的荧光发射几近淬灭(图7)。但是,二甲亚砜溶剂作用下仅仅改变了N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶酶蛋白的荧光发射强度,其荧光发射峰却基本没有位移(图7),表明加入二甲亚砜溶剂后,中国鲎N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶蛋白分子构型基本没有改变,只是酶蛋白氨基酸残基所处的微环境发生了改变,酶蛋白空间构象发生了变化,从而导致酶的失活作用1 4-1 5。图7 中国鲎N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶在二甲亚砜中的内源荧光发射光谱F i g.7 F l u o r e s c e n c e e m i s s i o ns p e c t r ao fN-a c e t y l-D-g l u c o s a m i n i d a s ef r o mC h i n e s eh o r s e s h o ec r a bT.t r i d e n t a t u si nd i m e t h y l s u l f o x i d e s o l u t i o n曲线05,二甲亚砜浓度分别为0、0.0 7 5、0.1 5、0.3 0、0.4 5、0.6 5m o l/L.C o n c e n t r a t i o n so fd i m e t h y l s u l f o x i d ew e r e0、0.0 7 5、0.1 5、0.3 0、0.4 5、0.6 5m o l/Lf o r c u r v e s05,r e s p e c t i v e l y.3 讨 论3.1 二甲亚砜溶剂对生物酶活性的影响二甲亚砜溶剂对不同生物酶的影响存在差异。S a n a等1 6研究发现,经3 0%7 0%的二甲亚砜溶剂作用1 0d后,耐盐芽孢杆菌酯酶比活性可增加2.2 53.2 5倍,该酯酶在二甲亚砜中具有相当的稳定性;嗜盐古菌(H a l o f e r a xv o l c a n i i)1 7的嗜盐醇脱氢酶(A DH2)在二甲亚砜中也具有较好稳定性,3 0%二甲亚砜微扰酶2 4h(5),酶活性还保留有5 4.0%。然而,F a u l d s等1 8研究发现,低含量二甲亚砜对阿魏酸酯酶有促进其对底物水解的作用,当二甲亚砜含量大于2 0%时,酯酶活性开始呈下降趋势;刘永萍等1 9也发现,当卵巢癌细胞C A O V 3暴露在1.4%的二甲亚砜中2 4h,癌细胞端粒酶活性有所下降,暴露9 6h,端粒酶活性完全受抑制,且表现为可逆的抑制作用;C h e n等2 0研究表明,低浓度的二甲亚砜可导致对蘑菇酪氨酸酶的可逆失活作用,这种失活属于混合型抑制作用,半抑制浓度为2.4 5m o l/L。二甲亚砜对不同动物N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶也有不同效应。二甲亚砜溶液可导致凡纳滨对虾N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶的可逆失活作用,半抑制浓度为1.2m o l/L;0.2 4m o l/L二甲亚砜作用下,凡纳滨对虾N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶活性还保留有9 5%,低于该浓度被认为是可使用有机化合物溶剂的浓度6;而锯缘青蟹N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶在二甲亚砜溶液中也可产生可逆的失活作用,半抑制浓度为0.7 5m o l/L7;二甲亚砜对黄粉虫N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶也有明显失活作用,半抑制浓度约0.7 0m o l/L,失活过程也是可逆的,属于混合型抑制类型8。本试验中,二甲亚砜对中国鲎N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶也呈较强的抑制作用,半抑制浓度为0.2 1m o l/L,1 8.2 4mm o l/L二甲亚砜作用下酶活性仅失去5%,二甲亚砜超过此浓度对中国鲎生理将造成较大影响。这些结果显示,二甲亚砜对不同动物来源N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶的抑制效应有所差异,但该酶在二甲亚砜溶液中失活机制均是可逆的失活作用,说明这4种不同动物来源的N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶与二甲亚砜之间的相互作用机制是一致的,推测它们的酶活性中心组成可能大致相同。进一步比较二甲亚砜对上述4种不同动物来源N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶半抑制浓度的大小发现,中国鲎N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶的相对较小,说明中国鲎N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶对二甲亚砜溶剂较为敏感。3.2 酶蛋白在二甲亚砜溶剂中空间构象的变化测定效应物作用下酶蛋白光谱的变化规律,可以判断其对酶蛋白空间构象的影响。M a n g i a g a l l i等2 1研究表明,二甲亚砜对南极假丝酵母(C a n d i d aa n t a r c t i c a)脂肪酶B有激活效应,4 0%二甲亚砜能使酶活性提高6 6%,而2 0%和4 0%二甲亚砜溶剂对脂肪酶B荧光发射光谱无影响,其认为二甲亚砜并不影响酶蛋白的构象;M u k h e r j e e等2 2研究发现,5%二甲亚砜可使罗伦隐球酵母(C r y p t o c o c c u sl a u r e n t i i)R Y 1几丁质脱乙酰酶的活性提高2倍多,在1%5%的二甲亚砜微扰下酶蛋白内源荧光327第4期林建城等:二甲亚砜对中国鲎NAG a s e的抑制作用发射峰值得到提高,但发射峰值未出现位移现象,其认为二甲亚砜微扰下酶的空间构象发生了有利的变化,酶活性得到了提高。然而,二甲亚砜对绿色木霉(T r i c h o d e r m av i r i d e)纤维素酶具有极大的抑制作用,二甲亚砜微扰后酶蛋白在2 7 6n m处的紫外吸收峰未发生变化,荧光发射峰基本未位移,但荧光发射强度有所升高,提示二甲亚砜并未大幅度改变纤维素酶的分子构型1 5。目前,二甲亚砜溶剂对N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶构象的影响尚未见详细报道,本试验结果表明:二甲亚砜可使中国鲎N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶的紫外吸收值增强,但使得酶的内源荧光发射强度减弱,两者峰值均没有位移;二甲亚砜作用浓度达0.6 5m o l/L时,酶蛋白荧光强度接近于0,表明二甲亚砜溶剂作用下N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶的空间构象发生变化,但酶蛋白构型不变,构象变化导致酶失活。3.3 二甲亚砜对酶蛋白空间构象影响的可能机制二甲亚砜对酶蛋白空间构象影响机制的研究已获得较大进展。目前认为,二甲亚砜溶剂微扰后维系酶蛋白构象的次级键发生了变化,空间构象呈松散无序状态,致使酶蛋白变性失活。空间构象的破坏可能引起中国鲎N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶氨基酸残基中的紫外生色基团暴露出来,致使酶蛋白紫外吸收升高。中国鲎N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶分子在2 7 5n m波长处有紫外吸收峰,是酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸所贡献的。而酶蛋白的荧光发射峰主要来源于色氨酸1 4,中国鲎N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶酶蛋白的荧光发射峰在3 2 9.1n m处,推测N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶的色氨酸残基应该是埋藏于酶分子内核疏水区,二甲亚砜溶剂微扰后酶溶液极性降低了,致使-*跃迁的能量升高,酶蛋白荧光发射强度下降2 3。至于二甲亚砜也能使有些酶蛋白荧光强度增强的机制,可能与酶本身特性有关,黎春怡等2 3发现,二甲亚砜能使胃蛋白酶的荧光强度增强,酶荧光发射峰在3 4 0n m处,其认为可能是加入二甲亚砜后,改变了胃蛋白酶分子内部酪氨酸和色氨酸残基的微环境,从而处于淬灭状态的酪氨酸荧光得以恢复,也可能是由于色氨酸与酪氨酸之间的能量传递降低,从而使胃蛋白酶的荧光强度呈增强现象。4 结 论二甲亚砜对中国鲎N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶有较强抑制作用,该抑制作用呈剂量效应关系,二甲亚砜对酶的抑制是可逆的,属于竞争性-非竞争性混合型抑制作用;N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶在二甲亚砜溶剂中酶蛋白构象发生了变化,从而导致酶的失活,硝基苯-N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷底物对二甲亚砜溶剂引起的酶失活效应具有保护作用,底物浓度越大,对酶的保护作用越强。此外,海水中极低浓度的二甲亚砜虽未能对中国鲎N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶造成直接影响,但中国鲎N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶对二甲亚砜是敏感的,二甲亚砜对该酶可发挥明显的抑制作用,这可能会进一步影响中国鲎的蜕皮,有待于进一步探讨。参考文献:1 刘树深,刘芳,刘海玲.2 0种水溶性有机溶剂对发光菌的毒性效应J.中国环境科学,2 0 0 7,2 7(3):3 7 1-3 7 6.2YAN GGP,WAN GX,Z 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