红梅纯露和绿梅纯露的体外护肤功效研究及比较.pdf

Technique express科技广场17第46卷2023年第8期梅花（Mume Flos）是蔷薇科杏属植物，含有丰富的挥发油类、黄酮类以及苯丙素类等化合物1，其中绿原酸、异槲皮苷、金丝桃苷是梅花指标性成分2；梅花也是我国的传统药材，大量药理学研究表明，梅花具有抗炎3、抗抑郁4、抗氧化清除自由基5和抑制黑色素生成6的作用。在化妆品行业中，研究报道比较多的是梅花提取物，其制备工艺大多集中于梅花的水提或者醇提，对梅花纯露的研究较少，大多数梅花提取物功效主要围绕抗氧化、美白、抗炎等。Nakamur等7从梅花中分离出苯丙素酰化糖苷类化合物、酰化奎宁酸类似物等，并发现它们能有效抑制黑色素的生成；查雨锋等8利用醇提得到的白梅花提取物具有明显的抗氧化和美白功效，赵乐荣等9利用醇提得到的青梅花提取物具有明显的保湿和抗皱功效。纯露是植物花瓣在水中蒸馏萃取过程中产生的一种饱和蒸馏原液10，成分天然，香味怡人，温和无刺激，皮肤易吸收。王斌等11通过对属于蔷薇科的玫瑰提取纯露，研究发现玫瑰纯露具有显著的抗氧化活性，刘梦洁等12以高良姜纯露为研究对象，发现其具有良好的总抗氧化能力。红梅花与绿梅花同属于蔷薇科杏属植物，由于品种不同，其组成成分含量也不同；本研究探讨了梅花纯露的体外护肤功效，同时比较红梅纯露和绿梅纯露的功效差异，为后续梅花纯露在化妆品中的应用提供参考。1 实验部分1.1 主要材料、试剂与仪器角质形成细胞（HaCaT细胞）、小鼠黑色瘤细胞（B16F10细胞），上海富恒生物科技有限公司；磷酸缓冲盐溶液、CCK8试剂盒、-MSH、RPMI1640培养液（含双抗），北京索莱宝生物科技有限公司；胎牛血清，浙江天杭生物科技股份有限公司；总抗氧化能力测试试剂盒，南京建成生物工程研究所；引物，金斯瑞生物科技有限公司；RNAiso Plus kit、PrimeScript RT reagent Kit、TB Green qPCR，宝日医生物技术有限公司。红梅纯露和绿梅纯露的体外护肤功效研究及比较陈志雄，曹 平，晏 翠，郑中博（湖州嘉亨实业有限公司 研发中心，浙江 湖州 313013）摘 要：研究红梅纯露和绿梅纯露的体外护肤功效。通过CCK8实验初步判断红梅纯露和绿梅纯露作为天然的护肤活性物都具有一定的安全性；通过总抗氧化能力实验，发现两种纯露都具有一定的总抗氧化能力，且绿梅纯露的总抗氧化能力高于红梅纯露；通过氢氧化钠裂解法测定B16F10黑色素含量，表明红梅纯露和绿梅纯露都能明显降低由-MSH诱导的B16F10细胞中黑色素的含量，且绿梅纯露抑制黑色素合成的效果优于红梅纯露；通过荧光定量PCR实验发现，绿梅纯露抑制MITF、TNF-的mRNA表达水平比红梅纯露更加显著。结果表明，红梅纯露和绿梅纯露具有一定的体外护肤功效，且绿梅纯露的功效强于红梅纯露。关键词：纯露；美白；总抗氧化能力；抗炎中图分类号：TQ658 文献标识码：A 文章编号：1006-7264（2023）08-017-06DOI：10.3969/j.issn.1006-7264.2023.08.004收稿日期：2023-05-25作者简介：陈志雄（1985-），男，浙江人，E-mail:chenzhixionghz-。Technique express科技广场18Vol.46 No.8 Aug.2023红梅纯露（Rph）、绿梅纯露（Gph），来源于湖州东方梅园（原材料种植于同一基地，采用相同方法制备纯露），用PBS缓冲液稀释成适当倍数再加入到细胞培养液中。CO2培养箱bluepard，上海一恒科学仪器有限公司；多功能酶标仪MULTISKAN，赛默飞世尔科技有限公司；倒置生物显微镜，奥林巴斯中国有限公司；离心机TDL-60C，上海安亭科学仪器厂；Bio-rad CFX Connect，伯乐生命医学产品有限公司。1.2 实验方法1.2.1 细胞培养和分组角 质 形 成 细 胞（HaCaT细 胞）、小 鼠 黑 色 瘤 细 胞（B16F10细胞）使用RPMI1640培养液（含体积分数1%的青-链霉素，体积分数1%的胎牛血清）在37、5%CO2条件下培养，当细胞生长到80%左右时，采用浓度为0.25%的胰酶进行消化，并用细胞计数器计数，最后制备一定浓度的细胞悬液接种于细胞培养皿传代。抗炎功效实验中角质形成细胞实验分为3组：空白对照组、十二烷基硫酸钠模型组、样品实验组，均以5 104个/mL培养于细胞六孔板中；其中空白对照组细胞不经过任何处理（不加十二烷基硫酸钠和样品），十二烷基硫酸钠模型组细胞采用终浓度为80 g/mL的十二烷基硫酸钠处理4 h，样品实验组细胞先用一定浓度的纯露处理24 h后，倒掉纯露再用无菌PBS清洗3遍，最后再加入终浓度为80 g/mL的十二烷基硫酸钠处理4 h13。B16F10细胞黑色素相关实验分为3组：空白对照组、-MSH模型组、样品实验组，均以5 104个/mL培养于细胞六孔板中；其中空白对照组细胞不经过任何处理（不加-MSH和样品），-MSH模型组细胞采用终浓度为100 nmol/L的-MSH处理24 h14，样品实验组细胞先用终浓度为100 nmol/L的-MSH预处理24 h，倒掉培养液后再用无菌PBS清洗3遍，最后再加入不同浓度的纯露处理24 h。1.2.2 总抗氧化能力（T-AOC）测试将红梅纯露和绿梅纯露用PBS缓冲液稀释成5%、10%、20%（体积分数）3个浓度，再根据总抗氧化能力试剂盒说明书进行测试，每个浓度重复3次。1.2.3 红梅纯露和绿梅纯露对细胞增殖活力影响的测定CCK8法测试细胞增殖活力具有重复性好，对细胞毒性小等优点。取传代45代的处于对数生长期的HaCaT细胞和B16F10细胞，细胞密度为4104个/mL，接种于96孔板中，在37、5%CO2条件下培养12 h左右，再加入10%培养液体积的已配好浓度的纯露样品；等样品与细胞作用24 h后，再加入10%的CCK8试剂，细胞培养箱中孵育2 h左右，最后在酶标仪上测定450 nm下的吸光值，每个浓度重复5次。细胞增殖率计算公式15：细胞活力=实验组A凋零孔A对照组A凋零孔A100%1.2.4 B16F10细胞内黑色素含量的测定通过氢氧化钠裂解法测定细胞内黑色素含量16。取传代45代的处于对数生长期的B16 F10细胞，密度为5 105个/mL，接种于细胞6孔板中，在37、5%CO2条件培养12 h左右，再用终浓度为100 nmol/L的-MSH预处理24 h，最后加入10%培养液体积的已配好浓度的纯露样品，培养24 h后吸弃上清液，加入1 mL已灭菌过的PBS洗涤1次，再加入200 L含10%DMSO的1 mol/L NaOH，在85 水浴锅中反应40 min，最后于酶标仪上测405 nm处吸光度值。相对黑色素含量计算公式如下：相对黑色素含量=实验组A凋零孔A对照组A凋零孔A100%1.2.5 荧光定量PCR检测MITF和TNF-的mRNA表达水平 MITF和TNF-基 因 表 达 水平 的 前 期 细 胞 培 养 按1.2.1方法操作，利用RNAiso提取每孔总RNA，然后采用PrimeScriptRT reagent Kit把总RNA逆转成cDNA，加入SYBR试剂、基因引物以及基因模板后，进行实时荧光定量PCR反应。反应程序为两步法，具体程序如下：预变性95、30 s；PCR反应（95、5 s，60 、30 s）40次循环。引物序 列 如 下：Actin F：GTTGGACCTGACAGACTACCTCA，R：G T T G C CA ATAG T G AT G AC C T；M I T F F：AGCGTGTATTTTCCCCACAG，R：TAGCTCCTTAATGCGGTCGT；T N F-F：G AG G C CA AG C C C T G G TAT G，R：CGGGCCGATTGATCTCAGC。1.2.6 数据分析实验数据以GraphPad Prism 9软件计算，结果以xs表示，不同实验条件下比较均采用齐性方差t检验，再用One-Way ANOVO 完成数据分析，p0.05有差异统计学意义。2 结果与讨论2.1 红梅纯露和绿梅纯露对 HaCaT 和 B16F10 细胞增殖的影响不同浓度的红梅纯露和绿梅纯露作用于HaCaT和B16F10Technique express科技广场19第46卷2023年第8期细胞24 h后，其增值率如图1、2所示。从图1可以看出，当红梅纯露稀释10倍和100倍后，对HaCaT细胞具有明显的促进增殖作用，细胞活力分别达到127.12%3.11%（p0.01）、137.545.39%（p0.01），都具有统计学意义，其他浓度红梅纯露对HaCaT细胞没有促进增殖，也没有毒性；而绿梅纯露不管是高浓度还是低浓度，对HaCaT细胞都没有影响。从图2中可以看出，不同浓度的红梅纯露对B16F10细胞都没有影响；而绿梅纯露在低浓度下对B16F10细胞没有影响，但当在稀释10倍浓度下对B16F10细胞有一定的抑制生长的作用，此时细胞增值率为93.58%1.43（p0.05）。在这些不同浓度纯露作用下，HaCaT细胞和B16F10细胞的形态都没有发生改变；当细胞活力小于80%时，可说明该样品对细胞存在毒性15，而从图中可知在2种纯露作用下，2种细胞的活力均在90%以上；后续功效实验红梅纯露和绿梅纯露均选择10-3 g/mL作为实验浓度，因为2种纯露在这个浓度下对HaCaT细胞和B16F10细胞的增殖率没有影响；由于角质形成细胞和黑色素细胞是皮肤表皮层上的细胞，通过上述细胞增殖率实验结果分析初步判断红梅纯露和绿梅纯露作为天然护肤活性物都具有一定安全性。图1 纯露对角质形成细胞的增殖作用Fig.1 EffectsofhydrolatsonthecellviabilityofHaCaTcells图2 纯露对黑色素细胞的增殖作用Fig.2 EffectsofhydrolatsonthecellviabilityofB16F10cells200150100500150100500*nsns细胞增值率/%细胞增值率/%Control10-110-210-3Control10-110-210-3Rph/(g/mL)Gph/(g/mL)150100500150100500*nsns细胞增值率/%细胞增值率/%Control10-110-210-3Control10-110-210-3Rph/(g/mL)Gph/(g/mL)2.2 红梅纯露和绿梅纯露总抗氧化能力（T-AOC）的功效研究由图3（图中不同小写字母表示同种纯露不同浓度之间差异显著（p0.05）可知，红梅纯露和绿梅纯露体积分数为5%时，总抗氧化能力分别是（24.673.06）U/mL、（32.673.05）U/mL，可知在低浓度时绿梅纯露的总抗氧化能力高于红梅纯露；随着样品浓度升高，红梅纯露和绿梅纯露的总抗氧化能力也逐渐升高，当样品体积分数为20%时，红梅纯露和绿梅纯露的总抗氧化能力分别是（75.333.04）U/mL、（85.683.51）U/mL，可知在高浓度时绿梅纯露的总抗氧化能力高于红梅纯露，且2种纯Technique express科技广场20Vol.46 No.8 Aug.2023露在不同浓度之间的总抗氧化能力存在统计学差异。通过本研究发现，2种纯露具有一定的总抗氧化能力，随着浓度升高，其总抗氧化能力也随着升高；且不管是在低浓度、中浓度还是高浓度，绿梅纯露的总抗氧化能力都高于红梅纯露。图3 纯露的总抗氧化能力Fig.3 Totalantioxidantcapacityofhydrolats2.3 红梅纯露和绿梅纯露对 B16F10 细胞内黑色素含量的影响一定浓度的-MSH能诱导B16F10细胞合成黑色素17，在本研究中B16F10经过100 nmol/L的-MSH诱导24 h后，其黑色素含量上升到139.63%，与空白对照组相比上升了39.63%2.33%（p0.001），具有极显著的统计学差异，说明在本实验中-MSH诱导B16F10细胞高表达黑色素模型建立成功。当加入 一定浓度的红梅纯露和绿梅纯露作用24 h后，其黑色素含量分别下降到125.63%2.73%、115.2%2.37%。综上分析可知，从黑色素含量的下降水平初步判断绿梅纯露抑制黑色素合成的效果优于红梅纯露，推断绿梅纯露的美白功效优于红梅纯露。图4 纯露对-MSH诱导的黑色素细胞黑色素合成的影响Fig.4 EffectsofhydrolatsonmelaninsynthesisinB16F10cellsinducedby-MSH2.4 红梅纯露和绿梅纯露对 B16F10 细胞 MITF 的mRNA 表达的影响黑色素的合成受到酪氨酸酶基因的调控，而酪氨酸酶基因的表达又受到多个转录因子的调节，其中小眼畸形转录因子（MITF）是黑色素细胞中最重要的转录因子之一，它能和酪氨酸酶基因的启动子结合，最终影响黑色素细胞的存活、分化和黑色素的合成18-20。在本研究中B16F10经过100 nmol/L的-MSH诱导24 h后，其MITF的mRNA表达水平上升到1.620.036（空白对照组为0.990.02，p0.001），与空白对照组相比具有极显著的统计学差异；当加入一定浓度的红梅纯露和绿梅纯露作用24 h后，其MITF的mRNA表达水平下降到1.460.05、1.250.03，与-MSH模型组相比，MITF的mRNA表达水平明显下降，且有统计学差异（p0.05，p0.001）。综上分析可知，红梅纯露和绿梅纯露都可以通过抑制MITF的mRNA表达来降低黑色素的生成，且绿梅纯露的抑制效果优于红梅纯露。图5 纯露对-MSH诱导的黑色素细胞中MITF基因表达的影响Fig.5 EffectsofhydrolatsonMITFexpressionofB16F10cellsinducedby-MSH2.5 红梅纯露和绿梅纯露的抗炎功效十二烷基硫酸钠能破坏皮肤表皮的屏障功能，且能通过TNF-信号通路引发皮肤炎症21，本实验通过一定浓度的SLS建立炎症模型。从图6中可以看出，SLS模型组的TNF-的mRNA表达水平上升到1.800.05（空白对照组为1.000.02，p0.001），与空白对照组相比具有极显著的统计学差异，说明在本实验中一定浓度的SLS诱导HaCaT细胞炎症因子高表达模型建立成功；当加入一定浓度的红梅纯露和绿梅纯露作用24 h后，其TNF-的mRNA表达水平下降到1.480.08、1.220.07，与SLS模型组相比，TNF-的mRNA表达水平明显下降，且有统计学差异（p0.01，p0.001）。综上分析可知，一定浓度的红梅纯露和绿梅纯露都能抑制HaCaT细胞中TNF-的mRNA表达水平，且绿梅纯露的抑制效果优于红梅纯露，初步推测绿梅纯露的抗炎功效优于红梅纯露。Control-MSHRphGph*黑色素含量/%150100500*-MSHControl-MSHRphGph*MITF mRNA2.51.51.00.5*-MSH0.01008006040200510152025总抗氧化能力/（U/mL)RphGphccbbaa/%Technique express科技广场21第46卷2023年第8期 图6 纯露对SLS诱导的角质形成细胞中TNF-基因表达的影响Fig.6 EffectsofhydrolatsonTNF-expressionofHaCaTcellsinducedbySLS3 结论不同浓度的红梅纯露和绿梅纯露作用于HaCaT和B16F10细胞，2种细胞均表现出比较高的增殖活力，说明红梅纯露和绿梅纯露作为护肤活性物具有一定的安全性；通过总抗氧化能力实验，不同浓度的红梅纯露和绿梅纯露均表现出一定的总抗氧化能力，且绿梅纯露的总抗氧化能力高于红梅纯露。通过测定黑色素含量实验发现红梅纯露和绿梅纯露都能明显抑制B16F10细胞中黑色素的生成，绿梅纯露抑制黑色素合成的效果优于红梅纯露；且从黑色素生成的调控机理上分析，绿梅纯露抑制MITF的mRNA表达水平比红梅纯露更加显著，推断绿梅纯露的美白功效优于红梅纯露；通过一定浓度的SLS建立炎症模型，发现实验组的TNF-的mRNA表达水平显著低于模型组，推测红梅纯露和绿梅纯露具有一定的抗炎功效，且绿梅纯露的抗炎功效强于红梅纯露。参考文献：1 WANG CANCAN,ZHANG WEI,WU DELING,et al.Study on the chemical constituents of the ethyl acetate parts of prunus mumeJ.China Journal of Chinese Materia Medica,2020,45(2):347-351.2 YAN HUI,LAN JINSHAN,PU ZONGJIN,et al.Advances in studies on chemical compositions and pharmacological activities of Mume FlosJ.Chinese Traditional and Herbal Drugs,2021,52(11):3453-3461.3 QI JIANHONG,DONG FANGXU.Research progress of the pharmacological action of flavonoidsJ.Journal of Beijing Union University,2020,34(3):89-92.4 CHEN JING,CHEN MINGZHU,HUANG XIANGYU,et al.The antidepressant effect of Prunus mume extract on miceJ.Strait Pharmaceutical Journal,2016,28(7):20-22.5 ZHANG QINGHUA.Study on chemical constituents of ControlSLSRphGph*TNF mRNA2.01.51.00*Prunus mume and pre-test of biological activityD.Jinan:Shandong University,2008.6 PI K,LEE K.Prunus mume extract exerts antioxidant activities and suppressive effect of melanogenesis under the stimulation by alpha melanocyte stimulating hormone in B16-F10 melanoma cellsJ.Biosci Biotechnol Biochem,2017,81(10):1883-1890.7 NAKAMURA S,FUJIMOTO K,MATSUMOTO T,et al.Acylated sucroses and acylated quinic acids analogs from the flower buds of Prunus mume and their inhibitory effect on melanogenesisJ.Phytochemistry,2013,92:128-136.8 ZHA YUFENG,HUANG JIAWEN,ZHAN YI,et al.Evaluation of antioxidant and whitening efficacy of Prunus mume extractJ.China Surfactant Detergent&Cosmetics,2022,52(2):172-179.9 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KUANMIN,ZHI XUBO,et al.Inhibitory effect of tripeptide D-Trp-Arg-Leu-NH2 on melanin formation in B16 murine melanoma cellsJ.Flavour Fragrance Cosmetics,2023,196(1):82-86.15 LVKE,LIJING,ZHANGDI.Protection of human skin cells against stress damage by use of Y2SK2 and SK3 type dehydrins from agapanthus praecoxJ.China Surfactant Detergent&Cosmetics,2020,50(2):76-85.16 PARK S,SEOK J K,KWAK J Y,et al.Anti-melanogenic effects of resveratryl triglycolate,a novel hybrid compound derived by esterification of resveratrol with glycolic acidJ.Arch Dermatol Res,2016,308:325-334.0.5Technique express科技广场22Vol.46 No.8 Aug.2023Study and comparison of the skin care efficacy of the red plum hydrolat and green plum hydrolat in vitroCHEN Zhi-xiong,CAO Ping,YAN Cui,ZHENG Zhong-bo(R&D Center,Huzhou Jaheng Industrial Co.,Ltd.,Huzhou,Zhejiang 313013,China)Abstract:The skin care effects of red plum hydrolat and green plum hydrolat were studied in vitro.According to CCK8 experiment,both red plum hydrolat and green plum hydrolat had certain safety as natural skin care actives.Through the total antioxidant capacity experiment,it was found that both the two kinds of hydrolats had certain total antioxidant capacity,and the total antioxidant capacity of green plum hydrolat was higher than that of red plum hydrolat.The content of melanin in B16F10 cells was determined by sodium hydroxide lysis method,and the results showed that both red plum hydrolat and green plum hydrolat could significantly reduce the content of melanin in B16F10 cells induced by-MSH,and the inhibition effect of green plum hydrolat on melanin synthesis was better than that of red plum hydrolat.Fluorescence quantitative PCR experiment showed that green plum hydrolat inhibited mRNA expression levels of MITF and TNF-more significantly than red plum hydrolat did.Therefore,red plum hydrolat and green plum hydrolat both had certain skin care effects in vitro,and the effect of green plum hydrolat was stronger than that of red plum hydrolat.Key words:hydrolat;whitening;total antioxidant capacity;anti-inflammation（本文编辑 张 静）17 TSATMALI M,ANCANS J,THODY AJ.Melanocyte function and its control by melanocortin peptidesJ.Histochem Cytochem,2002,50(2):125 18 VANCE K W,GODING C R.The transcription network regulating melanocyte development and melanomaJ.Pigment Cell Research,2010,17(4):318-325.19 DONG YI,KANG XINYUE,WANG CHUNSHENG.Progress on the research of biosynthesis and regulation of mammalian melaninJ.Chinese Bulletin of Life Sciences,2022,34(8):990-1000.20 MA ZIYU,LUYANG.Melanin synthesis and regulation in vivo and commonly used melanin inhibitors from natural products and traditional Chinese medicineJ.China Journal of Chinese Materia Medica,2020,45(24):5898-5916.21 YANG Y,CHANG C,HUANG C,et al.Anti-inflammation and anti-apoptosis effects of pearl extract gel on UVB irradiation HaCaT cellsJ.Biomed Mater Eng,2015,26(Suppl 1):S139-145.Research and development of a new liquid for anti-inflammatory wipesYANG Li-ye1,QIAO Wu2,JIA Ting-han2,KEN Kaku2,AKIRA Okamoto1(1.Pigeon Industries(Changzhou)Co.,Ltd.,Changzhou,Jiangsu 213100,China;2.Pigeon Manufacturing Shanghai Co.,Ltd.,Shanghai 201700,China)Abstract:A new kind of liquid for the wipes with anti-inflammatory effects was developed.The cell viability was detected by Cell Counting Kit 8(CCK-8);the cell morphology was observed by inverted microscope;the IL-1 content of UVB-induced keratinocytes and the IL-1 content of restructured epidermis induced by SLS were measured by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).At the cellular level,1.56 mg/mL allantoin,0.31%Sinocalmant and 0.002 4%alkannin significantly reduced the content of IL-1(P0.05).At the level of restructured epidermis,1%Sinocalmant and 0.8%Sinocalmant+0.02%alkannin significantly reduced the IL-1 content compared with the formula of original baby wipes(P0.05).Therefore,combining the liquid for baby wipes with Sinocalmant and alkannin could obtain better anti-inflammatory effects.Key words:alkannin;wet wipe;anti-inflammatory;restructured epidermis （本文编辑 张 静）（上接第16页）