霍乱毒素B亚基与草鱼呼肠孤病毒VP7融合基因的合成和原核表达.pdf
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1、 鲁东大学学报(自然科学版)()():收稿日期:修回日期:基金项目:山东省科技攻关计划()通信作者简介:张秋胜()男副教授硕士研究生导师博士研究方向为动物病害防治:.:././.霍乱毒素 亚基与草鱼呼肠孤病毒 融合基因的合成和原核表达王桐桐金姗姗韩玉行索美涛郭新琦张秋胜(鲁东大学 农学院山东 烟台)摘要:草鱼呼肠孤病毒()是一种致病力强严重危害水产养殖业健康发展的病毒免疫接种疫苗是预防 的有效途径而口服免疫接种对生活在水中的鱼类是一种理想的接种方式 衣壳蛋白 具有较好的免疫原性 霍乱毒素 亚基()是一种较好的黏膜佐剂 本研究采用 技术将 基因和 基因进行柔性融合获得 的 融合基因构建重组表达质
2、粒 转化大肠杆菌 ()获得了表达 融合蛋白的菌株当采用异丙基硫代半乳糖苷()诱导时获得 融合蛋白的分子量约 与预期的分子量大小一致 当 浓度为 诱导温度为 诱导转速为 诱导表达 时 融合蛋白的表达量最大达到 融合蛋白在菌体中主要以包涵体的形式存在 在融合蛋白纯化时洗脱缓冲液中咪唑浓度为 目标蛋白纯度达 本研究通过基因合成和原核表达得到 融合蛋白为进一步验证 融合蛋白能否作为抵抗 的粘膜疫苗奠定了基础关键词:草鱼呼肠孤病毒 蛋白粘膜疫苗融合表达中图分类号:文献标志码:文章编号:()黄河三角洲地区淡水资源丰富具有发展水产养殖得天独厚的优越条件 养殖草食性鱼类尤其草鱼是降低成本、增加效益、提高土地利
3、用效率的一项重要措施 草鱼()是我国的主要水产养殖鱼类之一而草鱼出血病可致草鱼死亡率达 给我国水产养殖业带来了巨大的损失 草鱼出血病的病原是草鱼呼肠孤病毒()这是由中国 分 离、鉴 定 的 第 一 株 水 生 动 物 病 毒 的形态学、流行病学、理化及分子生物学等方面已进行了系统的研究 当前没有有效的药物可以治疗草鱼出血病因此接种疫苗是目前最积极有效的方法 目前草鱼出血病的疫苗主要是灭活疫苗、减毒疫苗、亚单位疫苗以及 疫苗这些疫苗均采用注射接种 这种传统的注射接种方式存在鱼类应激性强、劳动强度大等缺点而口服疫苗具有成本低、易接种适用于不同规格的水产动物等优点是国内外水产疫苗的研究热点也是未来发
4、展的趋势 病毒含有 种衣壳蛋白组分()其中 蛋白是草鱼呼肠孤病毒主要的外衣壳组分在病毒的感染、免疫及致病过程起着非常重要的作用 相对于该病毒的其他结构蛋白而言能使草鱼产生对 的免疫保护具有较强的免疫原性 因此 是用于疫苗设计的首选抗原霍乱病毒 亚基()是霍乱肠毒素的无毒亚基其最基本的受体神经节苷酯()存在于大多数哺乳动物细胞表面使 具备了良好的佐剂效能 能增强树突状细胞及其他抗原提呈细胞对抗原的提呈作用诱导机体分泌特异性抗体并刺激 细胞、细胞和抗原提呈细胞表面的受体表达 作为免疫载体的重要功 鲁东大学学报(自然科学版)第 卷能可以使融合蛋白更易与消化道粘膜作用产生更强的免疫效果 与抗原混合或构
5、建原核载体表达 抗原耦合的重组蛋白在应用中均获得了口服免疫保护效果 因此和 作为融合蛋白将是口服疫苗的较好选择本研究将 基因与 基因结合成功构建了 重组质粒并将其转入大肠杆菌感受态细胞()中利用异丙基硫代半乳糖苷()诱导其表达出 融合蛋白并对其表达优化和蛋白纯化研究 利用融合抗原 制备粘膜疫苗该粘膜疫苗可通过口服和浸泡的方式使草鱼的幼鱼达到免疫和更早保护的目的同时还可以大批量免疫接种从而降低免疫成本为 的免疫防治提供了新途径 材料与方法.实验材料、和 等质粒大肠杆菌()和大肠杆菌 等菌株均由本实验室保存.试剂 连接酶、内切酶和 等购自宝生物工程(大连)有限公司 纯化回收试剂盒、质粒小提试剂盒购
6、于北京全式金生物技术有限责任公司 异丙基硫代半乳糖苷()、咪唑()、尿素()和引物购自生工生物工程(上海)股份有限公司 其他试剂均为国产分析纯.基因的合成设计含一端含 酶切位点的 引物序列如下:引物:(下划线部分为 酶切位点)引物:引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成 以 质粒为模板 和 为引物采用 扩增 基 因 的 反 应 体 系 如 下:质粒 反应条件为:变性 复性 延伸 共 个循环根据 中 基因序列(.)设计引物:引物:引物:下划线部分为 酶切位点)以 质粒为模板 扩增 基因 的反应体系如下:质粒 反应条件同上将上述扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳检测并用试剂盒回收相应的目的片段获得
7、 和 的基因片段 将上述两种目的 片段等量混合为模板以 和 为引物 扩增合成 融合基因 反应体系如下:和 的基因扩增片段的等体积混合物 反应条件同上通过琼脂糖胶电泳和切胶回收 的 片段置于 存放备用.构建表达载体与转化表达菌株将上述所构建的 基因与 表达载体分别用 进行酶切 酶切体系如下:倍缓冲液 目的片段 孵育 将酶切产物经凝胶电泳后进行 胶回收 回收后的 基因与 载体利用 连接酶于 下连接 经 鉴定和测序验证将正确的重组表达质粒 在 下热击 转化到表达菌株()中获得表达菌株保藏并扩大培养.融合蛋白的诱导条件优化按本实验室赵燕的方法进行条件优化 分别进行 浓度(、)、诱导时间(、)、培养转速
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