固相萃取_高效液相色谱法测定牲畜饲养废水中（+）-氯前列烯醇.pdf

建立了一种检测方法用于测定牲畜饲养废水中兽药（+）-氯前列烯醇。本方法采用C18固相萃取小柱富集水样，然后用乙腈溶剂洗脱，洗脱液经浓缩定容后用具有紫外-可见光检测器的高效液相色谱仪分离检测。高效液相色谱条件采用C18（2504.6mm，5m）为色谱柱，40%乙腈（0.01%三氟乙酸）+60%水（0.01%三氟乙酸）为流动相，检测波长为200nm、210nm和274nm。将该方法应用于养猪场废水中兽药（+）-氯前列烯醇的检测，研究结果表明，当取样体积为1.0L，洗脱液浓缩至0.50mL，进样量为30.0L时，该方法的检出限为0.018g/L，检出下限为0.072g/L，满足废水中（+）-氯前列烯醇的检测分析要求。关键词：固相萃取；高效液相色谱法；饲养废水；（+）-氯前列烯醇中图分类号：O657.72文献标识码：A文章编号：1009-8143（2023）03-0033-04Doi:10.3969/j.issn.1009-8143.2023.03.06Determination of（+）-Cloprostenol in Livestock Breeding Wastewater by Solid PhaseExtraction/High Performance Liquid ChromatographyChen Qun1，Wang Ji-zhong2，Lin Yong-hui1，Lin Wen-juan1，Wang Jia-sheng1，Lin Yong-xiang1*（1.GRG Metrology&TEST（Fuzhou）Co.，LTD，Fuzhou，Fujian 350000，China；2.GRG Metrology&TEST（Hefei）Co.，LTD，Hefei，Anhui 230000，China）Abstract:A new method was developed for the determination of（+）-cloprostenol in livestock breeding wastewater.In thismethod，the（+）-cloprostenol in breeding wastewater was enriched by C18solid phase column，then eluted by acetonitrilesolvent.The eluent was concentrated and detected by HPLC with ultraviolet-visible light detector.A chromatographic column of C18（2504.6mm，5m）was used，with the mobile phase of 40%acetonitrile（0.01%trifluoroacetic acid）+60%water（0.01%trifluoroacetic acid）in the chromatographic conditions.The detective wavelength were 200nm，210nm and274nm.The method was applied to the determination of the（+）-cloprostenol in the wastewater of pig farms，the resultsshow that when the sample volume is 1.0L，the constant volume of eluent is 0.50mL，and the injection volume is 30.0L，thedetection limit of this method is 0.018g/L，the lower limit of detection is 0.072g/L.It can meet the requirement of analysis of（+）-cloprostenol in breeding wastewater.Key words：Solid Phase Extraction；HPLC；Livestock breeding wastewater；（+）-Cloprostenol1背景（+）-氯前列烯醇，是一种人工合成的前列腺素PGF2类似物，能够使卵巢上的功能性黄体和病理性黄体迅速退化，促进平滑肌收缩，促进催产素分泌，而且在实际使用中用量少，效果显著，因此，技术交流332023，32（3）福建分析测试技术交流（+）-氯前列烯醇以制成注射液的针剂面世，在国外亦称之为达尔马金，被广泛地应用于动物的繁殖控制，卵巢及子宫疾病的治疗等方面。13（+）-氯前列烯醇及其钠盐作为一种优异的兽药在使用中也存在着一定的安全风险，其易于通过皮肤吸收的特性，可诱导流产和急性支气管痉挛，对于妊娠妇女和患有哮喘病及其它呼吸道疾病的人员来说具有一定的危险性，接触剂量过大时还有可能会引发腹泻，因此在生产、使用过程中需要格外小心。4目前，对于氯前列烯醇或氯前列烯醇钠的研究主要集中在牲畜繁殖、疾病治疗、兽药等行业领域，对其分析检测研究比较少，在环境领域中的研究更是鲜有报道。1978 年，Peter R.Reeves 等5采用14C同位素追踪检测的方法研究了氯前列烯醇在奶牛体内的代谢途径和过程，以及氯前列烯醇在奶牛代谢产物中的残留量。张航俊等6建立了一种高效液相色谱法来测定氯前列醇钠的含量，以及研究氯前列醇钠合成过程中产生的杂质对其测定的干扰影响。他们建立了正相和反相两种色谱条件，最终证明采用正相色谱条件可以实现氯前列醇钠和杂质的完全分离，其采用的正相色谱条件如下：以冰乙酸-无水乙醇-正己烷（1：100：900）为流动相，Agilent ZORBAX RX-SIL（4.6mm250mm，5m）为色谱柱，检测波长为220nm，在0.052.50mg/mL浓度范围内对氯前列醇钠进行研究。Kvta Kalkov等7建立了一种高效液相色谱法来研究氯前列烯醇的手性分离，并对其进行定量分析。其采用的是ChiralcelOD-RH手性色谱柱，以乙腈-磷酸二氢钠缓冲溶液（33：67）为流动相，检测波长是274nm和210nm。以上研究主要是进行含量的测定和手性分离，研究的对象均是高浓度的氯前列烯醇或氯前列烯醇钠溶液，杂质干扰少，检测分离较为容易。由于（+）-氯前列烯醇在畜牧业中的广泛应用，随着（+）-氯前列烯醇从牲畜体内的代谢排出，使得在牲畜养殖场中牲畜的排泄物和饲养废水中都有可能存在（+）-氯前列烯醇的污染风险。但此类废水中杂质多，基质干扰严重，需要经过复杂的前处理过程，同时，废水中（+）-氯前列烯醇的含量非常低，对检测方法的检出限要求高，目前尚无相关的检测方法报道。本文建立了检测牲畜饲养废水中（+）-氯前列烯醇的含量前处理方法和仪器分析方法，该方法可以为（+）-氯前列烯醇的环境检测提供技术支撑，对保障水质安全有着一定意义。2实验部分2.1仪器与试剂高效液相色谱仪（HPLC）具有可调波长紫外-可见光检测器和梯度洗脱功能，品牌：Agilent，型号规格：1260 Infinity II，检测器型号：G7114A。固相萃取真空装置，品牌：上海安谱实验室科技股份有限公司，型号：SBEQ-CG1824。固相萃取柱，品牌：CNWBOND，型号：LC-C18，规格：1000mg，6mL，填料粒径50-70m。循环水真空泵，厂家：广州市丹安仪器仪表有限公司，型号：SHZ-D（）。电子天平，品牌：梅特勒，型号：ME204E。玻璃纤维滤膜，孔径0.45m，厂家：上海兴亚净化材料厂。标准物质：（+）-氯前列烯醇，CAS号54276-21-0，厂 家：CATO Research Chemicals Inc.，纯 度：98.0%，批号：0929-RC-0006。乙腈、甲醇均为色谱纯，厂家：上海安谱实验室科技股份有限公司。三氟乙酸，纯度99.5%，厂家：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。2.2标准溶液的制备标准储备液：采用减量法称取（+）-氯前列烯醇标准物质5.0mg，用乙腈溶解定容至10.0mL，配制成浓度为490mg/L标准储备液。标准中间液：用乙腈稀释标准储备液，配制成浓度为10.0mg/L标准中间液。校准曲线工作液：用流动相稀释标准中间液配制校准曲线工作溶液，浓度分别为0g/L、200g/L、400g/L、800g/L、1000g/L、1500g/L、2000g/L。2.3高效液相色谱条件色 谱 柱：FeiniGen X-Peonyx C18（2504.6mm，5m）；流动相比例：40%乙腈（0.01%三氟乙酸）+60%水（0.01%三氟乙酸）；流动相流速：1.00mL/min；采集时长：12.0min；进样量：30.0L；柱温：35.0；紫外检测器的波长：200nm，210nm，274nm。2.4样品的采集、保存与制备（1）样品的采集与保存：用采水器具采集水样，静置沉淀半小时后，取上层水样于2L具塞棕色玻璃瓶中，04保存。水样送回实验室后，经过0.45m玻璃纤维滤膜减压抽滤，量取滤液1.0L于04保342023，32（3）存备用。（2）样品的制备：依次用 10.0mL 乙腈、10.0mL水活化C18固相萃取小柱，活化过程中，保持柱子湿润。将水样以不超过5mL/min的流速流过已活化好的固相萃取小柱，水样富集完后用10.0mL水冲洗固相萃取小柱，真空抽滤10min，使柱干燥。然后用10.0ml乙腈洗脱固相萃取小柱，流速控制在1-3mL/min，收集洗 脱 液。将 洗 脱 液 浓 缩 至 0.50mL 左 右，加 入5.00mL 乙腈，再浓缩至 0.50mL 以下，最终定容至0.50mL，待测。3结果与讨论3.1流动相比例的优化为了优化（+）-氯前列烯醇与杂质的分离度，本研究采用了 6种不同比例的流动来研究其分离效果，具体如下：80%乙腈（0.01%三氟乙酸）+20%水（0.01%三氟乙酸）、70%乙腈（0.01%三氟乙酸）+30%水（0.01%三氟乙酸）、60%乙腈（0.01%三氟乙酸）+40%水（0.01%三氟乙酸）、50%乙腈（0.01%三氟 乙 酸）+50%水（0.01%三 氟 乙 酸）、40%乙 腈（0.01%三氟乙酸）+60%水（0.01%三氟乙酸）、30%乙腈（0.01%三氟乙酸）+70%水（0.01%三氟乙酸），经研究发现随着流动相中有机相比例的减少，（+）-氯前列烯醇的保留时间由2.93min增加至12.2min，目标峰逐渐远离色谱图前端的杂质峰群，当流动相比例为40%乙腈（0.01%三氟乙酸）+60%水（0.01%三氟乙酸）时，（+）-氯前列烯醇的保留时间为9.66min（如图1所示），此时（+）-氯前列烯醇与杂质峰的分离效果最佳。继续降低流动相中有机相比例，（+）-氯前列烯醇与杂质峰的分离效果未有明显改善，因此本研究采用40%乙腈（0.01%三氟乙酸）+60%水（0.01%三氟乙酸）作为流动相。图1废水中（+）-氯前列烯醇色谱图（+）-氯前列烯醇加标浓度为0.90g/L）3.2紫外检测波长的确定通过测试（+）-氯前列烯醇的全波长扫描光谱图（图2）（+）-氯前列烯醇溶液的浓度为10.0mg/L，溶剂为乙腈）可以得到（+）-氯前列烯醇的吸收波长范围在190nm290nm之间，由于乙腈溶剂的紫外吸收截止波长是 190nm，因此本研究选择 200nm、210nm、274nm作为（+）-氯前列烯醇的紫外检测波长，其中以 200nm 作为定量分析波长，210nm 和274nm作为定性分析波长。图2（+）-氯前列烯醇的全波长扫描光谱图3.3线性关系考察在上述色谱条件下测试校准曲线工作溶液，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，回归方程为y=0.1857x+32.1023，r=0.9987，表明在该浓度范围内（+）-氯前列烯醇的线性良好。3.4洗脱液的选择在样品前处理过程中，为了获得较好的固相萃取柱C18柱洗脱效果，分别用甲醇、乙腈、甲醇-乙腈混 合 溶 剂（V：V=1：1）进 行 洗 脱，淋 洗 体 积 为10.0mL，水样中（+）-氯前列烯醇加标量为0.500g/L，分别试验三次，其余的前处理过程同2.4，色谱条件如2.3所示，结果如表1所示。表1（+）-氯前列烯醇在不同洗脱液洗脱下的回收率淋洗液乙腈甲醇甲醇-乙腈混合溶剂（V：V=1：1）加标量/g/L0.5000.5000.500加标回收率（%）90.796.268.270.682.287.6由表1可见，相较于甲醇、甲醇-乙腈混合溶剂（V：V=1：1），乙腈的淋洗效果较好。3.5洗脱液用量的选择在确定乙腈为洗脱液后，为了研究洗脱液的用量对洗脱效果的影响，分别采用 1.00mL、5.00mL、陈群 等：固相萃取/高效液相色谱法测定牲畜饲养废水中（+）-氯前列烯醇352023，32（3）福建分析测试技术交流10.0mL乙腈进行洗脱试验，水样中（+）-氯前列烯醇加标量为0.500g/L，分别试验三次，其余的前处理过程同2.4，色谱条件如2.3所示，结果如表2所示。表2（+）-氯前列烯醇在不同体积乙腈洗脱下的回收率乙腈洗脱液体积/mL1.005.0010.0加标量/g/L0.5000.5000.500加标回收率（%）64.771.586.990.790.796.2研究结果表明，当乙腈洗脱液的体积为10.0mL时，（+）-氯前列烯醇的加标回收率最佳，能够稳定达到90%以上，满足分析要求。3.6精密度和准确度试验取养猪场废水样品分别制备低、中、高浓度加标样品各7份，废水样品本底测试值为未检出，样品前处理过程如2.4所示，色谱条件如2.3所示，测定并计算其相对标准偏差和准确度。样品低、中、高加标浓度分别为 0.100g/L、0.500g/L、0.900g/L，结果如表3所示。研究结果表明，加标样品测定结果的相对标准偏差（RSD）在7.21%8.59%之间，加标回收率在80.2%108%之间，具有较好的重复性和回收率。表3废水中（+）-氯前列烯醇的加标回收数据项目低浓度加标中浓度加标高浓度加标加标值/g/L0.1000.5000.900精密度/RSD，%7.427.218.59加标回收率/%87.810886.010680.21063.7方法检出限的测定取废水样品制备7个低浓度加标样品（加标浓度为0.100g/L），样品前处理过程如2.4所示，色谱条件如2.3所示，测定并计算测定结果的标准偏差（SD），进而根据取样体积和定容体积换算出方法检出限（MDL）。研究结果表明，当废水取样体积为1.0L，样品洗脱液定容体积为 0.50mL，进样量为30.0L时，该方法中（+）-氯前列烯醇的检出限为0.018g/L，检出下限为0.072g/L。4结论本研究通过对牲畜饲养废水中兽药（+）-氯前列烯醇的前处理过程和色谱分析条件进行了深入研究，最终建立了一种以固相萃取C18柱富集水样，乙腈溶剂洗脱，洗脱液经浓缩后用具有紫外-可见光检测器的高效液相色谱仪分离检测的检测方法。当 废 水 样 品 取 样 体 积 为 1.0L，洗 脱 液 浓 缩 至0.50mL，进样量为 30.0L 时，该方法的检出限为0.018g/L，检出下限为 0.072g/L。该方法前处理步骤操作简单，且具有较好的重复性和回收率，适合于实际应用推广。迄今为止，关于（+）-氯前列烯醇的环境检测标准方法研究尚未见相关报道，本方法的建立可以为（+）-氯前列烯醇在生态环境介质中的研究提供重要的技术支撑，加快（+）-氯前列烯醇在环境介质中检测的规范化、标准化进程。参考文献1 张巧玲.氯前列烯醇在家畜繁殖中的应用J.安徽农学通报，2010，16（14）：68+86.2 滕井胜.D-氯前列烯醇注射液的应用J.黑龙江畜牧兽医，2010（1）：104.3 肖永霞.氯前列醇钠及其制剂的质量控制和临床应用研究D.青岛：青岛农业大学，2010：2-9.4 范春平，戴志江，王延斌等.解析氯前列烯醇及其在猪繁殖方面的应用J.黑龙江动物繁殖，2014，22（04）：47-48.5 Peter R.Reeves.Distribution，Elimination，and ResidueStudies in the Prostaglandin Estrumate J.Agric.FoodChem.，1978，26（1）：152-155.6 张航俊，林仙军，陈慧华等.高效液相色谱法测定氯前列醇钠含量J.中国兽药杂质，2016，50（9）：58-60.7 Kvta Kalkov，Eva Tesaov，Zuzana Boskov.HPLCmethod for enantioselective analysis of cloprostenolJ.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2008，46：892-897.36