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细菌内毒素检查方法建立中应注意的几个问题
审评四部  王彦厚

摘要：本文对细菌内毒素检查方法的建立、限值的确定、方法学验证及常见问题进行了介绍。
关键词：细菌内毒素检查、方法、验证
细菌内毒素检查法作为控制药品质量的一种有效方法，已经广泛的被世界各国药典收载。经过30多年的不断改进，无论是凝胶法还是光度法均比较成熟和完善。但是，在为新化合物或新药建立细菌内毒素检查方法时，常常会遇到各种各样的困难，尤其是尚处于新药研发早期阶段的药物，由于药物制剂、赋形剂等还不稳定，经常会发生变化，这样就给方法的建立带来不同程度的影响。在建立细菌内毒素检查法之前，应尽可能多的收集有关该药品的基本信息，例如：有关样品的溶解性信息，推荐的稀释液，在水中的溶解度，以及最适溶剂；样品的pH范围；分子量大小；产品规格、体积或重量；拟用于临床的用法和用量等等。以便选择合适的样品处理方法和内毒素检查方法，对于早期研发阶段的药物，应选择合适的赋形剂，以有利于细菌内毒素检查中对样品的稀释处理。此外，在确定内毒素限值时还应尽可能采用最大人拟用剂量，为临床安全性和有效性研究中增加剂量留出空间。
一、细菌内毒素检查方法建立的主要步骤
对某一新化合物建立细菌内毒素检查方法时，首先应根据人体最大日给药剂量和给药途径，计算和确定样品的内毒素限值，选择合适的鲎试剂，根据临床规格，计算最大有效稀释倍数，稀释产品，并在低于最大稀释倍数的浓度下进行检查。可以采用凝胶法，也可以采用终点法或动态法。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法为准。
1、细菌内毒素限值的确定
一个药品在投放市场前，它是否满足内毒素限值的要求？样品的内毒素含量具体是多少？这些问题不但关注用药安全，还应该最大限度的提供有关内毒素含量的准确信息，为药品生产过程中质量控制提供警戒信息。尽管细菌内毒素检查方法的建立是一个科学方法的研究过程，但其最终目的还是要为控制药品质量服务。因此，在方法建立时，不但要阐明限值的合理性，考虑技术可能达到的限值，同时还要满足相关药品管理法规的要求。
研究人员在建立方法的早期，一般会按照临床建议的最大人用剂量确定一个非正式的限值，这个限值可以根据实验室可以达到的最低检测水平，把限值订的相对比较严格，但往往由于早期的临床剂量会比最终上市的临床剂量高几倍，所以严格的限值，可能会使得正式生产时很多产品不能通过检查，从而造成不必要的浪费；因此参按照法规允许的最高水平，酌情确定样品的限值。
样品内毒素限值的确定一般与临床人体最大给药剂量有关，剂量越大，单位重量或体积的内毒素限值越低。一般按以下公式计算：内毒素限值L=K/M。式中内毒素限值L是以EU/ml、EU/mg或EU/u表示；K为按规定的给药途径，人体每公斤体重每小时最大可耐受的内毒素剂量，以EU/（kg.h）表示，注射剂K=5EU/（kg.h），其中放射性药品注射剂K=2.5EU/（kg.h），鞘内用注射剂K=0.2EU/（kg.h）。一般我国人群平均体重按60kg计算，人体对细菌内毒素的最大耐受量为300EU/h；另我国人体的平均体表面积按1.55m2计算，人体每平方米的最大耐受剂量为(300EU/h)/ 1.55m2 =（193EU/h）/ m2 。 M为人体每公斤体重每小时接受的最大给药剂量，以ml/（kg.h）、mg/（kg.h）或u/（kg.h）表示。
内毒素限值计算举例（一）：A注射剂的人体最大用量为每小时1.5g，每公斤每小时体重的剂量为1.5g/60kg=0.025g/kg=25mg/kg，内毒素限值L=K/M=(5EU/kg)/( 25mg/kg ) = 0.2EU/mg。在细菌内毒素检查法中，细菌内毒素标准品和鲎试剂常常以EU/ml表示，所以在具体实验中样品的内毒素的限量可以转换为EU/ml的表示方法，可使实验操作计算更为方便。假定产品A的浓度为100mg/ml（或原料药经溶解后的浓度为100mg/ml）,  那么，将产品A的限值从EU/mg转变为EU/ml时，内毒素限值L= 0.2 EU/mg  100 mg/ml = 20 EU/ml。
内毒素限值计算举例（二）：B注射剂的临床最大用药剂量为1g/m2，规格为50mg/ml，内毒素限值L=（193 EU/ m2）/（1g/m2）=193 EU/g=0.193 EU/mg，转换为EU/ml 表示时，L = 0.193 EU/mg50 mg/ml=9.65EU/ml。
大输液品种的限值一般定为0.5EU/ml，灭菌注射用水则定为0.25EU/ml。内毒素限值没有考虑到几个药物联合用药问题，但一般情况下，药品中内毒素的含量远低于限值，并且药品生产厂家的内控标准严于注册标准，所以药典内毒素限值也被称为最大允许内毒素浓度（Maximum allowable endotoxin concentration）。
2、样品最大有效稀释倍数或最小有效浓度的计算
最大有效稀释倍数(MVD)是指在所选择的鲎试剂灵敏度条件下，对产品进行最大倍数的稀释，仍能够进行内毒素限值的检测，此时所允许稀释的最大倍数。 MVD的计算公式为：当被规定的内毒素的限值以体积表示时， MVD=内毒素限值L（EU/ml ）/鲎试剂灵敏度（λ）；当内毒素的限值以重量或药品的生物活性(EU/mg或EU/u)表示时， MVD=内毒素限值L（EU/mg 或 EU/u）×供试品溶液的浓度C/ 鲎试剂灵敏度(λ)。在凝胶法中， λ=鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml），在浊度法或显色法中, λ=所使用标准曲线上最低点的内毒素浓度（EU/ml）。
最小有效浓度（MVC）是指在所选择的鲎试剂灵敏度条件下，将产品稀释到一定浓度，仍能够进行内毒素限值的检测，此时所允许的最小浓度。计算MVC的一般公式为：MVC=鲎试剂灵敏度（λ）/内毒素限值（L）。对所选定的鲎试剂灵敏度来讲，MVC是一个绝对值；而MVD对特定的产品浓度是特异的，浓度变化时，MVD也会随之发生变化。
3、方法学验证试验的预试验
确定了样品的内毒素限值，考察了样品的溶解性，并且选定了一定灵敏度的鲎试剂，此时便可以考虑进行预试验。尽管法规中并不要求进行预试验，但在细菌内毒素检查法的建立过程中，一般需要进行预试验。预试验的主要目的是确定不出现干扰的第一个样品稀释度，也就是不干扰浓度（non-interfering concentration, NIC），为后续的验证试验选择适当的样品稀释度（或浓度）。
不管采用凝胶法还是光度法，预试验都是对一系列样品的稀释液进行试验，在每一个稀释浓度，都有一组添加内毒素的样品和一组不添加内毒素的样品，添加内毒素的浓度保持不变，而样品浓度会逐级稀释，但最终样品的稀释倍数不得超过MVD。可以采用直接把内毒素添加到样品溶液中，添加内毒素的体积宜小，以免导致样品溶液被稀释，一般添加体积等于或小于样品体积的10%为宜；也可以采用下述方法添加内毒素，就是将两倍于终浓度的内毒素溶液与两倍于终浓度的样品溶液等体积混合，内毒素和样品溶液间相互稀释，得到两者所需终浓度的混合液。添加内毒素的浓度，凝胶法为2λ；终点显色法为4λ（这里的λ表示标准曲线上的最低点，也就是方法的检测限）。动态显色法则有3种选择添加内毒素浓度的方法，可以选择标准曲线的中点浓度，也可以与终点比色法一样，选择4λ。此外，当样品稀释液中，内毒素的限值小于或等于1.0EU/ml时，添加内毒素的浓度可定为0.1-0.5EU/ml之间，当样品稀释液中，内毒素的限值大于或等于1.0EU/ml时，添加内毒素的浓度可定为1.0-5.0EU/ml之间。
对于凝胶法的结果判断，不添加内毒素的样品不应该凝集，如果发生凝集说明含有内毒素或内毒素样物质；添加有内毒素的样品应该出现凝集，若没有发生凝集表明样品凝集反应被抑制。光度法的结果判断标准为，测得的添加内毒素的量应该在已知添加量的±50%范围内，超出范围（多或少）表明存在增强或抑制作用。
通过预试验结果可以确定验证试验中样品的稀释度或浓度，其选择的基本原则包括：经稀释后的样品含内毒素的量应尽可能少，比其内毒素限值至少少4倍，最好检测不到内毒素。要求验证试验选择的稀释度至少要比NIC大1-2倍，但不可超过MVD。若样品需要多支合并进行验证试验，此时试验不可采用原来的MVD，因为假定合并样品中有一瓶存在污染，其它瓶没有污染，污染瓶含有的内毒素就会被其它没有污染瓶样品所稀释，并低于MVD，从而检测不到污染的样品。因此，采用合并样品进行试验时，MVD应降低，这种情况下的MVD等于原来的MVD除以合并样品的数量。
例如：假定鲎试剂的标示灵敏度λ为0.125EU/ml，样品的MVD为100（倍）。

预试验结果表明样品在1：8倍稀释时，具有抑制作用，不干扰浓度（NIC）为1:16，可选择用于验证试验的稀释度或浓度为最低不小于1:32，可以选择1:64。
4、方法学验证试验（增强/抑制试验）
验证试验在细菌内毒素方法学的建立过程中具有十分重要的作用，主要目的是确证检测内毒素的方法是否受样品的干扰。验证试验的特点是样品浓度保持不变，添加内毒素的浓度逐渐降低。在建立细菌内毒素检查方法中，验证试验前，要去除样品可能含有的内毒素，以确保建立方法的准确可靠。凝胶法的验证试验是通过在细菌内毒素检查用水和样品溶液中平行进行鲎试剂标示灵敏度的复核试验完成，试验中要求样品平行4管，设立样品阴性对照管，也同样平行4管。尽管要求添加内毒素标准平行管数量各国不完全一致，可以2管，也可以4管，但鉴于目前国内的具体情况，在2005年版药典附录的细菌内毒素检查法中规定是平行4管。细菌内毒素检查用水和样品溶液中的反应终点浓度的对数平均值（内毒素含量）必须在鲎试剂标示灵敏度的2倍范围以内，在样品溶液和细菌内毒素检查用水中的反应终点浓度的对数平均值也应相互在2倍范围之内（2λ~0.5λ）。光度法的验证试验中，要求阴性对照所含有的内毒素必须明显低于标准内毒素曲线中的最小浓度，阳性对照的内毒素回收率，在扣除样品可能含有的内源性内毒素后，必须在已知添加内毒素量的50%～200%之间，添加和未添加内毒素的样品管数量至少要平行2管。
二、细菌内毒素检查方法建立时注意事项及常见问题
1、在方法建立的过程中，对方法的验证非常重要
一个全面可靠的细菌内毒素检查法的方法学验证试验一般应注意：首先要了解产品的溶解度，按照适当的临床用量确定合适的内毒素限值，并确证产品对方法是否存在干扰，如果在样品处理过程中运用了激烈的处理条件或溶剂，还应证明所采用方法不会破坏或减少样品中细菌内毒素含量。其次应考察样品批与批之间的差异是否会引起方法学变异。此外，还应注意实验中涉及到的试验器材对方法学的影响，如：器皿的控制、鲎试剂标示灵敏度（或光度法检测用鲎试剂的检测限）等。最后，要确保仪器的运行状态和对实验过程的准确记录。总之，只有验证了整个实验的每一个环节，才能保证方法学的可靠和成功。方法学验证终究是为药品生产质量服务的，验证本身也是一个动态的过程，是随着生产工艺、环境和检验条件改变而变化的。方法学验证实验记录，要抓住要点，将试验关键步骤记录详细，避免验证资料照抄药典附录，罗列一大堆规定，最终没有明确的方法及可操作性。
2、内毒素限值的确定十分关键
在细菌内毒素检查方法的建立中，计算内毒素限值L、MVD和MVC时，需要注意最大人用剂量、产品规格、鲎试剂的灵敏度等重要的参数，因为计算错误会导致后续的所有努力均告失败。常见的问题有：（1）临床用药剂量确定不正确，仅用常规用药剂量，未考虑临床可能的人体最大用药剂量和给药途径，在限值计算公式L=K/M中，由于对K值及M值的定义模糊，使K值及M值赋值不准确，最终导致限值计算错误。例如，某注射剂临床成人每次静脉滴注给药40～80mg，婴儿（三个月以上）静脉滴注给药每次10～20mg。按成人（体重60kg）剂量计算限值为3.75EU/mg，而婴儿体重仅为5kg左右，计算限值约为1.25EU/mg，如果不考虑临床每公斤体重最大用药剂量，细菌内毒素限值就会出现较大的差别。（2）有的申报品种细菌内毒素限值不是根据临床用量计算出来，而是根据同品种热原检查的剂量推算出来的，造成限值错误。（3）有的品种细菌内毒素限值从国外药典抄来，没有考虑该品种国内上市的临床使用剂量及中国人与国外人均体重等的差异，也造成限值确定不正确。（4）错误的计算日给药剂量（一日内多次给药）。（5）在品种规格（浓度）发生变化时，计算MVD没有进行调整。（6）建立方法时所用的最大给药剂量已经超出了临床所用剂量等。
3、在进行干扰试验预试验时不干扰浓度的确定方法不正确
对预试验的目的不理解，直接选用一个灵敏度的鲎试剂对应的MVD或MVC进行试验，如无干扰则以该浓度为不干扰浓度，有的甚至直接选用高灵敏度的鲎试剂对应的浓度作为不干扰浓度，未找到真正的不干扰浓度，使干扰试验失去意义。也有的申报单位仅选择1～2个样品浓度进行试验，同样使试验缺乏完整性。
4、供试品阳性溶液配制浓度（方法）不对
在使用简便方法配制供试品阳性溶液时，应将供试品溶液与细菌内毒素标准品溶液等量混合、稀释。如：配制含4倍稀释供试品溶液的细菌内毒素标准品溶液，应使用2倍稀释供试品溶液和4λ细菌内毒素标准品溶液等量混合、稀释。常见有的配制过程中直接使用4倍稀释供试品溶液或2λ细菌内毒素标准品溶液浓度等量混合，造成配制的供试品阳性溶液中细菌内毒素标准品或供试品浓度低一倍。
5、仅使用一个厂家的鲎试剂或一个批号的样品进行干扰试验，没有足够的代表性
2005年版药典明确规定细菌内毒素检查进行干扰试验时，应同时使用两个以上厂家生产的鲎试剂对至少三个批号的样品进行试验，但有的申报单位仅用一个厂家的鲎试剂或仅对一个批号的样品进行试验。因为大部分注册药品其生产工艺、所使用的敷料等均不是很稳定，不同厂家生产的鲎试剂其抗干扰能力也不尽相同，因此仅用一个厂家的鲎试剂或仅对一个批号的样品进行干扰试验，没有足够的代表性，确定的不干扰浓度可能在后续的试验中不准确。
6、错误认为一定要按最大有效稀释倍数（MVD）或最小有效浓度（MVC）进行试验
实际上，有的样品浓度很高也不干扰鲎试剂与内毒素的凝集反应，这种情况下，只要样品内毒素含量合格，可以在MVD范围之内，即小于MVD的倍数下进行试验。又如对样品进行检查时，也可以先用原液（预试验时原液无干扰）进行试验，如果内毒素检查也能合格，则不必进行稀释，这样做的直接好处是可以节约成本和时间，减少污染环节。如果一个样品在小于MVD的情况下试验时样品阳性管有干扰，或样品管为阳性，则可按MVD进行相对应的稀释后重新试验。如：某注射液，说明书中临床静脉给药最大剂量为7mg/h，制剂规格为10mg/ml，计算内毒素限值为420EU/ml，所采用鲎试剂灵敏度为0.25EU/ml，计算MVD＝1680倍。显然内毒素限值确定不正确（人体对细菌内毒素的最大耐受量为300EU/h ），已超过了人体对细菌内毒素的最大耐受量；另外选择最大有效稀释倍数的稀释液进行试验，每次实验时要对样品进行1680倍的稀释，会使实验变得繁琐，不利于操作。
7、应严格执行中国药典2005年版细菌内毒素检查的有关规定
药典规定：（1）当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项品种建立内毒素检查法时，需进行干扰试验；（2）当鲎试剂、供试品的配方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，需重新进行干扰试验。这就要求在提供的申报资料中应提供相关的方法学验证资料，以证明方法的可行性及有无干扰的存在。只有严格按照有关要求进行了干扰试验，并证明该条件下无干扰，才能建立新的检查方法。有些错误的认为国内或国外已有生产的品种，方法学验证就可以不做，以至有些新药、仿制药未进行系统的干扰试验。