第二章-色谱法导论.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,第一节 概述,1,、色谱法的概念,概念,色谱法又称色层法、层析法，是用于多组分有机混合物的一种高效分离技术。,特点,选择性好、分离效能高、灵敏度高、分析速度快等优点。,先进性,已逐步实现仪器化、自动化、高速化，并从分离手段发展到分析手段，应用范围不断扩大，分离的对象早已不限于有色物质，但“色谱法”这一名称一直被沿用。,范围,色谱法与现代新检测技术和计算机技术相结合，已广泛食品质量与安全等的有关工作，如样品中农药残留量的测定、农副产品分析、食品质量检验、生物制品的分离制备等。,2,、色谱法的起源,1906,年，俄国植物学家茨维特首创了这种分离技术，他把植物叶绿体色素的石油醚浸渍液倒入一根装有碳酸钙吸附剂的细直玻璃柱中，再加入纯石油醚，任其自由流下，原混合物开始被分离成不同颜色的谱带,(,色素的分离,),，且以不同速度通过子，然后按谱带颜色对混合物进行鉴定分析。茨维特把这种分离结果称为色谱图，把这种分离方法命名为色谱法（,chromatography,）。,此后，出现了种类繁多的各种色谱法。,3,、色谱法的本质,色谱法共同的基本特点是具备两个相：,不动的一相，称为固定相；另一相是携带样品流过固定相的流动体，称为流动相,。,当流动相中样品混合物经过固定相时，就会与固定相发生作用，由于各组分,在性质和结构上的差异,，与固定相,相互作用的类型、强弱也有差异,，因此在同一推动力的作用下，不同组分在固定相,滞留时间,长短不同，从而按先后不同的次序从固定相中流出。,色谱法是基于混合物各组分在两相,(,固定相和流动相,),之间的不均匀分配进行分离的一种方法。,目前色谱法已广泛应用于许多领域，成为十分重要的分离分析手段。许多气体、液体和固体样品都能找到合适的色谱法进行分离和分析。,Temporal,course,色谱分离,淋洗液,慢,中等,快,4,、色谱法的分类,（,1,）按两相状态分类,气体为流动相的色谱称为,气相色谱,（,GC,），,气固色谱（,GS C,）固定相是固体吸附剂；,气液色谱（,GLC,）固定相是固定液（附着在惰性载体上的一薄层有机化合物液体）。,液体为流动相的色谱称,液相色谱,（,LC,），,液固色谱,（,LSC,）；,液液色谱（,LLC,）。,超临界流体,为流动相的色谱称为超临界流体色谱（,SFC,）。,随着色谱工作的发展，通过化学反应将固定液键合到载体表面，这种化学键合固定相的色谱又称,化学键合相色谱,（,CBPC,）。,（,2,）按分离机理分类,吸附色谱法：,利用组分在吸附剂（固定相）上的吸附能力强弱不同而得以分离的方法。,分配色谱法：,利用组分在固定液（固定相）中溶解度不同而达到分离的方法。,离子交换色谱法：,利用组分在离子交换剂（固定相）上的亲和力大小不同而达到分离的方法。,凝胶色谱法或尺寸排阻色谱法：,利用大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗透而达到分离的方法。,亲和色谱法：,最近，又有一种新分离技术，利用不同组分与固定相（固定化分子）的高专属性亲和力进行分离的技术，常用于蛋白质的分离。,a.,吸附色谱法,原理,:,被分离物与吸附剂表面分子相互作用而被吸附，由于不同化合物结构及性质上的差异，在吸附剂上的吸附性能是不同的，在色谱分离过程中，用一定的溶剂系统洗脱柱子时，由于溶剂,(,洗脱剂,),与混合物里各组分争夺吸附剂的活性表面，解吸出来的组分与溶剂始终存在着对吸附剂的竞争吸附，洗脱剂对不同的物质的洗脱能力也是不同的。,特点,:,因此吸附与解吸始终贯穿整个色谱过程，吸附与解吸是吸附色谱法的理论基础。吸附过程无选择性，吸附与解吸附过程可逆，但吸附强弱和先后顺序都基本遵循“相似相吸附”的经验规律。,吸附力最弱的组分随溶剂首先流出。,常用极性吸附剂,:,硅胶、氧化铝、聚酰胺。,b.,分配色谱,原理,:,将两相溶剂中的一相涂覆在硅胶等载体上作为固定相，再用与固定相不相混溶的另一相溶剂作为流动相，物质可在两相溶剂相对做逆流移动过程中不断进行动态分配而得以分离。,分类,:,正相色谱：固定相采用强极性溶剂，如水、缓冲溶液等，流动相则用氯仿等弱极性溶剂，称之为正相,(normal phase),色谱；,反相色谱：以弱极性成分如石蜡油为固定相，流动相则以水、乙腈、甲醇强极性溶剂，则两相可以颠倒，称之为反相,(reverse phase),色谱，更适合于水溶性成分的分离。,液,液分配色谱的分离条件可以基于相应的正相及反相分配薄层层析结果加以选定。,c.,离子交换色谱,原理,:,以离子交换树脂或表面涂有液体离子交换树脂的固体颗粒为固定相，装在柱中，以水或含水溶剂为流动相，使样品溶液流过交换柱，溶液中的中性分子及具有与离子交换树脂可交换基团相反电荷的离子通过柱子从柱底流出，而具有相同电荷的离子则与树脂上的交换基团进行离子交换并被吸附到柱上。,规律：,由于不同离子与同一树脂交换能力不同，移动速度也不同，在柱上形成色谱带，另选一适当的洗脱剂,(,含有比吸附物质更活泼的离子,),进行洗脱交换，可将吸附物质按先后顺序从柱上洗脱下来，即可实现不同组分物质的分离。,范围：,主要用于分离氨基酸，生物碱，糖类化合物。,d.,凝胶色谱法,原理,:,也叫分子筛过滤，利用分子筛分离物质的一种方法。所用载体，如葡聚糖凝胶，是不溶于水，但可在水中膨胀的球形颗粒，具有三维空间的网状结构。当在水中充分膨胀后装入层析柱中。,加入样品，用同一溶剂洗脱时，由于凝胶网孔半径的限制，大分子将不能渗入凝胶颗粒内部,(,即被排阻在凝胶颗粒外部,),，所以在颗粒间隙移动，并随溶剂一起从柱底先流出，小分子因可自由渗入并扩散到凝胶颗粒内部，故通过层析柱时阻力增大、流速变缓，较晚流出。,分类,:,(1),葡聚糖凝胶,(2),羟丙基葡聚糖凝胶,(SephadexLH-20),。,过程,:,样品混合物中各个成分因分子大小各异，渗入至凝胶颗粒内部的程度也不尽相同，故在经历一段时间流动并达到动态平衡，即按分子由大到小次序先后流出并得到分离。,e.,亲和色谱,(3),按固定相的外形分类,固定相装于柱内的色谱法，称为,柱色谱,。,固定相呈平板状的色谱法，称为,平板色谱,，它又可分为,薄层色谱,和,纸色谱,。,根据以上所述，将色谱法的分类总结于下表中。,第二节 色谱流出曲线及有关术语,1,、色谱流出曲线和色谱峰,样品各组分在色谱柱中得到分离后随流动相依次流出色谱柱，先后到达检测器。经检测器把各组分的浓度信号转变成电信号，然后用记录仪或工作站软件将组分的信号记录下来，这种组分响应信号大小随时间变化所记录下来的曲线称为色谱流出曲线，也叫做色谱图。,色谱图中曲线突起的部分称为色谱峰，由于响应信号的大小或强度与物质的量或物质的浓度成正比，色谱流出曲线实际上是物质的量或浓度,时间曲线。,如果进样量很小，浓度很低，在吸附等温线的线性范围内，色谱峰如果对称，可用,Gauss,正态分布函数表示：,式中：,C,不同时间,t,时某物质在柱出口处的浓度，,C,0,进样浓度，,t,r,保留时间，,标准偏差。,2,、基线,在实验操作条件下，柱中仅有流动相通过时，检测器响应讯号的记录值，即图中,O-t,线。它应该是一条直线，若是斜线就称为基线漂移，如果基线出现上下波动则称为噪声。保持基线平稳，是进行色谱分析的最基本要求。,3,、峰高,色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以,h,表示，如图中,BA,。是色谱定量分析的依据之一。,4,、保留值,(retention value),（,1,）死时间,t,m,不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间，它正比于色谱柱的空隙体积，,如图中,OA,。因为这种物质不被固定相吸附或溶解，故其流动速度将与流动相的流动速度相近测定流动相平均线速,时，可用往长,L,与,t,m,的比值计算。,（,2,）保留时间,t,R,试样从进样开始到柱后出现峰极大点时所经历的时间，称为保留时间，如图中的,OB,它相应于样品到达柱末端的检测器所需的时间,（,3,）调整保留时间,t,R,某组份的保留时间扣除死时间后称为该组份的,调整保留时间,，即,t,R,=t,R,-t,m,由于组份在色谱柱中的保留时间,t,R,包含了组份随流动相通过柱子所需的时间和组份在固定相中滞留所需的时间，所以,t,R,实际上是组份在固定相中停留的总时间。,保留时间是色谱法定性的基本依据，但同一组份的保留时间常受到流动相流速的影响，因此色谱工作者有时用保留体积等参数进行定性检定,（,4,）死体积,V,m,指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和当后两项很小而可忽略不计时，死体积可由死时间与流动相体积流速,F,0,（,mL,min,）计算：,V,m,=t,m,F,0,(5),保留体积,V,R,指从进样开始到被测组分在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积。保留时间与保留体积的关系,：,V,R,=t,R,F,0,（,6,）调整保留体积,V,R,某组分的保留体积扣除死体积后，为该组分的调整保留体积,V,R,=V,R,-Vm,(7),相对保留值,r,2.1,某组份,2,的调整保留值与组份,1,的调整保留值之比，称为相对保留值：,由于相对保留值只与柱温及固定相的性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因此，它是色谱法中，特别是气相色谱法中，广泛使用的定性数据。,必须注意，相对保留值绝对不是两个组份保留时间或保留体积之比。,5,、选择因子,在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标准（,s,），然后再求其它峰（,i,）对这个峰的相对保留值。此时，,r,i/s,可能大于,1,，也可能小于,1,。在多元混合物分析中，通常选择一对最难分离的物质对，将它们的相对保留值作为重要参数。在这种特殊情况下，可用符号,表示：,式中，,t,r,(i),为后出峰的调整保留时间，所以这时,总是大于,1,的。相对保留值往往可作为衡量固定相选择性的指标，又称选择因子。,6,、区域宽度,色谱峰的区域宽度是组份在色谱柱中谱带扩张的函数，它反映了色谱操作条件的动力学因素。度量色谱峰区域宽度通常有三种方法：,a.,标准偏差,即,0.607,倍峰高处色谱峰宽的一半，如图中,EF,距离的一半。,b.,半峰宽,W,1/2,即峰高一半处对应的峰宽，如图中,GH,间的距离它与标准偏差,的关系是：,W,1/2,=2.354,c.,峰底宽度,W,即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上的截距，如图中,IJ,的距离。它与标准偏差,的关系是：,W=4,在相同的色谱操作条件下获得色谱峰的区域宽度值越小，说明色谱柱的分离效能越好，柱效越高,。,7.峰面积,由色谱峰与基线之间所围成的面积称为峰面积，用“A”表示，是色谱定量分析的基本依据，对理想的对称峰，峰面积与峰高，半峰宽的关系为 A=1.065,h,W,1/2,。,一组分的色谱流出曲线对色谱分析十分重要，从色谱图上可以获得以下信息：,（,l,）根据色谱峰的个数，可以判断样品中所合组 份的最少个数。,（,2,）根据色谱峰的保留值,(,或位置），可以进行定性分析。,(3),根据色谱峰下的面积或峰高，可以进行定量分析。,（,4,）色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据。,（,5,）色谱峰两峰间的距离，是评价固定相,(,和流动相,),选择是否合适的依据。,第三节 色谱法基本原理,色谱分析的目的是将样品中各组分彼此分离。,组分要达到完全分离，两峰间的距离必须足够远，,两峰间的距离是由组分在两相间的分配系数决定的，即与色谱过程的热力学性质有关。,两组分分配系数相差越大，两色谱峰间的距离就越大。,但是两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以致彼此重叠，还是不能分开。,这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱过程的动力学性质有关。,因此，要从热力学和动力学两方面来研究色谱行为。,色谱分析的基本理论有两个：一个是以热力学平衡为基础的塔板理论；另一个是以动力学为基础的速率理论，两个理论相辅相成，较为满意地揭示了色谱分析中的有关问题和现象,。,1,、分配系数,K,和分配比,k,（,1,）分配系数,K,分配色谱的分离是基于样品组分在固定相和流动相之间反复多次地分配过程，而吸附色谱的分离是基于反复多次地吸附一脱附过程。这种分离过程经常用样品分子在两相间的分配来描述，而描述这种分配的参数称为分配系数,K,。它是指在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值，即,分配系数是由组分和两相的热力学性质决定的。,例：逆流分配色谱,取一系列试管，向,1,号管加入互不相溶的两种溶剂，,A,溶剂为上相（动相），,B,溶剂为下相（静相），体积相等。,加入物质,Y,（,K=1,）和物质,Z,（,K=1/3,）的混合物，各组分物质将按自己的分配系数在上下相中进行分配。,平衡后，将上相转移到,2,号管内，其中含有相同体积的新下相，从,1,号转移来的样品将在,2,号管的上下相中再分配。,与此同时，向,1,号管内加入新的上相，这里也将发生样品的再分配。,分配系数小的物质,Z,沿一系列分溶管的,“,移动,”,速度比分配系数大的物质,Y,快。那么它流出色谱柱。,每一种物质在一系列分溶管中是相当集中的，分溶曲线呈峰形，只要使用足够数目的分溶管，继续进行分配，就可以使两峰彼此分来。,一定量的某一溶质在一定量的溶剂系统中分配时，转移次数越多，即分溶管数越多，其分溶曲线越集中，即峰形窄而高，有利于各物质的完全分离。,（,2,）分配比,k,分配比又称容量因子，它是指在一定温度和压力下，组分在两相间分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的质量比。即,k,值越大，说明组分在固定相中的量越多，相当于柱的容量大，因此又称,分配容量,或,容量因子,。它是衡量色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数。,k,值也决定于组分及固定相热力学性质。它不仅随柱温、柱压变化而变化，而且还与流动相及固定相的体积有关。,滞留因子,Rs,分配比,k,值可直接从色谱图测得。设流动相在柱内的线速度为,u,，组分在柱内线速度为,u,s,，由于固定相对组分有保留作用，所以,u,s,u,此两速度之比称为滞留因子,Rs,。,它反映了组分在流动相中的分配比例数。例如，某组分完全不被固定相滞留，即该组分,100,分配在流动相中。,(3),分配系数,K,与分配比,k,的关系,其中,称为,相比率,，它是反映各种色谱柱型特点的又一个参数。例如，对填充柱，其,值一般为,6,35,；对毛细管柱，其,值为,60,600,。,C,s,，,C,m,分别为组分在固定相和流动相中的浓度；,V,m,为柱中流动相的体积，近似等于死体积；,V,s,为柱中固定相的体积。,(4),分配系数,K,及分配比,k,与选择因子,的关系,对,A,、,B,两组分的选择因子，用下式表示：,上式表明：,通过选择因子,把实验测量值,k,与热力学性质的分配系数,K,直接联系起来，,对固定相的选择具有实际意义。如果两组分的,K,或,k,值相等，则,=1,，两个组分的色谱峰必将重合，说明分不开。,两组分的,K,或,k,值相差越大，则分离得越好。因此两组分具有不同的分配系数是色谱分离的先决条件,。,2,、踏板理论,最早由,Martin,等人提出塔板理论，把色谱柱比作一个精馏塔，,柱内由许多想像的塔板组成,沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为，同时引入理论塔板数作为衡量柱效率的指标。,该理论假定：,（,i,）在柱内一小段长度,H,内，组分可以在两相间迅速达到平衡。这一小段柱长称为理论塔板高度,H,。,（,ii,）以气相色谱为例，载气进入色谱柱不是连续进行的，而是脉动式，每次进气为一个塔板体积（,V,m,）。,（,iii,）所有组分开始时存在于第,0,号塔板上，而且试样沿轴（纵）向扩散可忽略。,（,iv,）分配系数在所有塔板上是常数，与组分在某一塔板上的量无关。,为简单起见，设色谱往由,5,块塔板（,n=5,，,n,为柱子的塔板数）组成，并以,r,表示塔板编号，,r=1,，,2,，,n-l,；某组分的分配比,k=1,。,根据上述假定，在色谱分离过程中，该组分的分布可计算如下：,开始时，若有单位质量，即,m=1,（例,1mg,或,1g,）的该组分加到第,0,号塔板上，分配平衡后，由于,k=1,，即,m,s,=m,m,故,m,m,=m,s,=0.5,。当一个板体积（,lV,）的载气以脉动形式进入,0,号板时，就将气相中含有,m,m,部分组分的载气顶到,1,号板上，此时,0,号板液相（或固相）中,m,s,部分组分及,1,号板气相中的,n,m,部分组分，将各自在两相间重新分配。故,0,号板上所含组分总量为,0.5,，其中气液（或气固）两相各为,0.25,，而,1,号板上所含总量同样为,0.5,，气液（或气固）相亦各为,0.25,。,塔板号,r,0,1,2,3,进样,m,m,0.5,m,s,0.5,进气,1,V,m,m,0.25,0.25,m,s,0.25,0.25,进气,2,V,m,m,0.125,0.25,0.125,m,s,0.125,0.25,0.125,进气,3,V,m,m,0.063,0.188,0.188,0.063,m,s,0.063,0.188,0.188,0.063,按上述分配过程，对于,n=5,，,k=1,，,m=1,的体系，随着脉动进入柱中板体积载气的增加，组分分布在柱内任一板上的总量（气液两相中的总质量）见表：,经,N,次转移后，在各塔板上组分含量的分布符合（,m,s,+m,m,）,N,的二项式展开式。如,N=4,、,k=1,时，展开式为：,m,s,4,+4m,s,3,m,m,+6m,s,2,m,m,2,+4m,s,m,m,3,+m,m,4,对于各塔板上组分分布计算得到：,0.063,，,0.25,，,0.375,，,0.25,，,0.063,，由二项式展开的值与上表相一致。,如果色谱柱的塔板数,n,大于,50,，组分在柱内就可得,到较多次的平衡分配，如果以组分流出色谱柱的浓度或,量为纵坐标对相应的流出时间，作图，所得到的色谱流,出曲线趋于正态分布。此时，进入色谱柱的流动相塔板,体积数,N,已足够大，二项式分布完全可以用正态分布来,表示。,由塔板理论的流出曲线方程可导出理论塔板数,n,与色谱峰底宽度的关系。根据流出曲线的正态分布方程，可有另一表达式：,m,为组分质量，,V,r,为保留体积，,n,为理论塔板数。,当,V=V,r,时，,C,值最大，即,由流出曲线方程可推出,n,与保留时间,t,r,、半峰宽,W,1/2,、峰底宽,W,的关系：,从而求得理论塔板高度,H,，即：,L,为色谱柱的长度,从上两式可以看出，色谱峰,W,越窄，塔板数,n,就越多，而理论塔板高度,H,就越小，柱效能越高。因此，,n,和,H,是描述柱效能的指标。,通常填充色谱柱的,n,10,3,，,H,1mm,。而毛细管柱,n=10,5,-10,6,，,H,0.5mm,。,由于死时,t,m,包括在,t,r,中,而实际的,t,m,不参与柱内分配,所计算的,n,值尽管很大，,H,很小,但与实际柱效能相差甚远。所以，提出把,t,m,扣除，采用,有效理论塔板数,n,eff,和,有效塔板高,H,eff,评价柱效能。,塔板理论用热力学观点形象地描述了溶质在色谱柱中的分配平衡和分离过程，导出流出曲线的数学模型，并成功地解释了流出曲线的形状及浓度极大值的位置，还提出了计算和评价柱效的参数。,但由于它的某些基本假设并不完全符合柱内实际发生的分离过程，例如，纵向扩散是不能忽略的。,它也没有考虑各种动力学因素对色谱柱内传质过程的影响，因此它不能解释造成谱带扩张的原因和影响板高的各种因素，也不能说明为什么在不同流速下可以测得不同的理论塔板数，这就限制了它的应用。,3,、速率理论,1956,年荷兰学者,van Deemter,等在研究气液色谱时，,提出了色谱过程动力学理论,速率理论。,他们吸收了塔板理论中板高的概念，并充分考虑了组分在两相间的扩散和传质过程，从而在动力学基础上较好地解释了影响板高的各种因素。该理论模型对气相、液相色谱都适用。,van Deemter,方程的数学简化式为：,式中,u,为流动相的线速度；,A,，,B,，,C,为常数，分别代表涡流扩散项系数、分子扩散项系数、传质阻力项系数。,(1),涡流扩散项,在填充色谱柱中，当组分随流动相向柱出口迁移时，流动相由于受到固定相颗粒障碍，不断改变流动方向，使组分分子在前进中形成紊乱的类似“涡流”的流动，故称涡流扩散，形象地如图所示,。,由于填充物颗粒大小的不同及填充物的不均匀性，使组分在色谱柱中路径长短不一，因而同时进色谱柱的相同组分到达柱出口的时间并不一致，引起色谱峰的变宽。色谱峰变宽的程度由下式决定：,A,2d,p,上式表明，,A,与填充物的,平均直径,d,p,的大小和,填充不规则因子,有关，与流动相的性质、线速变和组分性质无关。为了减少涡流扩散，提高柱效，使用细而均匀的颗粒，并且填充均匀是十分必要的。对于空心毛细管，不存在涡流扩散，因此,A,0,。,（,2,）分子扩散项,B/u,（纵向扩散项）,纵向分子扩散是由浓度梯度造成的。组分从柱人口加入，其浓度分布的构型呈“塞子”状。如图所示。它随着流动相向前推进，由于存在浓度梯度，“塞子”必然自发地向前和向后扩散，造成谱带展宽。,分子扩散项系数为,B,2D,g,式中,是填充柱内流动相扩散路径弯曲的因素，也称弯曲因子，它反映了固定相颗粒的几何形状对自由分子扩散的阻碍情况。,D,g,为组分在流动相中扩散系数（,cm,2,s,-1,）。,另外，纵向扩散与组分在色谱柱内停留时间有关，流动相流速小，组分停留时间长，纵向扩散就大。因此，为降低纵向扩散影响，要加大流动相流速。对于液相色谱，组分在流动相中的纵向扩散可以忽略。,（,3,）传质阻力项,Cu,由于气相色谱以气体为流动相，液相色谱以液体为流动相，它们的传质过程不完全相同，现分别讨论。,a.,气相色谱,对于气液色谱，传质阻力系数,C,包括气相传质阻力系数,C,g,和液相传质阻力系数,C,l,两项，即,C,C,g,C,l,气相传质过程是指试样组分从气相移动到固定相表面的过程。这一过程中试样组分将在两相间进行质量交换，即进行浓度分配。有的分子还来不及进入两相界面，就被气相带走；有的则进人两相界面又来不及返回气相。这样，使得试样在两相界面上不能瞬间达到分配平衡，引起滞后现象，从而使色谱峰变宽。对于填充柱，气相传质阻力系数,C,g,为：,式中,k,为容量因子。由上式看出，气相传质阻力与填充物粒度,d,p,的平方成正比、与组分在载气流中的扩散系数,D,g,成反比。,液相传质过程是指组分从固定相的气,-,液界面移动到液相内部，并发生质量交换，达到分配平衡，然后又返回气,-,液界面的传质过程。此时气相中组分的其他分子仍随载气不断向柱出口运动，于是造成峰形扩张。,液相传质阻力系数,C,1,为：,由上式看出，固定相的液膜厚度,d,f,薄，组分在液相的扩散系数,D,1,大，则液相传质阻力就小。降低固定液的含量，可以降低液膜厚度，但,k,值随之变小，又会使,C,1,增大。当固定液含量一定时，液膜厚度随载体的比表面积增加而降低，因此，一般采用比表面积较大的载体来降低液膜厚度，但比表面太大，由于吸附造成拖尾峰，也不利分离。虽然提高柱温可增大,D,l,，但会使,k,值减小，为了保持适当的,C,l,值，应控制适宜的柱温。,将上面式总结，即可得气液色谱速率板高方程,这一方程对选择色谱分离条件具有实际指导意义，它指出了色谱柱填充的均匀程度，填料颗粒的大小，流动相的种类及流速，固定相的液膜厚度等对柱效的影响。,b.,液相色谱,对于液液分配色谱，传质阻力系数（,C,）包含流动相传质阻力系数（,C,m,）和固定相传质系数（,C,s,），即,:,C,C,m,C,s,其中,C,m,又包含流动的流动相中的传质阻力和滞留的流动相中的传质阻力，即,:,式中右边第一项为,流动的,流动相中的传质阻力。当流动相流过色谱柱内的填充物时，靠近填充物颗粒的流动相流速比在流路中间的稍慢一些，故柱内流动相的流速是不均匀。,m,是由柱和填充的性质决定的因子。,右边第二项为,滞留的,流动相中的传质阻力。这是由于固定相的多孔性，会造成某部分流动相滞留在一个局部，滞留在固定相微孔内的流动相一般是停滞不动的。流动相中的试样分子要与固定相进行质量交换，必须首先扩散到滞留区。如果固定相的微孔既小又深，传质速率就慢，对峰的扩展影响就大。,sm,是一系数，它与颗粒微孔中被流动相所占据部分的分数及容量因子有关。,液液色谱中固定相传质阻力系数（,C,s,）可用下式表示：,综上所述，对液液色谱的,Van Deemter,方程式可表达为：,该式与气液色谱速率方程的形式基本一致，主要区别在液液色谱中纵向扩散项可忽略不计，影响柱效的主要因素是传质阻力项。,（,4,）流动相线速率对板高的影响,a.LC,和,GC,的,H-u,图表明，对于一定长度的柱子，柱效越高，理论塔板数越大，板高越小。但究竟控制怎样的线速度，才能达到最小板高呢？根据,van Deemter,公式分别作,LC,和,GC,的,H-u,图，见图（,a,）和（,b,）。由图（,a,）和（,b,）不难看出：,LC,和,GC,的,H-u,图十分相似，对应某一流速都有一个板高的极小值，这个极小值就是柱效最高点；,LC,板高极小值比,GC,的极小值小一个数量级以上，说明液相色谱的柱效比气相色谱高得；,LC,的板高最低点相应流速比起,GC,的流速亦小一个数量级，说明对于,LC,来说，为了取得良好的柱效，流速不一定要很高。,b.,分子扩散项和传质阻力项对板高的贡献,（,5,）固定相粒度大小对板高的影响,固定相粒度对板高的影响是至关重要的。实验表明不同粒度，,H-u,曲线也不同（如图）：粒度越细，板高越小，并且受线速度影响亦小。这就是为什么在,HPLC,中采用细颗粒作固定相的根据。当然，固定相颗粒愈细，柱流速愈慢。只有采取高压技术，流动相流速才能符合实验要求,。,4,、分离度,右图说明了柱效和选择性对分离的影响。图中（,a,）两色谱峰距离近并且峰形宽。两峰严重相叠，这表示选择性和柱效都很差。图中（,b,）虽然两峰距离拉开了，但峰形仍很宽，说明选择性好，但柱效低。图中（,c,）分离最理想，说明选择性好，柱效也高。,由此可见，单独用柱效或选择性不能真实反映组分在色谱柱中分离情况，故需引人一个综合性指标,分离度,R,。分离度是既能反映柱效率又能反映选择性的指标，称,总分离效能指标,。分离度又叫分辨率，它定义为相邻两组分色谱峰保留值之差与两组分色谱峰底宽总和之半的比值，即,R,值越大，表明相邻两组分分离越好。一般说，当,R,1,时，两峰有部分重叠；当,R,1,时，分离程度可达,98,；当,R,1,5,时，分离程度可达,99,7,。通常用,R=1.5,作为相邻两组分已完全分离的标志。,下图表示了不同分离度时色谱峰分离的程度。,5,、基本色谱方程,分离度,R,的定义并没有反映影响分离度的诸因素。实际上，分离度受柱效（,n,）、选择因子,(),和容量因子（,k,）三个参数的控制。对于难分离物质对，由于它们的分配系数差别小，可合理地假设,k,1,k,2,=k,，,W,1,W,2,W,。,最后推导整理出基本色谱方程式：,在实际应用中，往往用,n,eff,。代替,n,，处理上式可得：,随后推导出基本色谱分离方程式又一表达式。,1,，没有戏！,R1.5,全分离。,（,1,）分离度与柱效的关系,由分离方程式看出，具有一定相对保留值,的物质对，分离度直接和,有效塔板数,有关，说明有效塔板数能正确地代表柱效能。而分离方程式表明分离度与,理论塔板数,的关系还受热力学性质的影响。当固定相确定，被分离物质对的,确定后，分离度将取决于,n,。这时，对于一定理论板高的柱子，分离度的平方与柱长成正比，即,虽说用较长的柱可以提高分离度，但延长了分析时间。因此提高分离度的好方法是制备出一根性能优良的柱子，通过降低板高，以提高分离度。,（,2,）分离度与选择因子的关系,由基本色谱方程式判断，当,=1,时，,R=0,，这时，无论怎样提高柱效也无法使两组分分离。显然，,大，选择性好。研究证明，,的微小变化，就能引起分离度的显著变化。一般通过改变固定相和流动相的性质和组成或降低柱温，可有效增大,值。,（,3,）,分离度与容量因子的关系,如果设：,则基本色谱分离方程式,写成,由,R/Q-k,的曲线图看出：,当,k,10,时，随容量因子,k,增大，,分离度的增长是微乎其微的。,一般取,k,为,210,最宜。对于,GC,，,通过提高温度，可选择合适的,k,值，以改进分离度。,而对于,LC,，只要改变流动相的组成，就能有效地控制,k,值。它对,LC,的分离能起到立竿见影的效果（见图）。,（,4,）,分离度与分析时间的关系,下式表示了分析时间与分离度及其他因素的关系。,设：,则可得：,（,5,）,基本色谱分离方程式的应用,在实际中，基本色谱分离方程式是很有用的公式，它将柱效、选择因子、分离度三者的关系联系起来了，知道其中两个指标，就可计算出第三个指标。,例,1-1,有一根,lm,长的柱子，分离组分,1,和,2,得到如图所示的色谱图。图中横坐标,l,为记录笔走纸距离。若欲得到,R=1.2,的分离度，有效塔板数应为多少？色谱往要加到多长？,精品课件,！,精品课件,！,例,1-2,已知某色谱柱的理论塔板数为,3600,，组分,A,和,B,在该柱上的保留时间为,27mm,和,30mm,，求两峰的峰半宽和分离度。,例,1-3,已知一色谱柱在某温度下的速率方程的,A=0.08cm;B=0.65cm2/s;C=0.003s,求最佳线速度,u,和最小塔板高,H,。,例,1-4,已知物质,A,和,B,在一个,30.0cm,柱上的保留时间分别为,16.40,和,17.63,分钟。不被保留组分通过该柱的时间为,1.30,分钟。峰宽为,1.11,和,1.21mm,，计算,:(1),柱分辨本领,;(2),柱的平均塔板数目,;(3),塔板高度,;(4),达到,1.5,分离度所需的柱长度,;(5),在较长柱上把物质,B,洗脱所需要的时间。,