褐飞虱E3泛素连接酶基因NlHECTD2的克隆和功能分析.pdf

月 ():昆 虫 学 报 :.:./.基金项目:国家自然科学区域联合基金项目()浙江省重点研发计划项目()浙江省“三农九方”科技协作计划项目()作者简介:罗怡 女 年 月生 浙江台州人 硕士研究生 研究方向为生物防治:.通讯作者 :.收稿日期:接受日期:褐飞虱 泛素连接酶基因 的克隆和功能分析罗 怡 郭莹莹 熊振泽 宋 阳 刘一鹏 俞晓平 申屠旭萍(中国计量大学生命科学学院 浙江省生物计量及检验检疫技术重点实验室 杭州)摘要:【目的】探明褐飞虱 泛素连接酶基因 的分子特性、表达模式及生物学功能【方法】基于褐飞虱转录组数据 克隆 全长 序列并进行生物信息学分析利用 检测 在卵、龄若虫、初羽化 内雌成虫和 日龄雌成虫中及 日龄雌成虫头、胸、腹、肠道和卵巢中的表达量初羽化褐飞虱雌成虫单头注射.(/)利用 检测 后 和 时 的表达量并检测褐飞虱血淋巴中类酵母共生菌()的数量、褐飞虱雌成虫存活率、单雌产卵量和卵孵化率【结果】克隆获得了褐飞虱 基因全长 序列(登录号:.)其开放阅读框长 编码 个氨基酸无信号肽包含 个具有泛素连接酶()亚类的 端催化结构域 系统发育分析表明 与半翅目其他昆虫 聚为一支与烟粉虱 亲缘关系最为接近 结果显示 具有明显的时空表达特异性在褐飞虱 日龄雌成虫腹中的表达量最高 结果显示与注射 对照比较注射 能够显著抑制 的表达量使褐飞虱血淋巴中的 数量极显著下降导致褐飞虱雌成虫存活率、单雌产卵量及卵孵化率极显著下降【结论】与褐飞虱体内 释放到血淋巴这一过程紧密相关并在褐飞虱的生长发育及繁殖过程中发挥重要作用可作为褐飞虱防控的潜在靶标关键词:褐飞虱 类酵母共生菌 干扰 基因功能中图分类号:文献标识码:文章编号:()(:)():【】.【】.期罗 怡等:褐飞虱 泛素连接酶基因 的克隆和功能分析 .(/)().【】(:.).().().().【】.:褐 飞 虱 隶 属 于 半 翅 目()飞虱科()是亚洲大部分水稻种植地区的首要害虫(廖世纯等 林拥军等 .)褐飞虱对水稻的危害主要表现在两方面:首先通过取食和产卵造成水稻机械损伤(.)其次表现在传播和诱发水稻病害(吕进等)化学防治一直以来是控制褐飞虱的主要手段但长期、大量和持续不合理使用化学杀虫剂不仅严重污染了环境同时使得褐飞虱对多种杀虫剂产生抗性(.)因此寻找新的绿色防控技术用于控制褐飞虱种群数量显得尤为重要类酵母共生菌()是褐飞虱体内的优势共生菌群(张珏锋等 唐明等)研究表明褐飞虱体内 数量的减少会导致褐飞虱的生长受阻、发育延迟以及存活率、羽化率和繁殖率等均下降(.)因此 有望成为防治褐飞虱的新靶标探究 在褐飞虱体内垂直传递的 过 程 有 利 于 为 褐 飞 虱 防 治 提 供 新 思 路(.)前期实验研究表明褐飞虱初羽化雌成虫血淋巴中仅存在少量 而在羽化后 雌成虫血淋巴中则存在大量(未发表)为探明 从脂肪体释放到血淋巴这一过程的影响因素和调控机制我们对褐飞虱初羽化雌成虫(开始释放时间点)和羽化后 时雌成虫(大量释放时期)的脂肪体进行转录组测序分析发现 泛素连接酶基因 表达量在 释放过程中存在显著差异 泛素蛋白酶体系统()是真核生物重要的翻译后修饰机制对细胞周期、转录调控、修复以及信号转导等生物过程均具有重要的调控作用(.)同时也是最有效的特异降解蛋白质的途径之一()而 连接酶是该过程中泛素分子对靶蛋白进行特异性识别最关键的一类酶()负责识别特定靶标蛋白的赖氨酸将泛素转移到底 物 蛋 白 并 使 之 泛 素 化 降 解(.)根据 结构域和作用方式 泛素连接酶可分为 类:包含 结构域的、包含 结构域的 以及包含 结构域的(.)类 结构域是双叶的包含一个 和 与 中间体共价结合 中的半胱氨酸结合位点对泛素转移至底物至关重要 的后 个氨基酸是检测泛素链特异性所必需的(.)类 氨基端结构域具有多态性这些结构域可能促进底物蛋白质相互作用(昆虫学报 卷.)本研究克隆鉴定了褐飞虱 泛素连接酶基因对其核苷酸序列和蛋白序列进行生物信息学分析同时利用 检测其在褐飞虱不同发育阶段和不同组织中的表达量分析其时空表达规律并进一步分析 表达量下调对褐飞虱生物学功能的影响以期为褐飞虱防治提供新的方向及理论基础 材料与方法.供试昆虫供试褐飞虱虫源采自浙江省生物计量及检验检疫技术重点实验室人工气候室在室内室温条件下以 感虫水稻连续多代不喷药饲养 褐飞虱饲养条件:温度()相对湿度 光周期 收集褐飞虱卵、龄若虫、初羽化 内雌成虫、日龄雌成虫及 日龄雌成虫头、胸、腹、肠道和卵巢各样本共收集 次独立样品其中卵约 粒 龄若虫分别 头 龄若虫分别 头 龄若虫 头初羽 内雌成虫和 日龄雌成虫 头不同组织样本取自 头褐飞虱 日龄雌成虫置于 冰箱等待使用.总 提取和 合成使用 提取试剂盒()提取.节中收集的褐飞虱不同样品的总 总 质量和浓度经微量分光光度计(美国)检测 取 总 合成 实验操作依照第 链 合成试剂盒()使用手册合成的.的克隆及测序基于褐飞虱转录组数据并结合褐飞虱全基因组 信 息 获 得 的 全 长 序 列(登录号:.)利用 软件设计引物(表)以褐飞虱(整虫)为模板扩增 的全长 序列 反应体系:酶 上下游引物(/)各 模板 用 补充体积至 扩增程序:预变性 变性 退火 延伸 个循环 获得的 产物通过 琼脂糖凝胶电泳检测回收并将回收所得 样本送至上海生工生物公司测序分析.的生物学分析利用 网站预测 (:./)通 过 翻译 序列(:./.)在 信 号 肽 网 站 预 测 编码蛋白有无信号肽结构(:./)利用 预测和分析 编码氨基酸序列磷酸化位点(:./)通过 对 编码氨基酸序列保守结构域进行分析(:./.)使用 软件以邻接法()法构建系统发育树 次重复.的时空表达量检测根据.节克隆的 全长 序列利用 软件设计引物以 为内参基因(表)以.节中收集的褐飞虱不同发育阶段和 日龄雌成虫组织样本 为模板利用 检测 在褐飞虱不同发育阶段和不同组织中的表达量 反应体系:上下游引物(/)各.用 补充体积至 扩增程序:预变性 变性 退火及延伸 个循环每组设置 次生物学重复及 次技术重复.干扰基于 和 的 序列委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行 引物合成(表)严格参照 说明书进行 和 的 合 成 经 和 琼脂糖凝胶电泳检测合格后将浓度用 稀释至 /用于 实验 将褐飞虱初羽化雌成虫置于体视显微镜下使用显微注射仪在褐飞虱胸部第 足之间的部位缓慢注射.完成注射后 剔除机械性死亡试虫并将活虫转移至温网室进行饲养设置 个平行实验以注射 的褐飞虱为实验组注射 为对照组每组各 头试虫收集注射后 和 时的褐飞虱样本检测其体内 的表达量观察并计算血淋巴中 的数量同时计算褐飞虱 后 时的雌成虫存活率、单雌产卵量及卵孵化率 期罗 怡等:褐飞虱 泛素连接酶基因 的克隆和功能分析 表 引物信息 引物引物序列()用途克隆.数据分析利用 法计算 的相对表达量()实验数据采用平均值 标准误来表示利用 软件进行数据处理及分析 采用单因素方差分析()检验进行差异显著性检验利用.绘制作图 多重比较是基于方差分析的基础上数据两两对比差异性也是用.软件进行分析的 结果.的克隆及序列克隆和测序得到褐飞虱 的 全长序列与 中登录号为.的序列完全一致其开放阅读框长 编码 个氨基酸预测分子量为 .等电点为 该基因编码氨基酸序列无信号肽包含 个具有泛素连接酶()亚类的 端催化结构域其中有 个磷酸化修饰位点、个丝氨酸修饰位点()、个苏氨酸修饰位点()、个酪氨酸修饰位点()及 个 糖基化()修饰位点 系统发育分析显示(图)与烟粉虱 蛋白序列一致性最高亲缘关系最为接近与所有半翅目昆虫 在 树上聚为一支表明 基因的核心结构域在不同昆虫中是高度保守的暗示着 在不同昆虫中的核心功能可能类似且具有重要的生物学功能图 邻接法构建的基于氨基酸序列的褐飞虱和其他昆虫 的系统发育树(次重复).().的时空表达模式 检测结果表明在褐飞虱的各发育阶段中 的表达量在 日龄雌成虫中达到最高且随着发育历期的延长无明显变化(图:)在褐飞虱 日龄雌成虫不同组织中均有表达其在腹中的表达量最高(图:)昆虫学报 卷图 在褐飞虱不同发育阶段()及 日龄雌成虫不同组织中()的相对表达量.()():卵 :分别为 龄若虫 :初羽化 内雌成虫 :分别为 日龄雌成虫 :头 :胸 :腹 :肠道 :卵巢.图中数据为平均值 标准误柱上不同字母代表差异显著(.单因素方差分析 检验).(.).的干扰效果相比对照(注射)注射 后 和 时褐飞虱雌成虫体内 表达量 分 别 极 显 著 下 降 了.和 (.)(图:)血淋巴中 数量分别显著降低了.和.(图 干扰初羽化褐飞虱雌成虫后体内 的表达量()、血淋巴中类酵母共生菌()数量()、存活率()、单雌产卵量()及卵孵化率().()()()()()()图中数据为平均值 标准误柱上双星号代表差异极显著(.单因素方差分析 检验).(.).期罗 怡等:褐飞虱 泛素连接酶基因 的克隆和功能分析 )(图:)表明干扰 后会影响 的释放并且干扰效率在不同时间不受影响存活率检测结果表明(图:)对照组(注射)褐飞虱雌成虫存活率下降斜率较小存活曲线趋势较为平缓注射后 时存活率为即样本全部死亡实验组(注射)褐飞虱雌成虫存活率下降较快存活曲线趋势较陡且注射后 时样本全部死亡说明干扰 不利于褐飞虱的正常生长发育 单雌产卵量(图:)和卵孵化率(图:)检测结果表明对照组(注射)褐飞虱单雌产卵量最高为 粒未孵化卵数量小于 粒平均卵孵化率大于 而实验组(注射)褐飞虱单雌产卵量最高为 粒未孵化卵数量最高为 粒平均卵孵化率小于与对照组相比具有极显著差异性(.)讨论本研究克隆鉴定了一个褐飞虱 类 泛素连接酶基因 并对其序列特征以及表达模式进行分析初步解析了该基因对褐飞虱体内 释放过程及褐飞虱生长发育的影响董婷婷()在研究 类 泛素连接酶基因 在中国卤虫 滞育解除后早期胚胎发育过程中的作用机制中检测了 在转录水平及蛋白水平的表达模式发现蛋白水平在 时达到峰值转录水平在 时达到峰值其表达模式同中国卤虫滞育解除后胚胎发育的重 要 阶 段 十 分 契 合 相 似 的 是 本 研 究 中 在褐飞虱体内表达同样具有明显的时空特异性 表达量在褐飞虱雌成虫期显著高于卵期和若虫期的(图:)在所有发育阶段中日龄成虫期时其表达量最高且随着发育阶段无明显变化 同时检测到 日龄成虫期后相比于初羽化褐飞虱成虫血淋巴中 数目大幅上升(未发表)表明 表达模式同褐飞虱羽化 后进入产卵期阶段十分契合 对褐飞虱 日龄雌成虫的不同组织中 表达量的分析结果表明 在腹中的表达量最高这与 主要聚集在褐飞虱雌虫腹部脂肪体情况相一致昆虫体内的 传递主要是经卵传播的垂直传递在生长发育和繁殖中起重要作用(吕仲贤等 .)白旭等()采用血球计数法并结合显微摄像系统研究灰飞虱雌虫体内 的数量动态及与卵巢发育和产卵量之间的相互关系发现产卵量与灰飞虱体内 数量存在显著的正相关表明 的存在有利于灰飞虱卵子发育和成熟 本研究利用 技术对 进行了沉默与对照组相比沉默 后的褐飞虱血淋巴中 数目极显著减少(图:)且褐飞虱存活率、单雌产卵量及孵化率也极显著降低(图:)同样唐耀华等()的研究也表明通过 技术干扰 和 影响褐飞虱体内 的数目最终也会影响褐飞虱的存活、发育等 因此推测 影响 从脂肪体释放到血淋巴的过程从而导致卵母细胞内的 数量减少 因此推测 影响 从脂肪体释放到血淋巴的过程从而导致卵母细胞内的 数量减少破坏褐飞虱与类酵母共生菌之间的微生态从而导致褐飞虱生存能力及繁殖能力下降 与褐飞虱休戚与共以 作为防治切入点是阻碍褐飞虱正常生长发育繁殖并阻止其继续为害的一种有效途径 而 在维持褐飞虱正常的生存及生理过程中发挥着重要作用可以将其作为应用 技术防控褐飞虱的潜在靶标参考文献().():.白旭 董胜张 边亚琳俞晓平 陈建明.类酵母共生菌与灰飞虱卵巢发育和产卵量的关系.植物保护学报():.:.():.:.董 婷 婷.在中国卤虫滞育胚胎重启动中表达及功能研究.大连:辽宁师范大学硕士学位论文 .():.():.昆虫学报 卷 .:.:.():.().():.():.廖世纯 王凤英 黎柳锋.水稻褐飞虱防控策略.中国农学通报():.():.().():.林拥军 华红霞 何予卿 杨长举 翟保平 沈晋良 张开军 薛晓峰 傅强 罗举娄永根 祝增荣 唐启义 吕仲贤 徐红星 郑许松 黄凤宽彭兆谱 何光存 陈荣智 郭慧芳 陈其志 万丙良 吕亮 林华峰 刘芳 肖汉祥 侯茂林 姚英娟.水稻褐飞虱综合治理研究与示范:农业公益性行业专项“水稻褐飞虱综合防控技术研究”进展.应用昆虫学报():.().():.():.吕进 祝增荣 娄永根 程家安.稻飞虱灾变和治理研究透析.应用昆虫学报():.().():.吕仲贤俞晓平 陈建明 郑许松 徐红星.共生菌对褐飞虱生长发育和生殖的影响.植物保护学报():.():.():.(/):.().:.():.唐明 徐小蓉 洪鲲 乙引.褐飞虱体内细菌型共生菌的分布.贵州农业科学():.().():.唐耀华 万品俊 郝培应 傅强 俞晓平.酵母共生菌中两个组氨酸合成基因在褐飞虱发育中的作用.中国水稻科学():.():.().():.:.():.:.():.张珏锋 陈建明 陈法军 郑许松 陈列忠 俞晓平.褐飞虱内共生菌的分离及其 部分序列分析.中国农业科学 ():.():.(责任编辑:马丽萍)