毒害艾美耳球虫和产气荚膜梭菌双重PCR检测方法的建立.pdf
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1、畜牧兽医学报 2 0 2 3,5 4(9):3 9 8 5-3 9 9 0A c t a V e t e r i n a r i a e t Z o o t e c h n i c a S i n i c ad o i:1 0.1 1 8 4 3/j.i s s n.0 3 6 6-6 9 6 4.2 0 2 3.0 9.0 3 6开放科学(资源服务)标识码(O S I D):毒害艾美耳球虫和产气荚膜梭菌双重P C R检测方法的建立陈 曦,王 一,王佳丽,杨 新,宋军科,赵光辉*(西北农林科技大学动物医学院,杨凌 7 1 2 1 0 0)摘 要:旨在初步建立可同时检测毒害艾美耳球虫(E i m
2、 e r i a n e c a t r i x)和产气荚膜梭菌(C l o s t r i d i u m p e r f r i n g e n s)的双重P C R及纳米P C R检测方法。基于E.n e c a t r i x的 I T S-2基因和 C.p e r f r i n g e n s的 毒素基因分别设计、筛选靶基因位点的特异性扩增引物,通过反应体系和退火温度的优化,建立适用于两种病原的特异性双重P C R和双重纳米P C R检测方法;用所建立的方法对6种其它常见寄生性原虫和3种其他细菌进行P C R扩增以验证其特异性;构建两种病原的重组质粒p MD 1 9-T-I T S
3、 2和p MD 1 9-T-c p a,将其按1 0倍倍比稀释成不同浓度梯度的质粒模板用于所建方法的敏感性试验。结果表明:两种方法均能特异性扩增出E.n e c a t r i x约1 5 0 b p和C.p e r f r i n g e n s约4 0 0 b p的目的片段,且所建立的两种检测方法对其他6种其他原虫和3种其他细菌的检测结果均为阴性;双重P C R扩增E.n e c a t r i x和C.p e r f r i n g e n s的最低模板检出量分别是1 8 1和1 0 5 0 c o p i e s,而双重纳米P C R的最低模板检出量分别是1.8 1和1 0 5 c o
4、 p i e s;临床检测结果显示,所建立的2种方法与临床病原学检测结果一致。成功建立了用于E.n e c a t r i x和C.p e r f r i n g e n s双重P C R和双重纳米P C R检测方法,且敏感性好、特异性高,可为临床上毒害艾美耳球虫和产气荚膜梭菌感染的检测提供技术支持。关键词:毒害艾美耳球虫;产气荚膜梭菌;P C R;纳米P C R中图分类号:S 8 5 4.4 3 文献标志码:A 文章编号:0 3 6 6-6 9 6 4(2 0 2 3)0 9-3 9 8 5-0 6收稿日期:2 0 2 2-1 1-2 1基金项目:陕西省重点研发计划项目(2 0 2 0 NY
5、-0 0 6);陕西省创新能力支撑计划项目(2 0 2 1 T D-3 1)作者简介:陈 曦(1 9 9 7-),男,河南平顶山人,硕士生,主要从事分子病原学研究,E-m a i l:c h e n x i 3 5 1 7n w a f u.e d u.c n;王 一(1 9 9 6-),女,四川绵阳人,硕士,主要从事分子病原学研究,E-m a i l:w a n g y i 9 6 1 41 6 3.c o m。陈曦和王一为同等贡献作者*通信作者:赵光辉,主要从事动物寄生虫病的防控研究,E-m a i l:z g h 0 8 3n w s u a f.e d u.c nE s t a b l
6、 i s h m e n t o f D u p l e x P C R M e t h o d s f o r D e t e c t i o n o f E i m e r i a n e c a t r i x a n d C l o s t r i d i u m p e r f r i n g e n sCHE N X i,WANG Y i,WANG J i a l i,YANG X i n,S ONG J u n k e,Z HAO G u a n g h u i*(C o l l e g e o f V e t e r i n a r y M e d i c i n e,N o
7、r t h w e s t A&F U n i v e r s i t y,Y a n g l i n g 7 1 2 1 0 0,C h i n a)A b s t r a c t:T h e a i m o f t h i s s t u d y w a s t o e s t a b l i s h a d u p l e x P C R a n d a d u p l e x n a n o-P C R m e t h o d f o r s i m u l t a n e o u s d e t e c t i o n o f E i m e r i a n e c a t r i
8、x a n d C l o s t r i d i u m p e r f r i n g e n s.P r i m e r s f o r t a r g e t g e n e l o c i w e r e d e s i g n e d a n d s c r e e n e d b a s e d o n t h e E.n e c a t r i x I T S-2 g e n e a n d t h e C.p e r f r i n g e n s t o x i n g e n e,r e s p e c t i v e l y,a n d s p e c i f i c
9、d u p l e x P C R a n d n a n o-P C R d e t e c t i o n m e t h o d s f o r t w o p a t h o g e n s w e r e e s t a b l i s h e d b y o p t i m i z i n g r e a c t i o n s y s t e m s a n d a n n e a l i n g t e m p e r a t u r e s.P C R a m-p l i f i c a t i o n s o f s i x o t h e r p r o t o z o
10、a n p a r a s i t e s a n d t h r e e o t h e r b a c t e r i a w e r e u s e d t o v e r i f y t h e i r s p e-c i f i c i t i e s.T h e r e c o m b i n a n t p l a s m i d s p MD 1 9-T-I T S 2 a n d p MD 1 9-T-C P A w e r e f u r t h e r c o n s t r u c t e d a n d d i l u t e d i n t o d i f f e
11、r e n t c o n c e n t r a t i o n g r a d i e n t s w i t h 1 0 t i m e s r a t i o f o r s e n s i t i v i t y t e s t s o f t h e p r o p o s e d m e t h o d s.T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e t a r g e t f r a g m e n t s o f E.n e c a t r i x a n d C.p e r f r i n-畜 牧 兽 医 学 报5 4卷 g
12、e n s w e r e a b o u t 1 5 0 b p a n d 4 0 0 b p,r e s p e c t i v e l y.T h e P C R a m p l i f i c a t i o n s u s i n g t h e t w o d e t e c t i o n m e t h o d s w e r e n e g a t i v e f o r o t h e r s i x p r o t o z o a n p a r a s i t e s a n d t h r e e o t h e r b a c t e r i a.T h e m
13、i n i m u m d e t e c t a b l e l i m i t s f o r E.n e c a t r i x a n d C.p e r f r i n g e n s b y u s i n g d u a l P C R w e r e 1 8 1 c o p i e s a n d 1 0 5 0 c o p i e s,r e s p e c t i v e l y,w h i l e t h e m i n i m u m d e t e c t a b l e l i m i t s f o r E.n e c a t r i x a n d C.p e
14、r f r i n-g e n s b y u s i n g d u a l n a n o-P C R w e r e 1.8 1 a n d 1 0 5 c o p i e s,r e s p e c t i v e l y.C l i n i c a l d e t e c t i o n s h o w e d t h a t t h e d e t e c t i o n r e s u l t s o f t w o e s t a b l i s h e d m e t h o d s w e r e c o n s i s t e n t w i t h c l i n i
15、c a l p a t h o g e n i c d e-t e c t i o n.T h e p r e s e n t s t u d y s u c c e s s f u l l y e s t a b l i s h e d d u p l e x P C R a n d d u p l e x n a n o-P C R m e t h o d s f o r d e t e c t i o n o f E.n e c a t r i x a n d C.P e r f r i n g e n s,w i t h h i g h s e n s i t i v i t y a
16、n d s p e c i f i c i t y,p r o v i d i n g t e c h n i c a l s u p p o r t s f o r c l i n i c a l d e t e c t i o n o f E.n e c a t r i x a n d C.p e r f r i n g e n s i n f e c t i o n s.K e y w o r d s:E i m e r i a n e c a t r i x;C l o s t r i d i u m p e r f r i n g e n s;P C R;n a n o-P C R*
17、C o r r e s p o n d i n g a u t h o r:Z HAO G u a n g h u i,E-m a i l:z g h 0 8 3n w s u a f.e d u.c n 毒害艾美耳球虫(E i m e r i a n e c a t r i x)属于孢子虫纲、艾美耳科、艾美耳属,是引起鸡球虫病的主要致病病原之一,可造成鸡的营养吸收障碍、饲料转化率降低、血痢等症状,感染严重的雏鸡甚至会出现大批死亡1-4。产气荚膜梭菌(C l o s t r i d i u m p e r f r i n-g e n s)是一种革兰阳性厌氧菌,在自然界广泛分布,可引起鸡的坏死性
18、肠炎5,表现采食量下降,产蛋量减少,严重时鸡只消瘦、排黑色稀便并伴有恶臭味,有时会出现血痢6,多见于26周龄的肉鸡,发病率和病死率较高,病死率最高可达5 0%7-8,经治疗后的雏鸡会出现发育迟缓、生产性能下降等,严重危害全球畜牧业的发展9。纳米P C R(n a n o p a r t i c l e-a s s i s t e d P C R,n a n o-P C R)是纳米技术结合分子生物学的一种新型P C R方法,通过向体系中加入纳米颗粒,使P C R具有更好的灵敏性、特异性和反应速率1 0。纳米粒子良好的导热性使纳米P C R 检测在扩增过程中更快地达到目标温度,同P C R 相比减
19、少了反应在非目标温度下的时间,可以有效减少非特异性扩增,增加反应的灵敏度。有研究表明,加入纳米粒子的P C R的灵敏度提高了5倍1 0倍,实时荧光P C R的灵敏度提高1 04倍1 1-1 2。同时,纳米粒子有同单链结合蛋白(s i n g l e s t r a n d b i n d i n g p r o t e i n,S S B)相似的作用,可有效降低引物和模板的错配从而提高特异性1 3。此外,纳米粒子还可通过在反应体系中吸附D NA聚合酶、M g2+、寡核苷酸引物或D NA模板,使P C R反应物聚集,提高反应效率1 4。由于纳米P C R优良的性能,近年来已经应用于犬巴贝斯虫(B
20、 a b e s i a c a n i s)、犬肝簇虫(H e p a t o z o o n c a n i s)和食脑性阿米巴 原 虫(A c a n t h a m o e b a s p p.、B a l a m u t h i a m a n-d r i l l a r i s、N a e g l e r i a f o w l e r i)等病原的检测1 5-1 6。临床上,鸡球虫和产气荚膜梭菌常混合感染。为了实现同时对两种病原的快速检测,本研究初步建立了检测毒害艾美耳球虫和产气荚膜梭菌的双重P C R及双重纳米P C R检测方法,以期为临床鸡毒害艾美耳球虫病 和坏死性肠 炎 的
21、 诊 断 提 供 技 术支持。1 材料与方法1.1 病原及质粒毒害艾美耳球虫、产气荚膜梭菌、柔嫩艾美耳球虫、贝氏隐孢子虫、蓝氏贾第虫、毕氏肠微孢子虫、芽囊原虫、禽毛滴虫、沙门菌、金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌等病原的基因组D NA样品由西北农林科技大学动物寄生虫学实验室提取、鉴定并保存。p MD 1 9-T-I T S 2和p MD 1 9-T-c p a质粒均由西北农林科技大学动物寄生虫学实验室构建、保存。1.2 主要试剂E.Z.N.A.S t o o l D NA K i t购自美国Om e g a B i o-t e k公司;纳米P C R试剂盒购自上海户实医药科技有限公司;E x T a
22、 q D NA聚合酶、1 0E x T a q B u f f e r(M g2+f r e e)、M g C l2、d NT P、6 L o a d i n g b u f f e r、D L 2 0 0 0 D NA M a r k e r、p MD 1 9-T V e c t o r、大肠埃希菌感受态细胞J M 1 0 9均购自中国宝生物工程(大连)有限公司;D NA纯化回收试剂盒、质粒小提中量试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。1.3 引物设计与合成参考G e n B a n k数据库收录的毒害艾美耳球虫I T S-2基 因 序 列(G e n B a n k登 录 号:AM 9
23、2 2 2 4 3、AM 9 2 2 2 4 2、AM 9 2 2 2 4 1、J N 0 2 2 5 8 8、J N 0 2 2 5 8 7)应用软件D NAMAN 7.0设计一对引物E n I T S 2 F/R。产气荚膜梭菌的特异性引物c p a 3 9 8 F/R参考前人6893 9期陈 曦等:毒害艾美耳球虫和产气荚膜梭菌双重P C R检测方法的建立文献1 7。引物均由生工生物技术(上海)有限公司合成(表1)。表1 毒害艾美耳球虫和产气荚膜梭菌双重P C R和双重纳米P C R扩增引物T a b l e 1 P r i m e r s f o r d u p l e x P C R a
24、 n d d u p l e x n a n o-P C R t o d e t e c t E.n e c a t r i x a n d C.p e r f r i n g e n s引物名称P r i m e r n a m e引物序列(5 3)P r i m e r s e q u e n c e 退火温度/Tm产物大小/b pP r o d u c t s i z eE n I T S 2 FG G AA C T C T C T A C C C G G AG5 4.3 8E n I T S 2 RC A G G C A TA T C C T A G T G C T G T G5 5.
25、4 51 5 1c p a 3 9 8 FA T G AG C T T C AA T T AG G T T C T A C T5 0.2 9c p a 3 9 8 RA T C AG C A TAAAAA T C C T C A T T4 5.9 23 9 81.4 毒害艾美耳球虫和产气荚膜梭菌双重P C R检测方法的建立 双重P C R预设定反应体系:1 0E x T a q B u f f-e r(M g2+f r e e)1.2 5 L、d NT P(2.5 mm o lL-1)1 L、M g C l2(2 5 mm o lL-1)1 L、E n I T S 2 F/R(1 0 m o
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