氟化脱细胞兔主动脉制备人工小血管的可行性研究.pdf
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1、Vol.43 No.7 Jul.2023上海交通大学学报(医学版)JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE)Vol.43 No.7 Jul.2023JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE)氟化脱细胞兔主动脉制备人工小血管的可行性研究张如杰1,周广东2,王建博1,翁光东1,雷东2#,龚文辉1#1.安徽医科大学第一附属医院心脏大血管外科,合肥 230088;2.上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科,上海市组织工程研究重点实验室,上海 200125摘
2、要 目的探讨氟化脱细胞兔主动脉作为组织工程人工小血管的可行性。方法联合聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、脱氧胆酸钠(sodium deoxycholate,SD)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)、DNA酶、RNA酶等对获取的兔主动脉进行脱细胞处理,分别对脱细胞组和未脱细胞组进行苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,H-E染色)、Masson染色、Verhoff-von Gieson染色,用场发射扫描电镜鉴定脱细胞效果,观察脱细胞血管形态学变化。使用脱细胞后的兔主动脉作为动脉化人工小血管支架,利用液体全氟化碳
3、涂层修饰脱细胞小血管内膜(氟化组)制备一种新型人工小血管,并对其特征基团进行定性且定量测定。观察血管内表面液体消散时间和液体在45倾斜血管表面的流动情况来分析血管的疏水性。将脱细胞组和氟化组的血管置入富含血小板的血浆后孵育,在电镜下观察,评估体外抗血小板聚集性能。取未脱细胞组、脱细胞组以及氟化组的兔主动脉连接上球囊扩张压力泵进行爆破压力测试。结果对血管进行组织学观察发现,联合脱细胞法可以有效去除细胞并保留胶原蛋白和弹性纤维,且在电镜下内膜并未出现破损。对3组进行压力爆破测试,3组间比较差异无统计学意义。在疏水性测试中,水滴在氟化组内膜上停留的时间超过5 min,且在45斜板上未留下明显水迹。在
4、血小板黏附性试验中,脱细胞组内膜聚集活化了血小板,而氟化组则得到抑制。结论联合脱细胞法可使脱细胞血管具有良好力学性能和物理稳定性,氟化涂层可使血管具有抗凝血性及较好的生物相容性。关键词脱细胞;组织工程;兔;小血管;内膜;涂层DOI10.3969/j.issn.1674-8115.2023.07.003 中图分类号R654.3 文献标志码AFeasibility study on the preparation of artificial small blood vessel by fluorinated decellularized rabbit aortaZHANG Rujie1,ZHOU
5、Guangdong2,WANG Jianbo1,WENG Guangdong1,LEI Dong2#,GONG Wenhui1#1.Department of Cardio-Vascular Surgery,The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University,Hefei 230088,China;2.Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai 9th Peoples Hospital,Shanghai Jiao Tong University School o
6、f Medicine;Shanghai Key Lab of Tissue Engineering,Shanghai 200125,ChinaAbstract Objective To explore the feasibility of fluorinated decellularized rabbit aorta as a small artificial blood vessel for tissue engineering.Methods The obtained rabbit aorta was decellularized in combination with Triton X-
7、100,sodium deoxycholate(SD),sodium dodecyl sulfate(SDS),DNAse,and RNAse.Hematoxylin-eosin staining(H-E staining),Masson staining and Verhoff-von Gieson staining were performed in the decellularized group and undecellularized group,respectively.The effect of decellularization was identified by field
8、emission scanning electron microscope,and the morphological changes of decellularized blood vessels were observed.The decellularized rabbit aorta was used as the arterialized artificial small vessel scaffold,and the decellularized small vessel intima was modified with liquid perfluorocarbons coating
9、 to prepare a new type of artificial small vessel.The characteristic groups of the artificial small vessel were qualitatively and quantitatively determined.The dissipation time of liquid on the inner surface of the vessel and the flow of liquid on the surface of the vessel tilted at 45 were observed
10、 to analyze the hydrophobicity of the vessel.The blood vessels in the decellularized group and the fluorinated group were implanted with platelet-rich plasma,incubated,and observed under an electron microscope to evaluate the antiplatelet aggregation in vitro.The balloon pressure pump was connected
11、to the aorta of the undecellularized group,decellularized group and fluoride group for bursting pressure test.Results Histological observation of blood vessels showed that the combination could effectively remove cells while retaining collagen and elastic fibers,and there was no damage to the intima
12、 under the electron microscope.There was no significant difference in the pressure blasting test among the three groups.In the hydrophobicity experiment,the retention time of water droplets on the membrane of the fluorinated group was over 5 min,and no obvious water marks were left on the 45 incline
13、d plate.生物材料与再生医学专题基金项目 安徽省自然科学基金(1908085MH241)。作者简介 张如杰(1995),男,硕士生;电子信箱:。通信作者 龚文辉,电子信箱:。雷 东,电子信箱:。#为共同通信作者。Funding Information Natural Science Foundation of Anhui Province(1908085MH241).Corresponding Author GONG Wenhui,E-mail:.LEI Dong,E-mai:.#Co-responding authors.814张如杰,等氟化脱细胞兔主动脉制备人工小血管的可行性研究ht
14、tp:/上海交通大学学报(医学版),2023,43(7)In the platelet adhesion test,intimal aggregation activated platelets in the decellularized group,while they were inhibited in the fluorinated group.Conclusion The decellularized blood vessels have good mechanical properties and physical stability by combined decellulariz
15、ation,and the fluorinated coating makes the blood vessels have good anticoagulant and biocompatibility.Key words decellularization;tissue engineering;rabbit;small blood vessel;intima;coating冠心病(coronary heart disease,CHD),又称冠状动脉性心脏病、缺血性心脏病,是世界范围内引起死亡的主要因素之一1-2。目前主要通过改变生活方式、药物治疗、介入治疗、冠状动脉旁路移植术(corona
16、ry artery bypass grafting,CABG)来改善CHD患者的症状。CABG使用自体动脉作为桥血管,可将血液转移到大动脉狭窄部位周围。常见桥血管包括乳内动脉、桡动脉和大隐静脉3。移植物的通畅率与CABG的成功直接相关。由于结构和功能上的差异,动脉移植物比大隐静脉移植物有更好的长期通畅率,具有明显的应用优势4-5。然而,自体动脉血管有获取不便以及动脉粥样硬化性疾病所致无法获得等问题6。支架材料是构建组织工程血管的基础,包括高分子可生物降解聚合物材料以及脱细胞生物材料7。单种分子的高分子聚合物血管支架无法达到细胞外基质的复杂成分和结构,在体内容易形成血栓而导致堵塞8。脱细胞生物材
17、料不仅保留了天然组织的多糖、蛋白、胶原等细胞外基质成分,还具有三维结构完整、力学适配以及生物活性等优点。生物血管经脱细胞后能够彻底去除细胞及 DNA,降低了免疫原性。然而,虽然脱细胞血管免疫原性降低了,但血流流速降低会导致吻合口处的血栓形成及内膜增生9,这是人工小血管移植后失败的最主要原因10。与大鼠相比,兔血管的血栓形成机制、通畅率和内皮化率11等与人类更相似。因此,为提高支架材料的血液相容性,使小口径组织工程血管保持长期通畅,本研究拟采用氟化脱细胞兔主动脉作为新型人工小血管进行体外实验,探索全氟化碳内膜涂层生物材料小口径组织工程血管的应用可能,以期为临床解决小口径人工血管提供依据。1材料与
18、方法1.1实验动物、试剂与仪器新西兰大白兔(安徽医科大学动物实验中心)18只,体质量2.5 kg左右,按清洁标准喂养。戊巴比妥钠西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司,磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer saline,PBS;普诺赛),聚乙二醇辛基苯基醚Triton X-100;柯意哲(上海)机电工程有限公司,脱氧胆酸钠(sodium deoxycholate,SD;上海麦克林生化科技有限公司),十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS;上海麦克林生化科技有限 公 司),苏 木 精-伊 红 染 色(hematoxylin-eosin staining,H-
19、E染色)试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司),Masson染色试剂盒及Verhoff-von Gieson染色试剂盒(珠海贝索生物技术有限公司),DNA 酶(Worthington Biochemical Corporation,美国),RNA酶(Worthington Biochemical Corporation,美国),25%戊二醛溶液(赛默飞世尔科技公司,美国),4%多聚甲醛固定液(上海碧云天生物技术有限公司);场发射扫描电 镜(field emission scanning electron microscope,FSEM;ZEISS GeminiSEM 300,卡尔蔡司,德国),临
20、界点干燥仪(QUORUM K850,Quorum,英国),离子溅射仪(Cressington 108Auto,Cressingfton,英国)扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM;JSM-5600LV,JEOL,日本),能谱仪(energy disperse spectroscopy,EDS;IE300X,Oxford,英国)等。1.2脱细胞血管制备及分组利用戊巴比妥钠将兔麻醉,经腹中线剖开完全暴露腹主动脉,从髂总脉分支一直游离到膈肌下方;切开左侧胸肋骨,彻底暴露腹主动脉,将其游离;将主动脉上的各个分支结扎,分别夹闭主动脉近心端,将主动脉取下。用PB
21、S液对主动脉灌洗45遍,冲去血管腔内血凝块,同时去除外表面多余结缔组织。1.2.1脱细胞组脱细胞组(n=6)采用联合脱细胞法。首先进行脱细胞液准备,包括化学试剂溶液(0.375%SD、0.375%SDS、0.375%Triton X-100 的PBS溶液)和生物酶制剂溶液(15 g/mL RNA酶及150 g/mL DNA酶的PBS溶液)12。冲洗修剪好的兔血管置入化学试剂溶液内,放入4 摇床中持续冲洗震荡48 h,每24 h更换脱细胞液1次,共2个循环。然后将血管置于生物酶试剂PBS溶液中,放入37 摇床中持续冲洗震荡2 h。将处理完毕的血管(图1)放入PBS溶液中置4 冰箱,在7 d内进行
22、下一步实验。8152023,43(7)上海交通大学学报(医学版)Vol.43 No.7 Jul.2023JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE)1.2.2未脱细胞组未脱细胞组(n=6)将上述方法中的脱细胞液全部替换为PBS缓冲液,其余处理方法同“1.2.1”。1.2.3氟化组氟化组(n=6)脱细胞处理方法同“1.2.1”。随后对血管进行氟化涂层处理,处理方法见“1.4”。1.3血管组织学观察分别在脱细胞组和未脱细胞组的血管远端部位取小块组织 4%多聚甲醛固定,石蜡包埋后切片进行H-E 染色、Masson 染色及 Verh
23、off-von Gieson 染色,观察2组血管组织的形态学变化。同样在2组相同部位血管取小块组织用 2.5%戊二醛溶液固定,脱水、浸泡、包埋、修块、超薄切片、镀金,用FSEM观察并拍照。1.4脱细胞兔主动脉的氟化处理取脱细胞兔主动脉血管8段,放入20 冰箱中冷冻24 h,转至80 冰箱中冻干48 h。将1H,1H,2H,2H-全氟辛基三氯硅烷与无水乙醇配置成5%V/V溶液,将冷冻干燥后脱细胞血管浸于此溶液中1 h。随后捞起脱细胞血管,用无水乙醇和超纯水漂洗,然后用无水乙醇冲洗3次。氮气吹干后,在干燥剂存在下置烘箱(60 )一夜,获得拴系全氟化碳(tethered perfluorocarbo
24、n,TP)涂层。将有TP涂层样本浸渍全氟萘烷后获得液态全氟化碳(liquid perfluorocarbons,LP)涂层;在浸涂法平衡时,全氟萘烷的含量为46 mL/cm2,最终获得栓系液态全氟化碳(tethered-liquid perfluorocarbon,TLP)含氟涂层血管。将未氟化处理脱细胞兔主动脉进行冷冻干燥处理与氟化血管进行比较。取冷冻干燥脱细胞兔主动脉和氟化脱细胞兔主动脉,裁剪长宽为 4 mm 的样品。对血管内表面进行SEM 测试,分析处理前后的血管内表面形貌结构;通过EDS定性且定量检测含氟涂层特征基团。确定处理后内膜涂层有效且稳定。1.5血管爆破压力测试取脱细胞组、未脱
25、细胞组和氟化组血管,在腹主动脉末端5 cm处,使用球囊扩张压力泵进行爆破压力测试。用注射器抽取适量的PBS溶液并连接上灌胃针,用5-0的缝线将样品的一端固定于灌胃针上,另一端同样固定,以防止泄漏。缓慢增加压力,直到发生破裂或泄漏。将爆破压记录为结构破坏或泄漏前的最大压力(图2)。1.6氟化血管的疏水性测试氟化血管的疏水性是通过血液在血管内表面的滚动性实验进行模拟来测试的。将5 cm长的氟化脱细胞和脱细胞兔主动脉沿轴向剖开,内表面朝上平整地固定于亚克力玻璃平板上,水平放置。将水滴在血管内表面,观察水滴的状态和维持时间。将平板倾斜45,将水滴滴在血管内表面的上端,观察液体的流动情况并记录流动所需的
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