肺结核患儿外周血单个核细胞miRNA-31、miRNA-146a表达水平检测价值.pdf

作者简介:宋煜,男,主管技师,主要从事临床医学检验和诊断方面的研究.通信作者,E m a i l:q q c o m.网络首发h t t p:/k n s c n k i n e t/k c m s/d e t a i l/R h t m l()论著D O I:/j i s s n 肺结核患儿外周血单个核细胞m i R NA 、m i R NA a表达水平检测价值宋煜,王雅楠,徐於,王聿佳,熊英陕西省康复医院:检验科;儿科,陕西西安 摘要:目的分析肺结核(P T B)患儿外周血单个核细胞(P BMC)m i R NA 、m i R NA a表达水平,以及上述指标与细胞免疫和炎症因子的相关性.方法选取该院 年月至 年月收治的 例P T B患儿作为观察组,另选取同期健康体检儿童 例作为对照组.比较两组P BMCm i R NA 、m i R NA a表达水平,外周血T淋巴细胞亚群、血清炎症因子水平.采用P e a r s o n相关分析P BMCm i R NA 、m i R NA a表达水平与T淋巴细胞亚群、炎症因子的关系.采用受试者工作特征(R O C)曲线分析m i R NA 、m i R NA a联合检测诊断儿童P T B的效能.结果观察组P BMCm i R NA 、m i R NA a表达水平高于对照组,差异有统计学意义(P ).观察组C D、C D、C D/C D 比值低于对照组,而C D 比例高于对照组,差异均有统计学意义(P ).观察组白细胞介素(I L)、I L 、I L 水平均高于对照组,差异均有统计学意义(P ).P e a r s o n相关分析发现,P T B患儿P BMCm i R NA 、m i R NA a表达水平与C D、C D 比例及C D/C D 比值均呈负相关(P ),与C D 比例及I L 、I L 、I L 水平均呈正相关(P ).R O C曲线分析结果显示,P BMCm i R NA 、m i R NA a表达水平联合检测诊断儿童P T B的曲线下面积均大于单项检测,差异均有统计学意义(P ).结论儿童P T BP BMCm i R NA 、m i R NA a均存在异常高表达,与细胞免疫、炎症因子均密切相关.关键词:肺结核;m i R NA ;m i R NA a;细胞免疫;炎症因子中图法分类号:R 文献标志码:A文章编号:()C l i n i c a l v a l u eo f e x p r e s s i o no fm i R N A a n dm i R N A a i np e r i p h e r a l b l o o dm o n o n u c l e a r c e l l so f c h i l d r e nw i t hp u l m o n a r y t u b e r c u l o s i sS ONGY u,WANGY a n a n,XUY u,WANGY u j i a,X I ONGY i n gD e p a r t m e n t o fC l i n i c a lL a b o r a t o r y;D e p a r t m e n t o fP e d i a t r i c s,S h a a n x iR e h a b i l i t a t i o nH o s p i t a l,X i a n,S h a a n x i ,C h i n aA b s t r a c t:O b j e c t i v e T oa n a l y z e t h ee x p r e s s i o nl e v e l so fm i R NA a n dm i R NA a i np e r i p h e r a lb l o o dm o n o n u c l e a r c e l l s(P BMC)o f c h i l d r e nw i t hp u l m o n a r yt u b e r c u l o s i s(P T B),a n dt h ec o r r e l a t i o n sb e t w e e nt h ea b o v e i n d e x e sa n dc e l l u l a r i mm u n i t y,i n f l a mm a t o r yf a c t o r s M e t h o d s At o t a l o f c h i l d r e nw i t hP T Ba d m i t t e dt oS h a a n x iR e h a b i l i t a t i o nH o s p i t a l f r o mF e b r u a r y t oF e b r u a r y w e r es e l e c t e da s t h eo b s e r v a t i o ng r o u p,a n d h e a l t h yc h i l d r e nw h ou n d e r w e n tp h y s i c a l e x a m i n a t i o nd u r i n gt h es a m ep e r i o dw e r es e l e c t e da st h e c o n t r o l g r o u p T h e e x p r e s s i o n l e v e l s o fm i R NA a n dm i R NA a i nP BMC,p e r i p h e r a l b l o o dTl y m p h o c y t es u b s e t sa n ds e r u mi n f l a mm a t o r yf a c t o r sw e r ec o m p a r e db e t w e e nt h et w og r o u p s P e a r s o nc o r r e l a t i o na n a l y s i sw a su s e dt od e t e r m i n et h er e l a t i o n s h i p sb e t w e e nt h ee x p r e s s i o nl e v e l so fm i R NA ,m i R NA a i nP BMCa n dp e r i p h e r a l b l o o dTl y m p h o c y t es u b s e t s,i n f l a mm a t o r y f a c t o r s T h e r e c e i v e ro p e r a t i n gc h a r a c t e r i s t i c(R O C)c u r v ew a su s e d t oa n a l y z e t h e e f f i c a c yo f c o m b i n e dd e t e c t i o no fm i R NA a n dm i R NA a i n t h ed i a g n o s i so fP T Bi nc h i l d r e n R e s u l t s T h ee x p r e s s i o nl e v e l so fP BMCm i R NA a n dm i R NA a i nt h eo b s e r v a t i o ng r o u pw e r eh i g h e r t h a nt h o s e i nt h ec o n t r o lg r o u p,a n dt h ed i f f e r e n c e sw e r es t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n t(P )T h e l e v e l s o fC D p r o p o r t i o n,C D p r o p o r t i o n,C D/C D t a t i o i n t h eo b s e r v a t i o ng r o u pw e r el o w e r t h a n t h o s e i n t h e c o n t r o l g r o u p,w h i l e t h ep r o p o r t i o no fC D w a sh i g h e r t h a n t h a t i n t h e c o n t r o l g r o u p,a n dt h ed i f f e r e n c e sw e r es t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n t(P )T h e l e v e l so f i n t e r l e u k i n(I L),I L a n dI L i nt h eo b s e r v a t i o ng r o u pw e r eh i g h e r t h a n t h o s e i n t h e c o n t r o l g r o u p,a n d t h ed i f f e r e n c e sw e r e s t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n t(P )P e a r s o nc o r r e l a t i o na n a l y s i ss h o w e dt h a tt h ee x p r e s s i o nl e v e l so fm i R NA a n dm i R NA a i nP BMCo f c h i l d r e nw i t hP T Bc o r r e l a t e dn e g a t i v e l yw i t hC D p r o p o r t i o n,C D p r o p o r t i o na n dC D/C D r a t i o(P ),a n dc o r r e l a t e dp o s i t i v e l yw i t hC D p r o p o r t i o n,I L ,I L a n d I L l e v e l s(P )T h er e s u l t so fR O Cc u r v ea n a l y s i ss h o w e dt h a tt h ea r e au n d e rt h ec u r v e(AU C)o fc o m b i n e dd e t e c t i o no f检验医学与临床 年月第 卷第 期L a bM e dC l i n,A u g u s t ,V o l ,N o m i R NA a n dm i R NA a e x p r e s s i o n l e v e l s i nP BMCf o r d i a g n o s i sP T B i nc h i l d r e nw a sg r e a t e r t h a n t h a t o fs i n g l ed e t e c t i o n,t h ed i f f e r e n c e sw e r e s t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n t(P )C o n c l u s i o n T h e e x p r e s s i o n so fm i R NA a n dm i R NA a i nP BMCo f c h i l d r e nw i t hP T Ba r ea b n o r m a l l yh i g h,w h i c hr e l a t e s c l o s e l yt oc e l l u l a ri mm u n i t ya n d i n f l a mm a t o r yf a c t o r s K e yw o r d s:p u l m o n a r y t u b e r c u l o s i s;m i R N A ;m i R N A a;c e l l u l a r i mm u n i t y;i n f l a mm a t o r y f a c t o r肺结核(P T B)是由结核分枝杆菌感染人体肺部引起的一种慢性传染病,病情严重时可导致人死亡,是威胁人类生命健康安全的重大公共卫生问题之一.相关调查数据显示,儿童P T B在所有P T B患者中比例为,且儿童存在不同于成年人的发病特点,包括免疫学发病机制、临床症状及预后转归等.由于儿童P T B临床表现普遍不典型,且目前诊断技术有限,难以实现早期准确诊断,易导致病情延误,不利于患儿预后.因此,寻找一种新型的标志物进行P T B早期诊断成为亟待解决的难题.微小核糖核酸(m i R NA)是近年来发现的一类非编码单链内源性小分子R NA,主要通过与相关碱基配对来调节靶基因或(和)调控蛋白表达,进一步参与疾病的发生、发展过程.目前,国内外已有不少关于m i R NA和P T B的研究 ,但 主 要 集 中 在 成 人P T B中,关 于 儿 童P T B和m i R NA的关系研究鲜见报道.鉴于此,本研究通过分析P T B儿童外周血单个核细胞(P BMC)m i R NA 、m i R NA a表达水平,以及上述指标与免疫细胞和炎症因子的相关性,以期为儿童P T B的诊断 和 治 疗 提 供 新 的 靶 点 和 思 路,现 将 结 果 报 道如下.资料与方法 一般资料选取本院 年月至 年月收治的 例P T B患儿作为观察组,其中男 例,女 例;年龄 岁,平均()岁.另选取本院同期健康体检的 例儿童作为对照组,其中男 例,女 例;年龄 岁,平均()岁.两组年龄、性别比较,差异无统计学意义(P ).纳入标准:()观察组所有患儿均符合 儿童肺结核的临床诊断标准和治疗方案(试行)中的诊断标准,对照组儿童体检各项指标和检查结果均无异常;()年龄 岁;()入组前未接受相关治疗;()临床资料完整.排除标准:()神志异常;()合并重要脏器疾病;()伴有重大感染或免疫性疾病.所有研究对象监护人均知情本研究,并签署知情同意书.本研究经本院医学伦理委员会审核批准.方法()P BMC m i R NA 、m i R NA a表达水平检测:采用无菌肝素抗凝真空采血管采集所有儿童静脉血 m L,以密度梯度离心法分离P BMC.采用T r i z o l法提取标本总R NA,遵循m i R NA反转录试剂盒(购自北京I n v i t r o g e n公司)获取c D NA保存至 冰箱中备用,采用实时荧光定量聚合酶链反应(P C R)检测P BMC m i R NA 、m i R NA a表达水平.m i R NA 引物序列如下:上游引物为 G C C G C AG G C AGAT G C T G ;下游引物为 C AG T G C T G G G T C C GAG T GA .m i R NA a引物序列如 下:上 游 引 物 为 C AT GAT T G T AT GA C T G C A C T C ;下 游 引 物 为 T C T T G C T AG GA C T GA C C A .以U 作为m i R NA内参,上游引物为 AG C GAG C AT C C C C C AAAG T T ;下 游 引 物 为 G G G C A C GAAG G C T C AT C AT T .所有引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成.采用 C t法计算m i R N A 、m i R N A a表达水平.()免疫细胞检测:采用F C M型流式细胞仪(购自常州必达科生物科技有限公司)检测T淋巴细胞亚群,指标包括C D、C D、C D 比例,并计算C D/C D 比值.相关抗体均购自金斯瑞生物科技股份有限公司.()炎症因子检测:抽取所有受试者空腹静脉血m L,离心半径c m,r/m i n离心 m i n获取血清,采用酶联免疫吸附试验检测白细胞介素(I L)、I L 、I L 水平.所有操作均按照试剂盒说明书进行,试剂盒均购自深圳晶美生物科技有限公司.观察指标比较两组P BMC m i R NA 、m i R NA a表达水平,以及T淋巴细胞亚群、炎症因子水平;分析P BMCm i R NA 、m i R NA a表达水平与T淋巴细胞亚群、炎症因子的相关性,评估P BMCm i R NA 、m i R NA a表达水平单独及联合检测诊断儿童P T B的效能.统计学处理采用S P S S 统计软件进行数据处理及统计分析.符合正态分布 的计量资料 以xs表示,两组间比较采用t检验;计数资料以例数或百分率表示,两组间比较采用检验;采用P e a r s o n相关分析P BMC m i R NA 、m i R NA a表达水平与T淋巴细胞亚群、炎症因子的相关关系;采用受试者工作特征(R O C)曲线分析m i R NA 、m i R NA a联合检测诊断儿童P T B的效能.以P 为差异有统计学意义.结果 两组P BMCm i R NA 、m i R NA a表达水平比较与 对 照 组 比 较,观 察 组P BMC m i R NA 、m i R NA a表达水平均升高,差异有统计学意义(P ).见表.表两组P BMCm i R NA 、m i R NA a表达水平比较(xs)组别nm i R NA m i R NA a观察组 对照组 t P 检验医学与临床 年月第 卷第 期L a bM e dC l i n,A u g u s t ,V o l ,N o 两组T淋巴细胞亚群水平比较与对照组比较,观察组C D 比例、C D 比例、C D/C D 比值均降低,而C D 比例升高,差异有统计学意义(P ).见表.表两组T淋巴细胞亚群水平比较(xs)组别nC D 比例()C D 比例()C D 比例()C D/C D 比值观察组 对照组 t P 两组炎症因子水平比较与对照组比较,观察组I L 、I L 及I L 水平均升高,差异有统计学意义(P ).见表.P T B患儿P BMC m i R NA 、m i R NA a表达水平与T淋巴细胞亚群、炎症因子水平的相关性分析P e a r s o n相关分析发现,P T B患儿P BMC m i R NA 、m i R NA a表达水平与C D、C D 比例及C D/C D 比值均呈负相关(P ),与C D 比例及I L 、I L 、I L 水平均呈正相关(P ).见表.表两组炎症因子水平比较(xs,n g/L)组别nI L I L I L 观察组 对照组 t P 表P T B患儿P BMCm i R NA 、m i R NA a表达水平与T淋巴细胞亚群、炎症因子的相关性分析指标m i R NA rPm i R NA arPC D 比例 C D 比例 C D 比例 C D/C D 比值 I L I L I L P T B患儿P BMC m i R NA 、m i R NA a表达水平检测诊断儿童P T B的效能R O C曲线分析结果显示,P BMCm i R NA 、m i R NA a表达水平联合检测诊断儿童P T B的曲线下面积(AU C)均大于单项检测,差异均有统计学意义(P ).见表、图.表P BMCm i R NA 、m i R NA a表达水平检测诊断儿童P T B的效能指标AU C灵敏度()特异度()Y o u d e n指数c u t o f f值 C Im i R NA m i R NA a 联合检测 注:表示无数据.图P BMCm i R NA 、m i R NA a表达水平检测诊断儿童P T B的R O C曲线讨论结核病为常见的慢性传染病之一,伴随着病情的日益进展,可累及多个器官,且以P T B最多见,患者往往存在严重的肺组织损伤,进而导致肺功能降低,严重威胁健康及生命 .因此,早期实现有效诊断与及时治疗P T B是国内外研究的热点.m i R NA不但扮演细胞内基因调控网络关键分子的角色,亦是多种病理状态下的重要生物标志物.近年来,已有不少研究报道证实,血液循环中的多种m i R NA均可作为肺癌及肺炎等疾病的生物标志物 .血清中P B MC或P BMC中的m i R NA检测为疾病诊断、疗效评估及个性化治疗均提供了操作简便的无创性检测手段.因此,本研究通过分析儿童P T BP BMCm i R NA 、m i R NA a表达水平,以及上述指标与T淋巴细胞亚群和炎症因子的相关性,对儿童P T B的诊断价值,旨在为上述两项指标作为儿童P T B的临床诊断标志物提供理论依据.本研 究 结 果 表 明,观 察 组P BMC m i R NA 、m i R NA a表达水平明显高于对照组,这提示儿童P T BP BMC m i R NA 、m i R NA a均存在异常高表达.可能是由于m i R NA 主要介导J a n u s激酶/信号与转录激活子(J AK/S T AT)及丝裂原激活的蛋白激酶(MA P K)等多种结核感染有关信号通路,并通检验医学与临床 年月第 卷第 期L a bM e dC l i n,A u g u s t ,V o l ,N o 过对上述相关信号通路活性的调控,进一步抑制机体的免 疫 应 答,最 终 引 发 结 核 分 枝 杆 菌 的 感 染.m i R NA a高表达会提升巨噬细胞对细胞内结核分枝杆菌的灭杀能力,进而抑制该致病菌的生长、繁殖,是机体应对结核分枝杆菌感染时的自然应答.R O C曲线分析结果显示,P BMCm i R NA 、m i R NA a表达水平联合检测诊断儿童P T B的AU C均高于单项检测,差异均有统计学意义(P ),提示临床工作中可通过对上述两项指标表达水平进行联合检测实现对儿童P T B的辅助诊断.此外,与对照组比较,观察组C D、C D 比例及C D/C D 比值均降低,而C D 比 例 升 高,差 异 均 有 统 计 学 意 义(P ),提示结核免疫属于细胞免疫,主要是由单核巨噬 细 胞 介 导 的 复 杂 免 疫 应 答 过 程,而C D、C D、C D 比例及C D/C D 比值均是细胞免疫的重要指标.而P T B的发生会对患儿肺组织产生一定的损伤,进而影响免疫应答,最终导致上述指标的异常表达.另外,与对照组比较,观察组I L 、I L 及I L 水平均升高,差异有统计学意义(P ),提示I L 、I L 及I L 均是临床上应用较为广泛的炎症因子,在机体出现创伤、感染等状况时,其在血清中水平急剧升高,可能对儿童P T B具有一定的辅助诊断作用.P T B患儿因肺组织遭受不同程度的损伤,进而导致上述指标出现应激性升高,并参与疾病的进展过程.此外,P e a r s o n相关分析发现,P T B患儿P BMCm i R NA 、m i R NA a表达水平与C D、C D 比例及C D/C D 比值水平均呈负相关(P ),与C D、I L 、I L 、I L 水 平 均 呈 正 相 关(P ).说明m i R NA 、m i R NA a可能是通过靶向调控MA P K及J AK/S T AT等信号通路,从而发挥炎症免疫调控作用,进而参与P T B的发生、发展.综上 所 述,儿 童P T B P BMC m i R NA 、m i R NA a均存在明显高表达,且与细胞免疫、炎症因子均密切相关,可作为辅助诊断P T B的潜在生物学标志物,值得临床重点关注.参考文献 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C C ON E M,C O S E N Z A G,P AU C I U L L O A,e ta l M i l km i c r o R NA aa sap o t e n t i a lb i o m a r k e r i nb o v i n e t u b e r c u l o s i sJ JD a i r yR e s,():谢锦慧,喻容,石国民,等初治肺结核肠道菌群改变与免疫指标的相关性研究J中华预防医学杂志,():李华,许婉华,龚兰,等血清中相关细胞因子表达水平变化对肺结核治疗效果的评估J实用医学杂志,():(收稿日期:修回日期:)检验医学与临床 年月第 卷第 期L a bM e dC l i n,A u g u s t ,V o l ,N o