环境生物学公开课一等奖优质课大赛微课获奖课件.pptx

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第三章 污染物生物效应检测,本章将讨论下列内容：,生物测试及方式,普通毒性试验,生物分子和细胞水平检测,生物致突变、致畸和致癌效应检测,微宇宙法,第1页,第1页,第一节 生物测试及方式,一、生物测试（,Bioassay,）概念：,指系统地利用,生物反应,测定一个或各种污染物或环境原因单独或联合存在时所造成影响或危害。,注释,1,：所利用生物反应包括分子、细胞、组织、器官、个体、种群、群落、生态系统各级水平上反应,注释,2,：生物测试与物理化学测试比较,第2页,第2页,注释2：生物测试与物理化学测试不同之处？,生物测试不同于常规物理、化学检测。前者能够测定污染物对生物机体影响，而后者只能测定污染物浓度。,比如：经过水污染生物测试可取得以下数据：,各种环境原因如DO、pH、温度、混浊度等对生命有利以及不利浓度或强度；,污染物对受测生物毒性；,各种水生生物对污染物相对敏感性；,废水所应处理程度；,允许污染物排放浓度等。,第3页,第3页,二、生物测试方式,依据生物测试所经历时间长短：,短期生物测试,/,中期生物测试,/,长期生物测试,依据试验溶液或试验气体予以方式：,静止式生物测试,/,流动式生物测试,依据生物测试中所用测试生物物种：,单物种生物测试、多物种生物测试和模拟生态系统生物测试,依据生物测试中所测试生物效应性质：,毒性试验、积累试验、行为试验、“三致”（致癌、致畸、致突变）试验、损伤试验等等。,。,第4页,第4页,短期生物测试（Short Term Bioassays）,被试生物在短时间内暴露于高浓度污染物下，测定污染物对生物机体影响。主要用于测定LC50、IC50、EC50,用来快速预计污染物毒性；评定几个不同毒物或废物对某种生物相对毒性；指示出中期或长久试验所应使用毒物浓度。,多数采取静止式。,中期生物测试（Intermediate Term Bioassays）,时间为8d到90d，多数情况下为流动式。,第5页,第5页,长期生物测试,（,Long Term Bioassays,）,包括所有生活史生物测试（,Complete Life,cycle Bioassays,）和部分生活史生物测试（,Partial Life,cycle Bioassays,）,目的是要测定出在连续情况下不造成有害效应毒物最大浓度或最大允许毒物浓度（,MATC,）,只能采用流动式,第6页,第6页,受试生物选择,敏感性,广泛性和可取得性,有代表性，是生态系统主要构成,易于试验室培养和繁殖,含有丰富生物背景资料,对毒物响应能够被反应和测定,等等,第7页,第7页,影响生物测试结果原因,受试生物,试验条件：要确保试验环境条件（pH、硬度、温度等）和自然界季节改变相符合。,不同试验室：人员操作水平、仪器设备差异,生物测试标准化,第8页,第8页,第二节 普通毒性试验,一、生物毒性基本概念,毒物（,Toxicant,）,一定条件下，可引起不良生物反应外来化学物质。,毒物与非毒物之间不存在绝正确界线，通常一个物质只有达到中毒,剂量,时才是毒物。,中毒（,Intoxication,）,生物体受到毒物作用引起功效或器质性改变后出现疾病状态。,中毒是各种毒性作用综合表现，包括急性中毒、亚急性中毒、慢性中毒。,第9页,第9页,毒性（,Toxicity,）,指一个物质引起机体损伤能力。,毒性作用或毒效应（,Toxic Effect,）,化学物引起生物体损害总称,无损害作用（,Non-adverse Effect,）,可逆生物学改变，不引起机体形态、生长发育和寿命改变；不引起机体功效容量减少和对额外应激状态代偿能力损害等。,第10页,第10页,效应（,Effect,）,也称为作用，指接触一定剂量化学物后，使机体产生生物学改变。,效应是对个体而言，这种改变可用一定计量单位表示。,反应（,Response,）,指接触一定剂量化学物后，产生某种效应并达到一定强度个体在群体中所占百分比。,反应是对群体而言，用百分率或比值来表示，如发病率、死亡率等。,第11页,第11页,剂量效应关系（Dose-effect Relationship）,剂量反应关系（Dose-response Relationship）,分别表示不同剂量在个体或群体中表现出来量效应大小之间关系，以及不同剂量与质效应发生率之间关系。,以剂量为横坐标，以表示效应强度计算单位或表示反应百分率或比值为纵坐标绘制散点图所得到曲线，即为剂量效应关系和剂量反应关系曲线。,不同化学物或同一化学物在不同条件下，其剂量与效应或反应相关关系不同，可展现不同类型曲线。（见图31，32，33，34）,第12页,第12页,剂量效应关系和剂量反应关系曲线图,剂量,100,50,反应强度（）,图,3,1,剂量反应曲线（直线型）,剂量,100,50,死亡率（）,图,3,2,剂量反应曲线（抛物线型）,对数剂量,100,50,死亡率（）,图,3,3,剂量反应曲线（,S,形线型）,死亡率（概率单位）,对数剂量,100,50,图,3,4,剂量反应曲线,第13页,第13页,危害性（,Hazard,）,:,有毒物质在与机体接触或使用过程中，引起中毒也许性。,与风险（,Risk,）相近,危险性：,化学物质在正常生产使用条件下，能引起机体发生中毒也许性。,偏重物质本身性质。,第14页,第14页,二、毒性试验惯用参数,致死剂量或致死浓度（,Lethal Dose/LD,，,Lethal Concentration/LC,）,表示一次染毒后，在一定期间内引起受试动物死亡剂量或浓度。,绝对致死剂量或浓度（,LD,100,、,LC,100,）,半数致死剂量或浓度（,LD,50,、,LC,50,）,最小致死剂量或浓度（,MLD,、,MLC,）,最大耐受剂量或浓度（,LD,0,、,LC,0,）,第15页,第15页,最大无作用剂量（,Maximum No-Effect Level,MNEL,）,指化学物在一定期间内，按一定方式与机体接触，按一定检测办法或观测指标，不能观测到任何损害作用最高剂量。,随试验办法改进而改变,每日允许摄入量（,Acceptable Daily Intake,，,ADI,）,最高允许浓度（,Maximum Allowable Concentration,，,MAC,）,最小有作用剂量（,MEL,）,/,中毒阈剂量（,TL,）,第16页,第16页,毒作用带（,Toxic Effect Zone,）,一个依据毒性和毒性作用特点综合评价外来物危险性指标。是对,LD,50,补充。,急性毒性作用带（,Acute,toxic Effect Zone,）,慢性毒性作用带（,Chronic,toxic Effect Zone,）,第17页,第17页,半效应浓度（,EC,50,）,在一定期间内，引起,50%,受试生物某种效应改变浓度。,只有同种效应才干比较。,半数克制浓度（,IC,50,）,是指能引起受试受试生物,50%,克制浓度,惯用于对生长速率和活性克制。,第18页,第18页,毒物单位与分级：,mg/L,mg/kg,mg/m3,分级：按急性毒性，人为分级。与染毒方式相关。,第19页,第19页,第20页,第20页,三、急性毒性试验（,Acute Toxicity Test,）,急性毒性试验（Acute Toxicity Test）,研究化学物质大剂量一次染毒或二十四小时内多次染毒动物所引起毒性试验。,其目的是短期内理解该物质毒性大小和特点，并为进一步开展其他毒性试验提供设计依据。,急性毒性试验类型,哺乳动物急性毒性试验,水生生物急性毒性试验,蚯蚓急性毒性试验,第21页,第21页,急性毒性试验过程（啮齿类）,1,、按试验要求选择受试生物,惯用成年大鼠或小鼠，雌雄动物同时试验，对试验动物预先观测几天后标识编号并随机分组。,2,、预备试验和拟定剂量组,选取少许动物进行预备试验，求出引起动物,90,（或所有）死亡剂量（即最高剂量组剂量）和引起动物,10,死亡（或不死亡）剂量（即最低剂量组剂量）。,在最高剂量组剂量和最低剂量组剂量范围内，按等比级数插入若干个中间剂量（普通为,4-6,个），从而拟定正式试验剂量组。,第22页,第22页,3,、染毒方式和受试物配制,普通用灌胃法和人工熏气法。,受试物配制：配制试验所需最高剂量浓度溶液，然后依次稀释到所需浓度。,4,、观测指标,中毒症状：普通观测,24,48,小时，最好观测到绝大多数动物出现典型中毒症状。,动物死亡数目和死亡时间,病理检查：对于试验时马上死亡动物，可解剖，分析死亡原因，看是技术事故还是中毒引起死亡。,第23页,第23页,5、确定半数致死量（LD50）,6、试验结果,LD50值越小，毒性越大。,急性毒性试验结果只能粗略地表示某化学物质毒性，而不能全方面反应其毒性。,因为动物种属、性别、染毒方式不同，所表现毒性也不一致，故表示LD50应注释明动物种类和染毒方式。,第24页,第24页,鱼类急性毒性试验过程,选择适当鱼类,拟定养殖条件,水质、水量、,pH,、温度、溶氧量等,蚯蚓急性毒性试验过程,主要评价土壤中残留农药毒性,普通采用,试纸法,（蚯蚓与浸润在试纸上有害物接触）与,人工土壤法,（将一定浓度有害物置于人工土壤中）,第25页,第25页,四、亚慢性毒性试验和慢性毒性试验,亚慢性毒性试验,在生物生命周期1/201/30时间内,使生物天天或重复多次接触受试物毒性试验，以确定最大毒物效应剂量和效应时间。,采取剂量是LD501/801/50，给药路径尽也许模仿人类在环境中实际接触方法。,观测指标主要有：,（a）表观指标，如生长情况、活动能力、死亡等,（b）血液与生化指标，如血细胞、肝功效等,（c）病理组织学检验，如肝、肺肾等有否病变等,第26页,第26页,第27页,第27页,慢性试验,目的是最后拟定最大无作用剂量，为制定,人体每日允许摄入量,和,最高允许浓度,提供毒理学依据。,试验环节下列：,选择与拟定试验动物；,试验浓度为亚慢性试验中最低中毒浓度1/101/50;,给药办法同亚慢性，试验周期约数个月至两年,（基本覆盖受试动物整个生命周期）；,观测指标同亚慢性。,第28页,第28页,五、蓄积毒性试验,低于中毒阈剂量外来化合物，重复多次地与机体连续接触，经一定期间后使机体出现明显中毒表现，即为,蓄积毒性作用,是由于外来化合物进入机体速度不小于有机体消除速度，而使外来化合物在体内量不断累积，达到了使机体引起毒性作用阈剂量所致。,是引起亚慢性和慢性毒性作用基础。,是评估环境污染毒性作用惯用指标之一，也是制定其在环境中卫生原则主要参考依据。,第29页,第29页,蓄积系数法,（,Cumulative Coefficient Method,）,是分次给受试物后引起,50%,受试动物出现某种毒效应总剂量，与一次给受试物后引起,50%,受试动物出现同一毒效应剂量比值,蓄积系数,K,（比值愈小，表示蓄积作用愈强）,第30页,第30页,第31页,第31页,生物半减期,生物半减期（,T,1/2,）是指一个外来化合物在体内消除到原有浓度（或量）二分之一所需要时间。,生物半减期越长物质，表示越不易由体内消除，其蓄积作用也许性就越大。,T,1/2,=,第32页,第32页,动物细胞模型法,采用,动物细胞,（如：非洲绿猴肾细胞）作为试验受体，通过细胞培养，观测含外源化学物质培养基中细胞生长情况（与对照相比较），从而拟定化学物对细胞生长产生毒效应；,测试时间普通只需48,h，,并且重复性好、成本低、可较直接反应对人体影响。,细胞水平检测：,第三节 生物分子和细胞水平检测,第33页,第33页,分子水平检测,1,：,加合物测定,DNA,加合物测定,蛋白加合物测定,eg,：,Hb,加合物,第34页,第34页,分子水平检测,2,：,酶活性测定办法：,直接法：,指直接测定体液中酶含量，该法技术要求较高；,间接法：,通过测定酶反应中底物减少或产物增长量来拟定酶活性，该办法当前使用广泛，但要求反应专一性较高，反应结果与过程以便观测。,第35页,第35页,酶活性测定,普通代谢酶,活性测定,乙酰胆碱酯酶,腺三磷酶,解毒系统酶类,诱导作用检测,混合功效氧化酶诱导作用,谷胱甘肽硫转移酶,抗氧化防御系统,检测,过氧化氢酶,谷胱甘肽过氧化酶,第36页,第36页,第四节 生物致突变、致畸和致癌效应检测,基本概念,突变（,Mutation,）：,生物体遗传物质发生了基因结构改变。,基因突变（,Gene Mutation,）和染色体畸变（,Chromosome Mutation,）,基 因 突 变：只涉及染色体某一部分改变，不能用光学显微镜直接观测,染色体畸变：染色体数目或结构发生改变，可用光学直接观测,一、致突变试验,第37页,第37页,致突变作用（,Mutagenesis,）和致突变物（,Mutagen,）,致突变作用：一些物质引起生物体遗传物质发生基因结构改变作用,致 突 变 物：含有引起生物体遗传物质发生基因结构改变物质,第38页,第38页,致突变试验目的,拟定某种外来化合物（或环境污染物）对生物体是否含有致突变作用。,致突变试验办法,基因突变试验,比如,Ames,试验,、哺乳动物体细胞突变株试验,染色体畸变试验,DNA,损伤试验,第39页,第39页,Ames,试验,（沙门氏菌回复突变试验）,Ames,试验,原理,利用一个,营养缺点型突变型菌株,与受试物接触，若此化学物质含有,致突变性,，可使突变型微生物再发生,回复突变,，重新成为,野生型微生物,。,注释,1,：,营养缺点型突变型菌株：,不具合成组氨酸能力，不能在低营养培养基上生长,注释,2,：,野生型微生物：,第40页,第40页,鼠伤寒沙门氏菌,/,哺乳动物微粒体酶试验法,一些化学物质需经代谢活化才有致变作用，在测试系统中加入哺乳动物微粒体酶，从而填补体外试验缺乏代谢活化系统之不足。,办法：在动物体外将待测物经肝微粒体酶系活化后，检测其所诱发沙门氏菌回变菌落数。,突变率诱发回复突变菌落数,/,自发回复突变菌落数（对照）,当突变率不小于,2.0,时，为阳性结果。,第41页,第41页,Ames,试验应用,检测,食品添加剂、化妆品,等致突变性，由此推测其致癌性；,检测,水源水和饮用水,致突变性，摸索较现行办法愈加卫生安全消毒办法；,检测,都市污水和工业废水,致突变性，结合化学分析，追踪污染源，为研究防治对策提供依据；,检测,土壤、污泥、工业废渣堆肥、废物灰烬,致突变性，以预防维系生命土壤受致突变物污染后，通过农作物危害人类；,检测,气态污染物,致突变性，预防污染物经由大气，通过呼吸对人体发生潜在危害；,研究,化合物结构与致变性关系,，为合成对环境无潜在危害新化合物提供理论依据；,尚有用,Ames,试验,筛选抗突变物,，研究开发新抗癌药,。,第42页,第42页,原理：某种动物,体细胞突变株,缺乏利用嘌呤碱酶,，因此,不能利用一些嘌呤碱类似物,，但正常细胞能够利用。当培养液中存在有一些不常见嘌呤碱类似物时，正常细胞能够将这些嘌呤类似物结合进,DNA,中，从而影响细胞生长。但突变型细胞不受影响。,一旦突变型细胞和某种化学物接触后又变为对这些嘌呤碱敏感野生型,，就阐明这种化学物含有致突变性,哺乳动物体细胞突变株试验,第43页,第43页,体外培养法：,动物细胞（如淋巴细胞等）在一定培养液中37,o,C,培养13天，培养过程中与受试物同时接触。在细胞收获前加入秋水仙碱使细胞分裂停止于分裂中期（该期细胞较易观测胞内染色体结构），然后经一定预处理，在显微镜下观测染色体数目和结构等（如断裂、缺失、环状等）。,体内试验法：,也采用灌胃或腹腔注射方式使受试物进入动物体内（如小鼠等），饲养数个月，在处死前注入秋水仙碱，抽取骨髓细胞经预处理后显微观测。,显微镜检测染色体畸变,第44页,第44页,微核试验,微核,是染色单体或染色体,无着丝点断片,或因纺锤体受伤而失去,整个染色体,，在分裂后期，仍留在细胞质中，或因核膜受损后,核物质向外突出延伸,形成，形成一个或几种规则圆形或椭圆形小体，其嗜染性与细胞核相同，比主核小，故称微核。,蚕豆根尖微核试验,第45页,第45页,第46页,第46页,二、,致畸效应,概念,畸形（,Malformation,）、畸胎（,Terate,）,畸形：胚胎在发育过程中，由于受到某种原因影响，使胚胎细胞分化和器官形成不能正常进行，而造成器官组织上缺点，并出现,肉眼可见形态结构异常,畸胎：有畸形胚胎或胎仔称为畸胎（广义畸胎还包括生化、生理功效及行为发育缺点）,致畸作用（,Teratogenesis,）、致畸物（,Teratogen,）,致畸物通过母体作用于胚胎而引起胎儿畸形现象称为致畸作用。,第47页,第47页,“反应停”致畸,第48页,第48页,致畸作用毒理学特点,不同发育阶段敏感性不同,不同发育阶段畸形不同,种属差异显著,致畸作用带较窄,第49页,第49页,化学致畸作用机理,突变引起胚胎发育异常；,对细胞生长分化较为主要酶类受到克制；,母体正常代谢过程被破坏；,细胞分裂过程障碍,第50页,第50页,致畸试验,目的：检测环境污染物能否通过妊娠母体引起胚胎畸形。,普通过程为选择适当受试动物，受孕后予以一定剂量化学物（如灌胃等），在自然预产期前12天解剖检查胎儿是否发生畸形。,普通试验动物要求其对化学物质代谢过程与人相同，胎盘结构也相同，还要求孕期短，产仔多，经济实用，如,大鼠,、家兔、小鼠等。,第51页,第51页,致畸作用评价,注意与自然变异区别；,注意种属差别；,注意试验阈剂量与人类实际也许摄入量之间差别。,第52页,第52页,三、致癌效应,概念,癌：细胞自主生长，不断分裂形成危害机体肿块（恶性肿瘤）。,化学致癌作用（,Chemical Carcinogenesis,）,指化学物质（包括有机、无机、天然和合成化学物质）引起肿瘤过程。,化学致癌物（,Chemical Carcinogen,）,指能诱发肿瘤化学物质。,致癌原因：化学,物理：射线,生物：病毒,第53页,第53页,细胞癌变学说,体细胞突变学说,癌变形成基础是体细胞发生了突变，造成其功效发生异常。,分化障碍学说,细胞癌变不一定需要体细胞遗传物质发生突变，而只是细胞分化过程中相关基因调控过程受到致癌原因干扰，使细胞分化和增殖发生紊乱而出现癌变。,第54页,第54页,癌变过程,引起阶段,正常细胞转化为癌细胞过程。,促长阶段,促长是通过引起癌细胞不断增殖直至形成一个临床上可被检出之肿块过程，是癌增殖阶段。增进过程需要较长时间，普通为可逆过程。,浸润和转移阶段,浸润：癌细胞分泌毒素，侵蚀和破坏体内各种组织和器官。,转移：癌细胞从初生肿瘤中离散，随血液循环向全身扩散。,第55页,第55页,致癌试验,目的：检查受试物及其代谢产物是否含有致癌效应或诱发肿瘤作用慢性毒性试验法。,试验办法（,p130,）,短期筛检办法,85以上癌症都是由致突变作用造成,利用已建立各种致突变试验办法快速筛检外来化合物是否含有致癌作用,长期动物诱癌试验,过程,：选择受试动物类型与数量；拟定剂量与给药方式；观测结果（包括肿瘤发生情况，发生率，潜伏期）最后拟定结果等。,第56页,第56页,第五节 微宇宙法,微宇宙（,Microcosm,）,是研究污染物在生物种群、群落、生态系统和生物圈水平上生物效应一个办法，又称模型生态系统法（,Model Ecosystem,）,可分为,自然微宇宙,和,人工微宇宙,或,也可分为,水生微宇宙,和,陆生微宇宙,。,第57页,第57页,原则化水生微宇宙,（,Standardized Aquatic Microcosm,，,SAM,）,用于在试验室测定有毒物质在多物种水平对淡水生态系统影响。,试验时间,64,天，容器为,4L,玻璃广口瓶,试验生物包括,10,种藻、,4,种无脊椎动物、,1,种细菌。,对温度、光照强度、,pH,值等理化参数都有详细要求。,第58页,第58页,烧杯水生微宇宙（Mixed Flask Culture，MFC）,又称烧杯混合培养，试验时间1214周，容器为1L玻璃广口瓶，试验生物包含4种藻、2种无脊椎动物、一些细菌和原生动物。对温度、光照强度、pH值等理化参数都有详细要求。,与SAM不同是经过加入来自生态系统浸出液提供应微宇宙中生物群落所需基质。,第59页,第59页,室外水生微宇宙（,Outdoor Aquatic Microcosm,）,又称中宇宙,Mesocosm,试验单元,6 m,3,，,试验生物包括浮游植物、浮游动物、鱼类、大型水生植物和无脊椎动物。,第60页,第60页,土壤关键微宇宙（Soil Core Microcosm，SCM）,该法采取野外环境土壤关键，将其设置在环境条件控制试验室中,试验生物因土壤关键采集场合不同而不同，可研究化学物质和营养元素对农业生态环境影响及其环境归趋。,第61页,第61页,第62页,第62页,模拟海水（,6ppt,）,25cm,10cm,试验体系结构示意图,土壤样品采集,9月收割,9月收割,植物生物量收割：,第63页,第63页,模拟农田生态系统,该系统模拟农田条件，无陆生动物。,纳什农业生态系统：为同时测定农药在土壤、植物、水溶液和空气中残留而设计，采用,0.75 m,3,矩形玻璃室，可打入足够数量空气，通过玻璃室模拟微风并能搜集挥发农药。,第64页,第64页,