高效液相色谱法同时测定镇咳口服液中盐酸去氧肾上腺素、马来酸氯苯那敏、氢溴酸右美沙芬.pdf

第 32 卷，第7 期2023 年7 月化学分析计量CHEMICAL ANALYSIS AND METERAGEVol.32,No.7Jul.2023高效液相色谱法同时测定镇咳口服液中盐酸去氧肾上腺素、马来酸氯苯那敏、氢溴酸右美沙芬李鑫，代民言，宁星，苗利，王明志（哈尔滨商业大学药学院，哈尔滨150010）摘要建立同时测定镇咳口服液中盐酸去氧肾上腺素、马来酸氯苯那敏、氢溴酸右美沙芬含量的高效液相色谱方法。采用ACE Excel super C18色谱柱（250 mm4.6 mm，5 m）为分离柱，流动相A为磷酸二氢钾与辛烷磺酸钠缓冲盐-甲醇溶液（体积比为92 8），流动相B为磷酸二氢钾与辛烷磺酸钠缓冲盐-甲醇溶液（体积比为12 88），梯度洗脱，流量为1.0 mL/min，检测波长为220 nm，柱温为35，进样体积为10 L。盐酸去氧肾上腺素、马来酸氯苯那敏、氢溴酸右美沙芬质量浓度分别在38.87664.793、16.25624.384、76.723127.872 g/mL范围内与对应色谱峰面积线性相关，相关系数分别为0.999 9、0.999 7、0.999 8。样品中3种成分含量测定结果的相对标准偏差为0.28%0.42%（n=6），加标回收率为98.65%99.65%。该方法操作简便、稳定，具有可再现性，可用于镇咳口服液中盐酸去氧肾上腺素、马来酸氯苯那敏、氢溴酸右美沙芬含量的同时测定。关键词盐酸去氧肾上腺素；马来酸氯苯那敏；氢溴酸右美沙芬；镇咳口服液；高效液相色谱法中图分类号：O657.7 文献标识码：A 文章编号：1008-6145(2023)07-0070-04Simultaneous determination of phenylephrine hydrochloride,chlorpheniramine maleate and dextromethorphan hydrobromide in Zhenke oral liquid by HPLCLI Xin,DAI Minyan,NING Xing,MIAO Li,WANG Mingzhi(College of Pharmacy,Harbin University of Commerce,Harbin150010,China)Abstract A method was established for the simultaneous determination of phenylephrine hydrochloride,chlorpheniramine maleate,dextromethorphan hydrobromide in Zhenke oral liquid by high performance liquid chromatography(HPLC).ACE Excel super C18 column(250 mm4.6 mm,5 m)was used as separation column,mobile phase A was potassium dihydrogen phosphate and sodium octane sulfonate-methanol(volume ratio was 92/8),mobile phase B was potassium dihydrogen phosphate and sodium octane sulfonate-methanol(volume ratio was 12/88),gradient elution was performed,the flow rate was 1.0 mL/min,the detection wavelength was 220 nm,the column temperature was 35,and the injection volume was 10 L.Within the mass concentration of 38.876-64.793 g/mL for phenylephrine hydrochloride,16.256-24.384 g/mL for chlorpheniramine maleate and 76.723-127.872 g/mL for dextromethorphan hydrobromide,there was a linear correlation between the chromatographic peak area and the mass concentration with the correlation coefficient of 0.999 9,0.999 7 and 0.999 8,respectively.The relative standard deviation of the detection results of above three components was 0.28%-0.42%(n=6),respectively.The recovery rate was 98.65%-99.65%.The method is simple,stable and reproducible,and it can be used for the simultaneous determination of phenylephrine hydrochloride,chlorpheniramine maleate and dextromethorphan hydrobromide in Zhenke oral liquid.Keywords phenylephrine hydrochloride;chlorpheniramine maleate;dextromethorphan hydrobromide;Zhenke oral liquid;high performance liquid chromatographydoi:10.3969/j.issn.1008-6145.2023.07.015通信作者李鑫，硕士，副教授，从事中药学研究收稿日期20230605引用格式李鑫，代民言，宁星，等.高效液相色谱法同时测定镇咳口服液中盐酸去氧肾上腺素、马来酸氯苯那敏、氢溴酸右美沙芬 J.化学分析计量，2023，32（7）：70.LI Xin,DAI Minyan,NING Xing,et al.Simultaneous determination of phenylephrine hydrochloride,chlorpheniramine maleate and dextromethorphan hydrobromide in Zhenke oral liquid by HPLCJ.Chemical Analysis and Meterage,2023,32(7):70.70李鑫，等：高效液相色谱法法同时测定镇咳口服液中盐酸去氧肾上腺素马来酸氯苯那敏、氢溴酸右美沙芬盐酸去氧肾上腺素可缓解感冒、减轻鼻炎导致的鼻塞1-3；马来酸氯苯那敏用于治疗过敏性鼻炎、打喷嚏等感冒症状4-6；氢溴酸右美沙芬对于延髓中枢产生的咳嗽有一定抑制作用，且没有成瘾性7-11。镇咳口服液是由上述3种成分复配制成，不仅可以治疗感冒、冷空气过敏、支气管炎等疾病引起的儿童咳嗽及鼻塞的症状，同时可以减少马来酸氯苯那敏单独使用时口渴、多尿、咽喉疼痛等的不良反应，提高儿童用药的安全性和顺应性。现有报道中只有采用高效液相法测定盐酸去氧肾上腺素、马来酸氯苯那敏、氢溴酸右美沙芬单一主成分或两种主成分的方法12-15，尚无同时测定3种成分含量的方法，若使用上述方法分别对镇咳口服液中3种成分进行含量测定，则操作繁琐，效率低下。笔者建立了同一色谱条件下同时测定镇咳口服液中三种主药成分含量的方法，该方法操作简便、快速，专属性强，准确度高，重复性好。1实验部分1.1主要仪器与试剂高效液相色谱仪：LC20A型，日本岛津仪器有限公司。电子天平：ALC-110.4型，感量为0.1 mg，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。盐酸去氧肾上腺素标准品：质量分数为99.2%，中国食品药品检定研究院。马来酸氯苯那敏标准品：质量分数为99.7%，中国食品药品检定研究院。氢溴酸右美沙芬标准品：质量分数为94.8%，中国食品药品检定研究院。辛烷磺酸钠、甲醇：均为色谱纯，天津益仁达化学试剂厂。磷酸二氢钠：色谱纯，天津市恒兴化学试剂制造有限公司。镇咳口服液样品：批号 20190701、20190702、20190703，自制。缓冲盐溶液：称取磷酸二氢钾1.25 g，辛烷磺酸钠2.5 g，置于1 000 mL容量瓶中，加水定容至标线，pH值为3.0。实验用水为超纯水。1.2仪器工作条件色谱柱：ACE Excel super C18柱(250 mm4.6 mm,5 m,英国ACE公司)；柱温：35；进样体积：10 L；检测波长：220 nm；流动相：A为缓冲盐溶液-甲醇（体积比为92 8），B为缓冲盐溶液-甲醇（体积比为12 88），流量为1.0 mL/min；洗脱方式：梯度洗脱，08 min，90%45%A；814 min，45%32%A；1420 min，32%56%A；2021min，56%90%A。1.3溶液配制混合标准品溶液：盐酸去氧肾上腺素、马来酸氯苯那敏、氢溴酸右美沙芬质量浓度分别为0.2、0.08、0.4 mg/mL。精密称取马来酸氯苯那敏标准品 10 mg于10 mL容量瓶中，用流动相A定容至标线，得到马来酸氯苯那敏储备液；称取盐酸去氧肾上腺素标准品10 mg、氢溴酸右美沙芬标准品20 mg，精密称定，加入流动相A溶解并转移至50 mL容量瓶中，再加入4 mL马来酸氯苯那敏储备液，用流动相A定容至标线。混合标准工作溶液：分别吸取混合标准品溶液 2、2.25、2.5、2.75、3 mL于10 mL容量瓶中，用流动相A定容至标线，分别得到对应于镇咳口服液处方含量的80%、90%、100%、110%、120%线性样品浓度。样品溶液：用移液管吸1 mL镇咳口服液于10 mL 容量瓶中，用流动相 A 定容至 10 mL，以 3 500 r/min转速离心5 min，取上清液，用0.22 m滤膜过滤，取续滤液作为样品溶液。阴性样品溶液：参照镇咳口服液配方比例和制备工艺，制备不添加3种主成分的阴性样品。1.4实验步骤取混合标准工作溶液及样品溶液，按照1.2色谱条件下分析，绘制盐酸去氧肾上腺素、马来酸氯苯那敏、氢溴酸右美沙芬标准工作曲线，计算得线性方程，利用线性方程计算镇咳口服液中三种成分的含量。2结果与讨论2.1色谱条件的选择对混合标准品溶液在190400 nm区间进行扫描，选择有较大吸收的波长220 nm为检测波长。分别考察ACE Excel super C18色谱柱、迪马Diamonsil Plus C18色谱柱，结果表明，同等条件下，ACE Excel super C18型色谱柱分离度最佳，色谱峰宽更小，对称性更好，因此选择ACE Excel super C18型色谱柱为分离柱。分别考察磷酸二氢钠溶液-甲醇、磷酸二氢钠溶液-乙腈作为流动相的分离效果。结果表明，选择磷71化学分析计量2023 年，第 32卷，第 7 期酸二氢钠溶液-甲醇作为流动相时，色谱峰形对称，基线平稳。故选择磷酸二氢钠溶液-甲醇作为流动相。分别考察戊烷磺酸钠、庚烷磺酸钠、辛烷磺酸钠作为离子对试剂时的分离效果。结果表明离子对试剂烷基链越长，分离度改善明显，因此选择辛烷磺酸钠作为离子对试剂。随着离子对试剂浓度的升高，色谱峰形对称性越好，当辛烷磺酸钠质量浓度高于2.5 g/L时，分离度合适，色谱峰形理想。同时考虑到离子对试剂浓度过大时，会缩短色谱柱的使用寿命，故最终选择2.5 g/L辛烷磺酸钠溶液，可使各主成分的色谱峰分离效果最佳，互不干扰。以缓冲盐溶液-甲醇作为流动相并考察两组分配比对色谱分离效果的影响。结果表明，当甲醇的体积分数增大时，色谱保留时间缩短；甲醇的体积分数减少时，保留时间延长。因镇咳口服液中成分复杂，为实现更好的分离效果，流动相的组成会逐渐改变，使得多种成分在更广泛的条件下被洗脱，故采用梯度洗脱，提高分离效率与检测灵敏度。调整流动相pH分别为2.0、3.0、4.0，考察流动相pH值对色谱分离效果的影响。发现随着pH值降低，色谱保留时间延长，基线分离良好，同时色谱峰形尖锐、对称，考虑分离度、色谱柱耐受性、保留时间等因素，故最终选择流动相pH值为3.0。2.2方法专属性取空白溶剂（流动相A）、混合标准品溶液、阴性样品溶液、样品溶液注入液相色谱仪，记录相应色谱图，各色谱图分别见图1图4。结果表明，各辅料峰对主药成分色谱峰无干扰，盐酸去氧肾上腺素、马来酸氯苯那敏、氢溴酸右美沙芬各峰分离度较好。2.3线性关系在1.2色谱条件下测定系列混合标准工作溶液，记录色谱图。以溶液的质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标进行线性回归，得盐酸去氧肾上腺素线性方程为 y=4 957.8x+2 771.8，相关系数 r=0.999 9；马来酸氯苯那敏线性方程为y=5 325.9x193.6，相关系 数 r=0.999 7；氢 溴 酸 右 美 沙 芬 线 性 方 程 y=2 168.2x+1 346.1，相关系数r=0.999 8。结果表明盐酸去氧肾上腺素、马来酸氯苯那敏、氢溴酸右美沙芬的线性范围分别为 38.87664.793 g/mL、16.25624.384 g/mL、76.723127.872 g/mL。2.4精密度试验同法制备6份样品，取样品溶液测定，结果见表1。由表1可知，盐酸去氧肾上腺素、马来酸氯苯那敏、氢溴酸右美沙芬含量测定结果的相对标准偏差均小于0.5%，表明该方法精密度良好。2.5稳定性试验取样品溶液，分别于室温放置0、2、4、6、8、10、14、18 h，进样10 L，在1.2色谱条件下测定色谱峰面积，试验结果见表2。结果表明样品溶液中盐酸去氧肾上腺素、马来酸氯苯那敏、氢溴酸右美沙芬色谱峰面积相对标准偏差分别为 0.04%、0.17%、0.08%，表明室温条件下，样品溶液在18 h内稳定性较好。051015202530t/min图1空白溶剂色谱图123t/min0510152025301盐酸去氧肾上腺素；2马来酸氯苯那敏；3氢溴酸右美沙芬图2混合标准品溶液色谱图t/min051015202530图3阴性样品溶液色谱图1 23 t/min0510152025301盐酸去氧肾上腺素；2马来酸氯苯那敏；3氢溴酸右美沙芬图4样品溶液色谱图表1精密度试验结果化合物盐酸去氧肾上腺素马来酸氯苯那敏氢溴酸右美沙芬色谱峰面积239 706，238 450，238 573，237 859，239 312，238 992105 725，105 064，105 118，104 793，105 454，105 259219 088，219 243，217 449，217 051，218 977，218 578RSD/%0.280.310.4272李鑫，等：高效液相色谱法法同时测定镇咳口服液中盐酸去氧肾上腺素马来酸氯苯那敏、氢溴酸右美沙芬2.6加标回收试验取阴性样品溶液1 mL于10 mL容量瓶中，分别加入4、5、6 mL混合标准品溶液，用流动相A定容，即得相对镇咳口服液处方含量80%、100%、120%的加标样品，同法配制3份，取续滤液测定，结果见表3。由表3数据可知，测得的各点回收率为98.65%99.65%，表明本方法准确度良好。2.7比对试验分别采用文献12方法检测盐酸去氧肾上腺素含量（下称“对照方法1”），文献14方法检测氢溴酸右美沙芬、马来酸氯苯那敏含量（下称“对照方法2”），所建方法同时检测3种成分含量，对三批制剂进行对比分析，平行测定6次，取平均值，测定结果见表4。采用t检验法对测定结果进行显著性检验，测定结果差异无统计学意义（P0.05），表明本方法与对照方法1、2检测结果都无显著性差异。但两种对照方法需要不同色谱条件，检测步骤比较繁琐；本方法可在同一色谱条件下同时测定3种成分含量，操作简便。3结语采用高效液相色谱法同时测定镇咳口服液中盐酸去氧肾上腺素、马来酸氯苯那敏、氢溴酸右美沙芬，并进行了方法学验证。该方法精密度好，专属性强，灵敏度高，具有良好的线性关系，为国内的质量标准研究提供了有价值的参考。参 考 文 献1 郑虎.药物化学 M.6版，北京：人民卫生出版社，2007：84.2 李国华，张文博，石兆瑞，等.L-去氧肾上腺素合成研究进展J.化工进展，2015，34（11）：4 0353 MA J，WU L N，HOU Z，et al.Visualizing the endocytosis of phenylephrine in living cells by quantum dot-based trackingJ.Biomaterials，2014，35：7 042.4 李果，仇午娴，王淑静，等.妥洛特罗贴剂联合马来酸氯苯那敏片治疗慢性咳嗽儿童患者的临床研究 J.中国临床药理学杂志，2020，36（19）：2 986.5 廖中林，苏黄.止咳胶囊联合马来酸氯苯那敏片治疗感染后咳嗽的临床疗效 J.宜春学院学报，2018，40（12）：79.6 康丽.复方甘草酸苷注射液联合马来酸氯苯那敏对过敏性紫癜患儿免疫球蛋白水平的影响 J.北方药学，2020，17（3）：70.7 陈禹霖，许巍.氢溴酸右美沙芬药物滥用致少年中毒 J.中国小儿急救医学，2017，24（5）：388.8 GHASEMZADEH Z，REAZAYOF A.Neuromodulatory effects 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995RSD/%0.040.170.08表3加标回收试验结果化合物盐酸去氧肾上腺素马来酸氯苯那敏氢溴酸右美沙芬加入量/mg9.919.9410.074.024.034.0619.7420.120.24测得量/mg9.88，9.82，9.809.84，9.83，9.8110.03，10.01，9.943.96，4.01，3.994.01，3.99，3.974.04，4.03，4.0119.68，19.72，19.6219.96，19.95，19.8719.98，19.92，20.01平均回收率/%99.2298.8899.2599.1798.9699.1899.6599.1598.65表4不同方法镇咳口服液样品测定结果批号201907012019070220190703主药成分盐酸去氧肾上腺素马来酸氯苯那敏氢溴酸右美沙芬盐酸去氧肾上腺素马来酸氯苯那敏氢溴酸右美沙芬盐酸去氧肾上腺素马来酸氯苯那敏氢溴酸右美沙芬质量分数平均值/%本方法99.6199.3299.54100.1299.4299.58100.2699.4199.43对照方法199.52-99.92-99.88-对照方法2-99.4899.56-99.97100.02-100.0799.4173