复方苦参汤对溃疡性结肠炎小鼠结肠组织中炎症因子及自噬水平的影响.pdf
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1、 2023 年第 57 卷第9 期 Shanghai J Tradit Chin Med,Vol.57,No.9,Sept.2023 上海中医药杂志复方苦参汤对溃疡性结肠炎小鼠结肠组织中炎症因子及自噬水平的影响邓双娇1,左冬梅1,陈倩云1,刘与进1,李华蓉1,2华中科技大学同济医学院附属协和医院中西医结合科(湖北 武汉 430022);2.华中科技大学协和京山医院中医科(湖北 荆门 431800)【摘要】目的观察复方苦参汤对溃疡性结肠炎(UC)小鼠结肠组织中炎症因子及自噬水平的影响,并探讨其作用机制。方法将20只SPF级C57BL/6雄性小鼠随机分为正常组、模型组、复方苦参汤组、美沙拉嗪组,每
2、组5只。适应性喂养7 d后,除正常组外,其余3组予以3%葡聚糖硫酸钠(DSS)自由饮用7 d制备UC小鼠模型。同时在造模第1天开始,正常组和模型组每日均以质量分数为0.9%的氯化钠溶液灌胃,复方苦参汤组与美沙拉嗪组分别予复方苦参汤(7.28 g/kg)、美沙拉嗪(0.52 g/kg)灌胃,每日1次,连续灌胃7 d。每天记录小鼠体质量、大便性状及便血情况,进行疾病活动指数(DAI)评分。末次灌胃结束后,取各组小鼠结肠组织,测量结肠长度,肉眼观察肠黏膜炎症损伤程度进行结肠黏膜损伤指数(CMDI)评分。采用苏木精-伊红染色(HE)法观察结肠组织病理变化,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测白介素-1(
3、IL-1)、白介素-18(IL-18)含量;免疫印迹(Western blot)法及实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)法检测自噬相关分子蛋白及mRNA表达。结果与正常组比较,模型组大鼠DAI评分、CMDI评分、促炎因子IL-1和IL-18,以及泛素结合蛋白 P62(P62)分子表达升高(P0.05),结肠长度缩短(P0.05),而抑炎因子白介素-4(IL-4)、白介素-10(IL-10)的表达下降(P0.05),Bcl-2同源结构域(Beclin1)蛋白、微管相关蛋白1A/1B轻链3(LC3)蛋白和其mRNA的表达水平明显降低(P0.05)。与模型组比较,复方苦参汤组与美沙拉嗪
4、组的DAI评分、CMDI评分、促炎因子IL-1和IL-18,以及P62分子均表达降低(P0.05),结肠长度显著增加(P0.05),而抑炎因子IL-4和IL-10,以及Beclin1、LC3的表达水平明显升高(P0.05)。与美沙拉嗪组比较,复方苦参汤组的CMDI评分增加(P0.05),IL-1、IL-18及P62的表达均升高(P0.05),而IL-4、IL-10,Beclin1、LC3的表达降低(P0.05)。结论复方苦参汤可通过促进肠组织自噬的表达,减轻 UC结肠炎症反应及病理损伤。【关键词】溃疡性结肠炎;复方苦参汤;自噬;炎症因子;小鼠模型;中药研究Effect of Compound
5、Sophorae Decoction on inflammatory factors and autophagy levels in colonic tissue of mice with ulcerative colitisDENG Shuangjiao1,ZUO Dongmei1,CHEN Qianyun1,LIU Yujin1,LI Huarong1,21.Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine,Union Hospital,Tongji Medical College,Huazhong Univ
6、ersity of Science and Technology,Wuhan,Hubei 430022,China;2.Department of Traditional Chinese Medicine,Jingshan Union Hospital,Huazhong University of Science and Technology,Jingmen,Hubei 431800,ChinaAbstract:ObjectiveTo observe the effect of Compound Sophorae Decoction(CSD)on inflammatory factors an
7、d autophagy in colon tissue of mice with ulcerative colitis(UC),and to explore its mechanism of action.MethodsTwenty SPF C57BL/6 male mice were randomly divided into normal group,model group,CSD group and mesalazine group,with 5 mice in each group.After one week of adaptive feeding,UC mouse models w
8、ere prepared by giving 3%dextran sulfate sodium(DSS)ad libitum for 1 week to mice in all three groups except the normal group.From the first day of modeling,the normal and model groups were intragastrically administered with 0.9%sodium chloride solution by mass fraction daily,and the CSD group and t
9、he mesalazine group were intragastrically administered once daily for 1 week with CSD(7.28 g/kg)and mesalazine(0.52 g/kg)respectively.Body weight,DOI:10.16305/j.1007-1334.2023.2210040实 验 研 究基金项目 国家自然科学基金项目(82205058,81904018);华中科技大学同济医学院附属协和医院2021年自由创新预研基金(F0160200421003116)作者简介 邓双娇,女,博士研究生,主要从事中医药治疗
10、溃疡性结肠炎的临床研究工作通信作者 李华蓉,主治医师;E-mail:63上海中医药杂志 2023 年第 57 卷第9 期 Shanghai J Tradit Chin Med,Vol.57,No.9,Sept.2023 stool characteristics and hematochezia were recorded every day,and disease activity index(DAI)scores were measured.After the final gavage,the colonic tissues of mice in each group were taken
11、 to measure the length of the colon,and the degree of intestinal mucosal inflammatory injury was macroscopically observed for CMDI scoring.HE staining was used to observe the histopathological changes,ELISA was used to detect the contents of IL-1 and IL-18,and Western blot and RT-qPCR were used to d
12、etect autophagy-related molecule protein and mRNA expression.ResultsAccording to the inter-group comparison between normal group and model group,the DAI score,CMDI score,the expression of pro-inflammatory cytokines IL-1,IL-18 and P62 molecules increased(P0.05),the colon length was shortened(P0.05),t
13、he expression of anti-inflammatory cytokines IL-4 and IL-10 decreased(P0.05),and the expression levels of Beclin1 and LC3 protein and mRNA decreased significantly(P0.05)in the model group.According to the inter-group comparison between the model group and the CSD and mesalazine groups,the DAI score,
14、CMDI score,pro-inflammatory cytokines IL-1,IL-18 and P62 molecules decreased(P0.05),the colon length significantly increased(P0.05),and the expression levels of anti-inflammatory factors IL-4,IL-10,Beclin1 and LC3 significantly increased(P0.05)in the CSD group and mesalazine group.According to the i
15、nter-group comparison between the CSD group and the mesalazine group,the CMDI score increased(P0.05),the expression of IL-1,IL-18 and P62 increased(P0.05),the expression of IL-4,IL-10,Beclin1 and LC3 decreased(P0.05)in the CSD group.ConclusionCSD can reduce the colonic inflammation and pathological
16、injury in UC model mice by promoting the expression of autophagy in colonic tissue.Keywords:ulcerative colitis;Compound Sophorae Decoction;autophagy;inflammatory factors;mouse model;traditional Chinese herbal medicine research溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一种累及结肠黏膜的慢性非特异性炎症性疾病,临床主要表现为持续或反复发作的腹泻、黏液脓血便
17、伴腹痛、里急后重等1。我国UC的发病率呈明显上升的趋势2。UC复发率高,迁延难愈,且有一定的癌变率,被世界卫生组织列为世界难治性疾病。因此积极探索UC的发病机制和治疗方法具有重要的临床意义。自噬对炎症反应有重要的调控作用,不仅影响感染性疾病的缓解和炎症性疾病的病理过程,而且在无细菌感染的组织损伤诱发的炎症反应中也能发挥抗炎效应。自噬功能障碍是UC发病的重要因素3-4,因此调控自噬可能是控制UC肠道炎症的切入点之一。复方苦参汤治疗UC临床疗效确切5-7,然相关的作用机制需要进一步探究。本研究通过观察UC小鼠结肠组织自噬相关分子及炎症因子表达情况,探讨复方苦参汤治疗UC的可能机制,以期为本病的治疗
18、提供实验依据。1材料与方法1.1材料1.1.1动物SPF级78周龄的雄性C57BL/6小鼠20只,体质量1822 g,由斯贝福(北京)生物技术有限公司提供。动物生产合格证号:SCXK(J)2019-0010。实验动物饲养于华中科技大学同济医学院实验动物中心。动物使用许可证号:SYXK(鄂)2016-0057。采光昼夜交替,普通饲料喂养,自由饮水。本实验方案经华中科技大学同济医学院实验动物伦理委员会审核批准(伦理批准号:S2640)。1.1.2药物与试剂复方苦参汤由苦参 15 g、地榆15 g、青黛3 g、白及10 g、三七3 g、甘草10 g组成,购自华中科技大学同济医学院附属协和医院中药房。
19、上述中药煎煮浓缩至100 mL含生药量36.4 g水溶液,于4 条件下保存备用。美沙拉嗪缓释颗粒(0.5 g/粒),法国爱的发制药集团(批号:H20193164)。使用前采用质量分数为 0.9%的氯化钠溶液配成5 g/L混悬液。葡聚糖硫酸钠(DSS),美国 MP Biomedicals 公司(批号:Q7418);Bcl-2同源结构域蛋白1(Beclin1)、泛素结 合 蛋 白 P62(P62)、微 管 相 关 蛋 白 1A/1B 轻 链 3(LC3)、-肌动蛋白(-actin)、一抗及羊抗兔HRP标记二抗,武汉爱博泰克生物科技有限公司(批号分别为A7353、A7758、A19665、AC026
20、、AS014);小鼠白介素(IL)-1、IL-4、IL-10、IL-18试剂盒,蛋白裂解液、二奎啉甲酸法(BCA)定量试剂盒、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)试剂盒、增强型化学发光试剂盒(ECL)、4%多聚甲醛固定液,上海碧云天生物技术有限公司(批号分别为PI301、PI612、PI522、PI553、P0013B、P0012S、P0012A、P0018S、P0099);RNA逆转录试剂盒、实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测试剂盒,南京诺唯赞生物科技股份有限公司(批号分别为 R212-01/02、Q411-02/03);隐血试剂盒,南京建成生物工程研究
21、所(批号:C027-1-1)。1.1.3主要仪器蛋白电泳仪,北京市六一仪器厂(型号:DYY-6C);转膜仪,北京市六一仪器厂(型号:DYCZ-400D);StepOne Plus实时荧光定量PCR仪,美国ABI公司(型 号:7500);核 酸 测 定 仪,美 国 Thermo Fisher Scientific公司(型号:NanoDrop ONE);化学发光仪,美国Thermo Fisher Scientific公司(型号:iBright750);研磨仪,武汉赛维尔生物科技有限公司(型号:KZ-);酶标仪,美谷分子仪器(上海)有限公司(型号:CMax Plus);64上海中医药杂志 2023
22、年第 57 卷第9 期 Shanghai J Tradit Chin Med,Vol.57,No.9,Sept.2023 台式离心机,德国Eppendorf公司(型号:5424R);数码显微镜,日本Olympus株式会社(型号:DP73);电子天平,杭州万特衡器有限公司(型号:WT2002)。1.2分组与造模20只C57BL/6小鼠适应性喂养7 d后,随机分为正常组、模型组、复方苦参汤组及美沙拉嗪组,每组5只。除正常组外,其余组别小鼠应用3%DSS溶液诱导7 d,建立UC模型,小鼠出现腹泻、体质量减轻、黏液脓血便时说明造模成功8。1.3干预方法造模的同时开始灌胃给药,在造模第1天起,按10 m
23、L/kg体质量,正常组和模型组以质量分数为0.9%的氯化钠溶液灌胃,复方苦参汤组予复方苦参汤浓缩液7.28 g/kg灌胃,美沙拉嗪组予美沙拉嗪混悬液0.52 g/kg灌胃,每日1次,连续给药7 d。同时每日观察并记录各组小鼠体质量变化、大便性状及隐血情况,计算疾病活动指数(DAI)评分。1.4检测指标与方法1.4.1一般情况及DAI评分造模及灌胃期间,每日观察并记录小鼠的活动度、体质量及大便性状、隐血等一般情况。根据评分标准9进行评分。DAI评分=(体质量下降评分+大便性状评分+大便隐血评分)/3。分数越高,提示炎症越重。评分标准详见表1。1.4.2结肠长度、形态变化情况小鼠麻醉后解剖,取小鼠
24、盲肠至肛门端并平铺于白纸上,使用手机相机原像素拍照并记录。1.4.3结肠黏膜损伤指数(CMDI)评分及苏木精-伊红(HE)染色分离结肠后,沿肠系膜纵轴剪开,用预冷的磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗后,用滤纸吸干,平放在白纸上进行CMDI评分8评价(评分标准见表2)。使用4%多聚甲醛固定小鼠结肠,石蜡包埋切片后,HE 染色,通过显微镜观察结肠组织病理变化情况。见表2。1.4.4结肠组织IL-1、IL-4、IL-10、IL-18水平小鼠结肠组织称重后,按1 5的质量体积比,加入预冷的PBS,使用匀浆机充分匀浆,5 000 r/min、4 离心15 min,取上清液,严格按照ELISA试剂盒说明书操作步
25、骤检测炎症因子IL-1、IL-4、IL-10、IL-18的水平。1.4.5结肠组织中 P62、Beclin1、LC3蛋白表达采用免 疫 印 迹(Western blot)法 检 测 结 肠 组 织 中 P62、Beclin1、LC3蛋白表达水平。取适量小鼠结肠组织,加入蛋白裂解液及3颗匀浆珠,进行低温匀浆(60 Hz,180 s);冰上裂解 20 min 后,4、12 000 r/min 离心10 min,吸取上清液至新的EP管。采用二奎啉甲酸法(BCA)测定蛋白浓度,配制10%的丙烯酰胺分离胶,5%的浓缩胶,上样进行电泳。用0.45 m的聚偏二氟乙烯膜(PVDF)转膜,5%的牛奶封闭 1 h
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