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二甲双胍改善由C9ORF72肌萎缩侧索硬化_额颞叶痴呆相关多聚甘氨酸-精氨酸诱导的线粒体损伤.pdf
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1、Vol.43 No.7 Jul.2023上海交通大学学报(医学版)JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE)http:/上海交通大学学报(医学版),2023,43(7)二甲双胍改善由C9ORF72肌萎缩侧索硬化/额颞叶痴呆相关多聚甘氨酸-精氨酸诱导的线粒体损伤冯奕源1,徐忠匀1,尹雅芙1,王辉1,程维维1,21.上海交通大学医学院附属新华医院核医学科,上海 200092;2.上海交通大学医学院附属新华医院心血管发育与再生医学研究所,上海 200092摘要目的探索C9ORF72肌萎缩侧索硬化/额颞叶痴呆(amyotrophi
2、c lateral sclerosis/frontotemporal dementia,ALS/FTD)相关的多聚甘氨酸-精氨酸(poly-glycine-arginine,poly-GR)对线粒体形态及功能的影响,并分析二甲双胍对由poly-GR诱导的线粒体损伤的修复作用及其可能的机制。方法采用慢病毒感染法分别构建能够稳定表达50个重复甘氨酸-精氨酸序列(glycine-arginine)50,(GR)50 和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的SK-N-SH细胞,即(GR)50-SK细胞株和GFP CTRL-SK细胞株。采用蛋白质印迹法(Wester
3、n blotting)验证已构建细胞中(GR)50蛋白的表达水平,并采用荧光显微镜观察GFP CTRL-SK细胞的GFP表达。采用碘化丙啶(propidium iodine,PI)染色分别检测(GR)50-SK、GFP CTRL-SK细胞的凋亡水平。利用免疫荧光(immunofluorescence,IF)染色分析(GR)50蛋白在细胞内的定位情况。采用超氧化物指示剂MitoSOX Red分别对(GR)50-SK、GFP CTRL-SK细胞的氧自由基进行染色,并利用荧光显微镜观察红色荧光强度以评估线粒体活性氧水平的变化。采用透射电镜分别观察(GR)50-SK、GFP CTRL-SK细胞的线粒体
4、形态。采用Western blotting检测(GR)50-SK、GFP CTRL-SK细胞的蛋白激酶B(protein kinase B,PKB,又称AKT)及其磷酸化水平。利用SC79激活(GR)50-SK细胞中的AKT,并采用MitoSOX Red染色及PI染色实验分析AKT磷酸化后细胞的线粒体活性氧水平及凋亡水平。利用二甲双胍处理(GR)50-SK、GFP CTRL-SK细胞,随后通过上述方法以及ATP检测试剂盒检测细胞的凋亡水平、线粒体活性氧水平、线粒体形态、AKT及其磷酸化水平、ATP浓度情况。结果Western blotting结果提示(GR)50-SK细胞构建成功,荧光显微镜的
5、观察结果显示GFP CTRL-SK细胞构建成功。PI染色结果显示,(GR)50-SK细胞较GFP CTRL-SK细胞的凋亡水平更高(P=0.016)。IF结果提示,(GR)50-SK细胞中(GR)50蛋白与线粒体存在部分共定位。与GFP CTRL-SK细胞相比,(GR)50-SK细胞的线粒体形态及结构存在明显异常,其活性氧水平明显上升。(GR)50-SK细胞中的AKT水平与GFP CTRL-SK细胞相仿,但磷酸化AKT水平显著下降。SC79处理(GR)50-SK细胞后,可显著上调其AKT磷酸化水平,并下调其活性氧水平及凋亡水平。二甲双胍处理可明显上调(GR)50-SK细胞中的磷酸化AKT水平,
6、但对AKT水平无影响;可重塑该细胞中的部分线粒体形态结构、降低活性氧水平、增加ATP的生成(P=0.000),并下调细胞的凋亡水平(P=0.000)。结论(GR)50可通过下调AKT磷酸化引起线粒体形态及功能异常,并促进细胞凋亡;而二甲双胍则可抑制由(GR)50蛋白诱导的上述病理事件的发生。关键词C9ORF72肌萎缩侧索硬化症/额颞叶痴呆;多聚甘氨酸-精氨酸;线粒体;磷酸化蛋白激酶B;二甲双胍DOI10.3969/j.issn.1674-8115.2023.07.006 中图分类号R744.8 文献标志码AMetformin ameliorates the mitochondrial dama
7、ge induced by C9ORF72 amyotrophic lateral sclerosis/frontotemporal dementia-related poly-GRFENG Yiyuan1,XU Zhongyun1,YIN Yafu1,WANG Hui1,CHENG Weiwei1,21.Department of Nuclear Medicine,Xinhua Hospital,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,Shanghai 200092,China;2.Institute for Developmenta
8、l and Regenerative Cardiovascular Medicine,Xinhua Hospital,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,Shanghai 200092,China论著 基础研究基金项目 国家自然科学基金(81901162);上海市青年科技启明星计划(20QA1406300)。作者简介 冯奕源(1997),女,硕士生;电子信箱:。通信作者 程维维,电子信箱:。Funding Information National Natural Science Foundation of China(8190116
9、2);Shanghai Rising-Star Program(20QA1406300).Corresponding Author CHENG Weiwei,E-mail:.8392023,43(7)上海交通大学学报(医学版)Vol.43 No.7 Jul.2023JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE)Abstract Objective To investigate the effect of C9ORF72 amyotrophic lateral sclerosis/frontotemporal dementia(
10、ALS/FTD)-related poly-glycine-arginine(poly-GR)on mitochondrial morphology and function,and analyze the rescue effect of metformin on mitochondrial damage induced by poly-GR and its underlying mechanism.Methods SK-N-SH cells stably overexpressing 50 repeated glycine-arginine sequences(GR)50 or green
11、 fluorescent protein(GFP)were constructed by lentivirus infection,which were respectively named as(GR)50-SK cell line and GFP CTRL-SK cell line.(GR)50 expression in(GR)50-SK cells was verified by Western blotting.GFP expression in GFP GTRL-SK cells was observed by fluorescence microscope.Propidium i
12、odide(PI)staining was used to detect the apoptosis levels of(GR)50-SK and GFP CTRL-SK cells.Immunofluorescence(IF)staining was performed to determine the subcellular location of(GR)50.Reactive oxygen species(ROS)level of mitochondria was evaluated by staining cells with MitoSOX Red followed by obser
13、ving the intensity of red fluorescence under fluorescence microscope.The mitochondrial morphology of(GR)50-SK and GFP CTRL-SK cells was observed by transmission electron microscopy.Western blotting was used to detect protein kinase B(PKB,also known as AKT)and its phosphorylation levels in(GR)50-SK a
14、nd GFP CTRL-SK cells.SC79 was used to activate AKT in(GR)50-SK cells,and MitoSOX Red staining and PI staining were used to analyze mitochondrial ROS and apoptosis levels after phosphorylated AKT increased.Metformin was used to treat(GR)50-SK and GFP CTRL-SK cells,respectively,and the apoptosis level
15、s,mitochondrial ROS levels,mitochondrial morphology,AKT and its phosphorylation levels,and ATP concentrations of the two cells were detected by the above methods and ATP detection kit,respectively.Results Western blotting showed that the construction of(GR)50-SK cells was successful,and fluorescence
16、 microscopy showed that the construction of GFP CTRL-SK cells was also successful.PI staining results showed that the apoptosis level of(GR)50-SK cells was higher than that of the GFP CTRL-SK cells(P=0.016).IF staining results showed that there was partial co-localization of(GR)50 in the mitochondri
17、a of(GR)50-SK cells.Compared with GFP CTRL-SK cells,the mitochondrial morphology and structure of(GR)50-SK cells were significant abnormalities,with a significantly increased ROS levels.The AKT levels in(GR)50-SK cells were similar to those in the GFP CTRL-SK cells,but there was a significant decrea
18、se in phosphorylated AKT levels.After(GR)50-SK cells were treated with SC79,the AKT phosphorylation level was significantly upregulated,and ROS level and apoptosis level were significantly downregulated.Metformin could significantly up-regulate the phosphorylated AKT levels in(GR)50-SK cells,but had
19、 no effect on AKT levels;it could reshape the morphology and structure of some mitochondria,reduce ROS levels,increase ATP production(P=0.000),and down-regulate the level of cell apoptosis(P=0.000).Conclusion(GR)50 can cause mitochondrial morphology and function abnormalities by down-regulating AKT
20、phosphorylation,and promote cell apoptosis.Metformin can effectively reduce the occurrence of the above pathological events induced by(GR)50.Key words C9ORF72 amyotrophic lateral sclerosis/frontotemporal dementia(C9ORF72 ALS/FTD);poly-glycine-arginine(poly-GR);mitochondrion;phosphorylated protein ki
21、nase B;metforminC9ORF72基因1号内含子区GGGGCC重复序列GGGGCC repeat,(G4C2)n 的扩增突变是导致遗传性肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)和 额 颞 叶 痴 呆(frontotemporal dementia,FTD)发生的最常见病因1。异常扩增的(G4C2)n可 通 过 由 重 复 序 列 介 导 的 不 依 赖 AUG(repeat associated non-AUG,RAN)翻译产生 5 种聚二肽重复蛋白(dipeptide repeat protein,DPR),其中以多聚甘氨酸-精氨酸(p
22、oly-glycine-arginine,poly-GR)的细胞毒性最为显著2-3。有尸检结果4发现,poly-GR 主要分布在皮层、海马及小脑区域,其在脑内的分布很大程度上与 C9ORF72 ALS/FTD 患者疾病累及的脑区重叠;继而提示较其他的 DPR,poly-GR 与 C9ORF72 ALS/FTD 患者的神经元损伤关系更为密切。相关研究2,5-6已证实,poly-GR可通过引起 DNA 损伤、翻译抑制及线粒体功能障碍等造成神经元死亡,其中线粒体功能障碍被认为是poly-GR 导致神经元死亡的早期病理事件之一。因此,有效降低 poly-GR 水平、减轻 poly-GR 对线粒体 功
23、能 的 损 伤 是 降 低 poly-GR 细 胞 毒 性 的 重 要手段。已有研究7证实蛋白激酶 B(protein kinase B,PKB,又称 AKT)对 poly-GR 毒性具有重要调控作用,过表达AKT或利用AKT激动剂SC79促进AKT的磷酸化均可有效降低poly-GR水平及其细胞毒性。而 poly-GR 过表达是否会引起 AKT及其磷酸化水平的异常,该异常与 poly-GR 导致线粒体功能障碍的相关性如何,目前则鲜少有报道,进而也缺乏以AKT 或线粒体为靶点来抑制 poly-GR 相关毒性的应用尝试。临床上,二甲双胍是治疗糖尿病的一线用药,其已被证实可有效恢复神经退行性疾病模型
24、中的线粒体功能障碍;且有研究提示,二甲双胍也可促进AKT磷酸化8。基于此,本研究就poly-GR过表达对线粒体功能、AKT及其磷酸化水平的影响进行分析,并就二甲双胍对由 poly-GR 诱导的线粒体功能异常及细胞凋亡的影响进行探讨,以期为缓解poly-GR 细胞毒性、延缓 C9ORF72 ALS/FTD 进展提供有效的策略。840冯奕源,等二甲双胍改善由C9ORF72 肌萎缩侧索硬化/额颞叶痴呆相关多聚甘氨酸-精氨酸诱导的线粒体损伤http:/上海交通大学学报(医学版),2023,43(7)1材料与方法1.1细胞、试剂与仪器人胚肾细胞 293T、人神经母细胞瘤细胞 SK-N-SH均购自中国科学
25、院典型培养物保藏委员会细胞库。MitoSOX Red 线 粒 体 超 氧 化 物 指 示 剂(Invitrogen,美国),碘化丙啶(propidium iodide,PI;上海懋康生物科技有限公司),In-Fusion试剂盒(TaKaRa,日本),二甲双胍(上海碧云天生物科技有限公司),AKT 激动剂 SC79(MedChemExpress,美国),FLAG 抗体(Sigma,德国),-actin 抗体、磷酸化 AKT(T308)抗体、AKT 抗体、GAPDH 抗体、线 粒 体 外 膜 转 位 酶 20(translocase of outer mitochondrial membrane
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