鹅源金黄色葡萄球菌分离鉴定及其诊治分析.pdf

试 验研 究资助项目:财政部和农业农村部 国家现代农业产业技术(水禽)体系(CARS-42-54);云南省廖明专家工作站(202105AF150077)通信作者鹅源金黄色葡萄球菌分离鉴定及其诊治分析吕顺燕1,2,江琳2,3,王喜2,李珂2,常志顺2,信爱国2(1.昆明市东川区动物疫病预防控制中心,云南 昆明 654100;2.云南省畜牧兽医科学院养禽与禽病研究所,云南 昆明 650224;3.瑞丽市动物疫病预防控制中心,云南 瑞丽 678600)摘要:为确诊昆明市东川区某养鹅场疑似葡萄球菌感染鹅群的致病原因,采集发病鹅的脑组织、肿胀关节脓液及肝脏等病料进行细菌分离鉴定。结果显示,从病料中分离到 1 株细菌,分离菌在普通营养琼脂平板上形成光滑、湿润、无色、表面凸起的圆形菌落,在血琼脂平板上能产生 溶血,镜检呈革兰氏阳性葡萄串状;生化鉴定结果符合金黄色葡萄球菌反应特征;分离菌 16S rRNA扩增序列分析表明,其匹配度最高的均是金黄色葡萄球菌各株系的 16S rRNA 序列,综合研判分离菌株为鹅源金黄色葡萄球菌。药敏试验显示,该菌株对头孢噻肟、阿米卡星等敏感,对强力霉素、庆大霉素等中度敏感,对氨苄西林、大观霉素等具有耐药性;该分离菌株接种试验小鼠具有较强的致病性。结果表明,金黄色葡萄球菌是引起该场鹅群感染的致病因素之一,该分离菌对多种抗菌药具有耐药性,应引起重视。研究结果为该地区鹅病的临床诊治提供参考。关键词:鹅;金黄色葡萄球菌;分离鉴定;东川区中图分类号:S852.61+1 文献标志码:A 文章编号:1005-1341(2023)04-0001-03 葡萄球菌(Staphylococcus)是一种革兰氏阳性菌,菌体多呈葡萄串状样排列,无运动性,无鞭毛,不会形成芽孢。该菌广泛分布在土壤、空气、饲料、饮水及饲养环境中,健康鹅的羽毛、皮肤表面、肠道以及粪便中。鹅葡萄球菌病多数病例由金黄色葡萄球菌引起传染性关节炎,主要通过直接接触或通过皮肤、损伤的黏膜及呼吸道等途径感染1。鹅葡萄球菌病临床症状主要有急性和慢性两种:急性病例主要是一个月至两个半月的雏鹅较为多发,常表现为发病急、死亡率高,精神沉郁,食欲不振,翅膀无力下垂、羽毛蓬松,胸腹部皮下充血、水肿,一般病程为26 d,常发生败血症死亡2;慢性病鹅常在跗、趾、掌关节处表现发炎肿胀以及站立困难、伏地不愿行动、跛行和腹泻等,因久卧导致胸部龙骨上发生浆液性滑膜炎,病程可达 23 周,最后因难以采食而极度饥渴死亡3。鹅葡萄球菌病通过空气传播,感染能力强、致死率高,近年来发病率呈上升趋势。2022 年 10 月,东川区某养鹅场雏鹅出现精神不振、关节肿大、跛行等症状,后陆续发生死亡,对送检的 3 批次病鹅进行诊断,最终确诊为致病性金黄色葡萄球菌感染。1 材料与方法1.1 样品来源及实验动物2022 年 10 月,东川区某养鹅场自外地购进雏鹅 4 000 只,饲养 10 d 后,出现精神不振、关节肿大、跛行、腹泻等症状,陆续死亡400 只,死亡率达10%。经现场调查及病理剖检后,采集样品送至云南省畜牧兽医科学院养禽与禽病研究所实验室进行诊断。实验小鼠购自斯贝福(北京)生物技术有限公司。1.2 主要试剂和仪器革兰氏染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司,细菌 DNA 提取试剂盒购自天根生物科技(北京)有限公司,2San Taq PCR Mix 购自生工生物工程(上海)股份有限公司,LB 肉汤、LB 琼脂、微量生化鉴定管购自广东环凯微生物科技有限公司,抗生素药敏纸片购自杭州天和微生物试剂有限公司。1.3 细菌分离培养将病鹅剖检后,无菌采集其脑组织、关节腔脓液、肝脏等分别接种于普通营养琼脂培养基中,经过37 恒温培养箱培养18 h 后,从平板上挑取单个典型菌落进行纯化培养并保存,然后将纯化培养后的细菌划线接种于含血琼脂的平板并进行革兰氏染色镜检,观察细菌血琼脂平板生长情况及细菌形态。1.4 细菌生化鉴定按照细菌微量生化鉴定管使用说明书,挑取具有典型的金黄色有透明溶血环的菌体接种于不同的生化管中,37 恒温培养一定时间后,按说明书进行观察并判定反应结果。1.5 细菌 16S rRNA 鉴定按照细菌基因组 DNA 提取试剂盒说明书,提取分离菌基因组 DNA。参照文献 4 对细菌 16S rRNA 进行 PCR 扩增鉴定,PCR 扩增产物送擎科生物科技有限公司进行测序,测序结果采用 DNA Star 6.0 软件拼接,得到细菌相应 16S rRNA 序列,将序列提交 GenBank 进行 Blast 比对,并利用 MEGA 7.0 根据 NJ(Neighbor-Joining)法构建系统进化树,确定1云南畜牧兽医(2023 年第 4 期)细菌的种属分类。1.6 细菌药敏试验在无菌条件下,采用 K-B 纸片扩散法选取头孢噻肟、强力霉素等 18 种药敏试纸对分离菌株的药物敏感性进行测定,将药敏试纸片贴于涂布有适量新鲜菌液的普通营养琼脂平板,放置恒温培养箱中37 培养 15 h 后观察并测量抑菌圈大小,判断标准按产品说明书进行。1.7 动物试验将 12 只(302)g 小白鼠按每组 4 只分成 2 个试验组和 1 个空白对照组,2 个试验组分别腹腔注射 0.2 mL 终浓度为 1.2109 CFU/mL 的菌液、1.21010 CFU/mL 的菌液,空白对照组注射同等体积无菌生理盐水,分笼正常饲养,观察记录小鼠发病及死亡情况,死亡小鼠立即进行剖检,无菌挑取肝脏组织进行细菌分离。2 结果与分析2.1 临床症状及剖检变化不同日龄的发病鹅均表现为精神不振,腹部伏地、难以正常稳定站立,跛行或双脚一前一后呈滑水状,部分关节肿胀,按压有波动感,关节囊内有浆液性或脓性渗出物,生长缓慢形成僵鹅等。初步判断疑似因饲养管理、饲料营养及应激等不良因素引起的条件性致病病原体导致发病。2.2 细菌分离培养结果经过细菌分离及单菌落纯化培养,该细菌在普通营养琼脂平板上形成卵圆形、凸起、湿润、表面光滑的菌落,初期呈灰白色,后逐渐变成金黄色。菌株在血琼脂平板上形成较大的菌落且菌落周围产生明显的 溶血环。革兰氏染色结果为阳性,菌体形态呈葡萄串状排列,没有荚膜,未形成芽孢,符合金黄色葡萄球菌的形态特性。2.3 细菌生化鉴定结果分离株在半固体琼脂无扩散生长、氰化钾培养基不生长,山梨醇、尿素等为阴性反应,乳糖、麦芽糖等为阳性反应(表 1),符合葡萄球菌属生化特征,初步判断为金黄色葡萄球菌,命名为 YNSA001-2022。表 1 生化实验结果生化指标反应结果生化指标反应结果生化指标反应结果葡萄糖产酸产气+氰化钾培养基-半固体琼脂无扩散生长乳糖+甘露醇+赖氨酸脱羧酶-麦芽糖+山梨醇-葡萄糖磷酸盐胨水 VP-蔗糖+蛋白胨水-葡萄糖磷酸盐胨水 MR+西檬氏柠檬酸盐-半乳糖苷+三糖铁琼脂+尿素-硫化氢-2.4 细菌 16S rRNA 鉴定结果3 对 16S rRNA 引物均扩增到目的片段(图 1),产物测序拼接后获得 1 426 bp 的序列。Blast 比对分析结果显示,分离株 16S rRNA 序列与 NCBI 数据库中多数金黄色葡萄球菌参考株的同源性达100%。用 MEGA 7.0 根据 NJ 法构建系统进化树,以表皮葡萄球菌(S.epidermidis)和腐生葡萄球菌(S.saprophyticus)参考株为外源,结果显示(图 2),分离菌株 16S rRNA 基因与金黄色葡萄球菌参考株聚为一簇,亲缘关系最近,判定分离菌为鹅源金黄色葡萄球菌。M1232505007501 000bp2 000100M:DL2000 DNA marker;1-3:依次为 16S rRNA 基 因 序 列 27F-519R 段、357F-1115R 段和 926F-1492R 段。图 1 分离株 16S rRNA 基因 PCR 扩增结果图 2 分离株 16S rRNA 基因系统进化树2.5 细菌药敏试验结果对 18 种药物的敏感性试验结果:分离菌株对头孢噻肟、阿米卡星等敏感,对强力霉素、庆大霉素等中度敏感,对氨苄西林、大观霉素等具有耐药性(表2)。2.6 动物试验结果试验组小鼠在接种 12 h 后,开始表现出精神萎靡、被毛杂乱、昏睡呆滞等临床症状,2 d 内全部死亡,对照组全部健活。从死亡小鼠肝脏分离出的细菌,经鉴定与接种菌株一致。2云南畜牧兽医(2023 年第 4 期)表 2 药敏试验结果抗菌药物抑菌圈直径/mm结果头孢噻肟25S强力霉素13I庆大霉素13I多粘菌素9I大观霉素0R阿米卡星19S头孢他啶13R卡那霉素12R氨苄西林11R头孢氨苄21S恩诺沙星15I阿莫西林13R四环素11R新霉素20S妥布霉素14I红霉素0R阿奇霉素0R链霉素0R 注:R 是耐药;I 是中度敏感;S 是敏感。3 讨论金黄色葡萄球菌是一种重要的人兽共患病原菌,隶属于葡萄球菌属,是一种寄生于宿主体表的条件性致病菌,是食品中的重要微生物检测指标,在自然界中广泛存在。周厚德等5的研究发现,金黄色葡萄 球 菌 在 肉 与 肉 制 品 中 的 检 出 率 较 高,达11.27%,且生肉中的检出率(19.41%)远高于熟肉(4.91%),金黄色葡萄球菌不仅污染畜禽饲养、屠宰、运输和销售等各个环节,在熟肉制品加工、销售过程被污染的情况也不少。我国作为世界上鹅产品生产与消费大国,加强鹅养殖生产中各环节金黄色葡萄球菌的监测,可有效防止该病原菌给人类健康安全带来严重危害。气候突变、潮湿多雨、鹅只受到应激、抵抗力下降、皮肤损伤等容易诱发该病6。另外,饲养管理不当、孵化室环境不卫生、种蛋消毒不彻底、外壳污秽等易使葡萄球菌通过蛋壳孔隙进入蛋内,使胚胎感染,小鹅孵化时由脐带感染,常因脐炎和发生葡萄球菌性败血症而造成大批死亡,对养禽业持续健康发展有一定的影响,该病的死亡率可达 5%10%7。对鹅葡萄球菌病的诊断,仅仅根据临床症状、病理剖检和染色镜检是不足以确诊的,还需要结合细菌分离、细菌 16S rRNA 等分子生物学技术来诊断才能最终确诊。另外,金黄色葡萄球菌对许多抗生素具有耐药性,吴莹莹8对从住院患者所分离的金黄色葡萄球菌进行研究发现,金黄色葡萄球菌对氨苄西林、青霉素和红霉素等具有耐药性,本次分离的鹅源菌株同样对这些抗生素具有耐药性。对分离菌株及时开展药物敏感性实验,为该场在诊疗、防治方面提供了科学的依据。同时,科学防治金黄色葡萄球菌感染对保障动物源性食品安全具有重要的兽医公共卫生意义。4 防治措施4.1 加强饲养管理对种蛋及孵化过程应严格消毒;养殖场应实行全进全出的单一饲养管理模式,加强饲养管理和无菌意识,严格执行生物安全防控措施;进鹅前应对鹅舍进行彻底消毒,进鹅后定期进行带鹅消毒。鹅舍应保持通风干燥,给予全价饲料及青绿饲料,适时补充维生素及微量元素,保持水源清洁。适宜的饲养密度,防止拥挤,合理分群,尽量减少应激,严防鹅只受伤,适时清理粪肥及更换垫料,减少疾病传播;严格淘汰感染动物等综合技术手段。4.2 药物治疗发病后应尽早处理,严格封锁和消毒,选用敏感药物对全群进行治疗,常用药物有头孢噻呋注射液,每千克体重 56 mg,2 次/d,肌内注射,连用 3 d;或阿米卡星、新霉素(按说明书剂量)等进行拌料投喂9,10。参考文献:1 江涛.鹅葡萄球菌病的流行病学、临床特点、诊断和防治J.现代畜牧科技,2020,72(12):150-151.2李瑾,马卓.鹅葡萄球菌病诊断及治疗分析J.南方农业,2019,13(11):137-138,144.3 盘宝进,谢永平,汪文龙,等.鹅金黄色葡萄球菌的分离与鉴定J.广西畜牧兽医,2004(1):6-8,40.4 赵鹤庭,严红亚,何辉,等.一例鸡源金黄色葡萄球菌的分离鉴定与耐药性分析J.云南畜牧兽医,2019(04):5-7.5 周厚德,彭思露,刘道峰,等.20152017 年江西省部分市售食品中金黄色葡萄球菌的污染情况调查J.现代预防医学,2019,46(12):2158-2162.6 铁富萍,马建霞.鹅金黄色葡萄球菌病的诊断J.青海畜牧兽医杂志,2010,40(01):18-19.7 刘正伟,刘文正,刁蓓蓓.夏季鸭、鹅金黄色葡萄球菌感染的病例分析J.养禽与禽病防治,2014(1):15,14.8 吴莹莹.医院金黄色葡萄球菌感染临床分布及耐药性分析J.北方药学,2020,17(1):187-188.9 陈永霞,徐志伟,吴益备,等.鹅金黄色葡萄球菌感染诊断与治疗J.中国畜牧兽医文摘,2018,34(2):234-236.10 王昆鹏,许云鹏.鹅葡萄球菌病的诊断及治疗探究J.饲料博览,2021(5):76-77.收稿日期:2023-02-063云南畜牧兽医(2023 年第 4 期)