肺腺癌组织中MCM4的表达及其与预后、免疫微环境的相关性分析.pdf

115现代检验医学杂志第 38 卷第 5 期2023 年 9 月J Mod Lab Med,Vol.38,No.5,Sept.2023肺腺癌组织中 MCM4 的表达及其与预后、免疫微环境的相关性分析苗毅a，杨淑梅a，王晶b，武润苗a，孙皎琳a，吴军芳a（陕西省人民医院 a.呼吸与危重症医学科；b.检验科，西安 710068）摘要：目的探讨肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）组织中微小染色体维持蛋白 4（minichromosome mainte-nance proteins 4，MCM4）的表达及其与预后、免疫微环境的相关性。方法选取 2021 年 1 7 月陕西省人民医院收治的 LUAD 患者 4 例，应用转录组测序检测 LUAD 患者癌组织和癌旁组织 MCM4 表达水平。癌症基因组图谱肺腺癌(the cancer genome atla-LUAD，TCGA-LUAD)数据用于验证 LUAD 中 MCM4 表达并探究其与生存期的相关性。采用LinkedOmics 分析 LUAD 中 MCM4 共表达基因、功能富集及调控因子靶向富集情况。STRING 用于构建蛋白质-蛋白质互作网络。采用 TIMER 分析 MCM4 与 LUAD 肿瘤免疫微环境的相关性。COX 回归分析 LUAD 患者预后的影响因素。结果与癌旁组织比较，LUAD 癌组织中 MCM4 表达水平（6.500.86 vs 4.220.66）升高，差异有统计学意义（U=16，P=0.029）。TCGA-LUAD 发现相似结果(癌组织 3.630.92 vs 癌旁组织 1.900.28)，差异有统计学意义（U=30 355，P 0.001）。生存分析显示，MCM4 高表达 LUAD 患者总生存期和无病生存期 200 个月的累积生存率（8.79%和 19.25%）均低于 MCM4 低表达患者（28.87%和 36.82%），差异有统计学意义（风险比=1.7，1.4，均 P0.05）。共表达分析显示，LUAD 中与 MCM4 正相关的基因主要参与 P53 信号通路、DNA 复制、错配修复等通路。肿瘤免疫微环境分析显示，MCM4与中性粒细胞浸润呈正相关（partial.cor=0.14，P=0.002），与B细胞浸润呈负相关（partial.cor=-0.152，P0.001）。COX 回归分析显示，MCM4 是影响 LUAD 患者预后的独立因子。结论LUAD 癌组织中 MCM4 表达升高，与预后及免疫微环境显著相关，可作为 LUAD 患者不良预后评估的分子标志物。关键词：肺腺癌；微小染色体维持蛋白 4；肿瘤免疫微环境中图分类号：R734.2；R730.43文献标识码：A文章编号：1671-7414（2023）05-115-06doi:10.3969/j.issn.1671-7414.2023.05.022Expression of MCM4 in Lung Adenocarcinoma and Its Correlation with Prognosis and Immune MicroenvironmentMIAO Yia,YANG Shumeia,WANG Jingb,WU Runmiaoa,SUN Jiaolina,WU Junfanga（a.Department of Respiratory and Critical Care Medicine;b.Department of Clinical Laboratory,Shaanxi Provincial Peoples Hospital,Xian 710068,China）Abstract:ObjectiveTo explore the expression of minichromosome maintenance proteins 4(MCM4)in lung adenocarcinoma(LUAD)and its correlation with prognosis and immune microenvironment.MethodsFrom January to July 2021,four LUAD patients admitted to Shaanxi Provincial Peoples Hospital were selected and transcriptome sequencing was used to detect the expression level of MCM4 in LUAD cancer tissue and paracancerous tissue.TCGA-LUAD data was performed to validate the expression of MCM4 and explore its relevance to survival periods in LUAD.Co-expressed genes of MCM4,functional enrichment,and regulator target enrichment in LUAD were analyzed using LinkedOmics.STRING tool was adopted to construct the protein-protein interaction network.TIMER tool was utilized to investigate the relationship between MCM4 and the tumor immune microenvironment in LUAD.COX regression was used to analyze the influencing factors of prognosis for LUAD patients.ResultsCompared with the paracancerous tissues,the expression level of MCM4 in LUAD cancer tissues was increased(6.500.86 vs 4.220.66),and the difference was statistically significant(U=16,P=0.029).TCGA-LUAD data found a similar result(cancer tissues 3.630.92 vs paracancerous tissues 1.900.28),and the difference was statistically significant(U=30 355,P0.001).Survival analysis showed that the 200-month cumulative survival rate of OS and DFS of LUAD patients with high-expression MCM4(8.79%and 19.25%)was lower than that with low-expression MCM4(28.87%and 基因项目：陕西省重点研发计划项目(NO.2020DLSF01-06)：OPN/FOXM1信号通路在慢性阻塞性肺疾病气道重塑中的机制研究及临床价值。作者简介：苗毅(1984-)，女，硕士，副主任医师，研究方向：慢性气道疾病及肺部肿瘤研究,E-mail：Stella 。通讯作者：吴军芳(1983-)，女，硕士，主治医师，研究方向：肺恶性疾病发病机制,E-mail：。116现代检验医学杂志第 38 卷第 5 期2023 年 9 月J Mod Lab Med,Vol.38,No.5,Spet.202336.82%),and the differences was statistically significant(HR=1.7,1.4,all P0.05).Co-expression analysis revealed that the genes that were positively correlated with MCM4 in LUAD,were mainly involved in the P53 signaling pathway,DNA replication,and mismatch repair.Tumor immune microenvironment analysis showed that MCM4 was positively correlated with the infiltration of Neutrophils(partial.cor=0.14,P=0.002),and negatively correlated with the infiltration of B cells(partial.cor=-0.152,P0.001).COX regression analyses found that MCM4 was an independent factor affecting the prognosis of LUAD patients.ConclusionThe expression of MCM4 was increased in LUAD cancer tissues,and it was obviously related to the prognosis and immune microenvironment,which can be applied as a molecular marker to evaluate the poor prognosis of LUAD patients.Keywords:lung adenocarcinoma；minichromosome maintenance proteins 4；tumor immune microenvironment 全球癌症统计报告(GLOBOCAN 2020)数据显示，肺癌新发病例数高达 220 万，约占总新发癌症病例数的 11.4%，位列第二；死亡病例数占所有癌症死亡病例数的 18%，位列第一1。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌的主要类型，约占 80%85%2-3；肺腺癌（lung ade-nocarcinoma，LUAD）作为 NSCLC 的主要亚型（约占 40%45%），将被纳入本次研究。随着医疗手段的不断进步，部分患者的预后水平已得到较大提高，但是能够持续性获益的患者仍是少数。LUAD新型靶点的研究有望为患者提供新的诊疗方案，提高疗效，改善预后。微小染色体维持蛋白 4（minichromosome main-tenance proteins 4，MCM4）是一个高度保守的蛋白编码基因，属于 MCM 蛋白家族，主要参与调控真核生物的 DNA 复制起始4-5。最新研究发现，MCM4 在包括黑色素瘤、乳腺癌、食管癌、肝细胞癌、卵巢癌和胰腺导管腺癌等多种癌症中异常表达且具有作为其预后标志物的潜力6-11。除此之外，有研究发现 MCM4 在 NSCLC 中高表达，且高表达MCM4 患者的生存期明显缩短12-14。本研究通过结合临床样本和多种公共数据库分析，探究 LUAD 癌组织中 MCM4 的表达及其与预后、免疫微环境的相关性，旨在为 LUAD 的临床诊疗提供依据。1材料与方法1.1研究对象选择 2021 年 1 7 月在陕西省人民医院行手术切除治疗的 4 例 LUAD 患者，其中男性 2 例，女性 2 例。患者手术前均未接受任何治疗，且均无其他恶性肿瘤。术中采集 LUAD 癌组织以及距离癌组织 2 cm 以上癌旁组织，后者作为癌组织的对照。患者对本研究知情，并签署知情同意书。本研究获得医院伦理委员会批准。1.2仪器与试剂RNA 提取、定量、纯度检测和完整性检测试剂盒 RNeasy Plus Universal Kits（Qiagen,德国），QubitTM RNA HS 检测试剂盒（美国赛默飞世尔科学公司），Take3（BioTek,美国），Qseq100 Bio-Fragment Analyzer（Bioptic,中国）的RNA Cartridge。建库试剂盒 VAHTS mRNA-seq V3 Library Prep Kit for Illumina（Vazyme,中国），测序仪器 Illumina Hiseq 2000（Illumina，美国）。1.3方法1.3.1组织 RNA 提取、建库和测序及分析：利用RNeasy Plus Universal Kits 在新鲜的癌组织和癌旁组织中提取总 RNA，利用 QubitTM RNA HS 检测试剂盒定量提取的 RNA 浓度。分别用 Take3 和 Qseq100 Bio-Fragment Analyzer 的 RNA Cartridge 检 测 RNA的纯度和完整性。应用 VAHTS mRNA-seq V3 Li-brary Prep Kit for Illumina 构 建 RNA-seq 文 库 并在 Illumina Hiseq 2000 进行双端 100bp 测序。采用TrimGalore-0.6.0（https:/MCM4www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/）去除原始数据中的测序接头和低质量 reads。Kallisto v.0.46.2 用于统计基因的 TPM（transcript per million）值，并用Mann-Whitney U 检验比较 LUAD 癌组织和癌旁组织中 MCM4 的表达差异。1.3.2TCGA-LUAD 数据分析：使用 TCGA-LUAD数据（https:/ LUAD 癌组织和癌旁组织中 MCM4 的表达差异。Gene Expres-sion Profiling Interactive Analysis2（GEPIA2,http:/gepia2.cancer- MCM4 及其共表达基因和 LUAD 患者总生存期（OS）及无病生存期（DFS）的相关性，并绘制生存曲线。1.3.3LUAD 中 MCM4 的共表达、功能富集及调控分析：采用 LinkedOmics（http:/www.linkedomics.org/login.php）数据库的 Pearson 相关分析模块鉴定LUAD 中 MCM4 的共表达基因，并通过 STRING（https:/string-db.org/）构建蛋白质互作网络。采用 LinkInterpreter 中 的 Gene set enrichment analysis（GSEA）模块对 MCM4 及其共表达基因进行GO_BP 富集分析、KEGG pathway 富集分析、miR-NA-target 富集分析和转录因子-target 富集分析。过滤条件设置为 FDR（false discovery rate）、最小基因数为 10、模拟次数为 1 000 次。1.3.4MCM4 与 LUAD 免疫微环境的相关性分析：采用 TIMER（https:/cistrome.shinyapps.io/timer/）数 据库分析 MCM4 与 LUAD 肿瘤免疫微环境的相关117现代检验医学杂志第 38 卷第 5 期2023 年 9 月J Mod Lab Med,Vol.38,No.5,Sept.2023性，包括肿瘤纯度和 6 种免疫细胞（B 细胞、CD8+T 细胞、CD4+T 细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞）。1.4统计学分析采用 R 4.1.2 软件进行数据分析。计量资料以均值 标准差（xs）表示。Mann-Whitney U 检验比较 LUAD 癌组织和癌旁组织中 MCM4 的表达差异；Log-rank 检验比较两组间的累积生存率；单因素和多因素 COX 回归分析LUAD 患者预后的影响因素；森林图（forestplot 包）在 R 中绘制。P 0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1LUAD 癌组织和癌旁组织中 MCM4 表达水平的比较在实验样本中，LUAD 癌组织 MCM4 的表达量（6.500.86）高于癌旁组织（4.220.66），差 异 有 统 计 学 意 义（U=16，P=0.029）。TC-GA-LUAD 数据分析显示与实验样本相似的结果，LUAD 癌组织 MCM4 的表达量（3.630.92）高于癌旁组织（1.900.28），差异有统计学意义（U=30 355，P0.001）。2.2LUAD 中 MCM4 表达与其生存期的相关性见图 1。生存分析显示，MCM4 高表达 LUAD 患者OS 200 个月的累积生存率是 8.79%（21/239），低于 MCM4 低表达患者的 28.87%（69/239），差异有统计学意义（HR=1.7，P=0.001），见图 1A。MCM4 高表达 LUAD 患者 DFS 200 个月的累积生存率是 19.25%（46/239），低于 MCM4 低表达患者的36.82%（88/239），差异有统计学意义（HR=1.4，P=0.046），见图 1B。A：MCM4 表达与 LUAD 患者 OS 的生存曲线；B：MCM4 表达与LUAD 患者 DFS 的生存曲线。图 1MCM4 表达情况 LUAD 患者生存曲线2.3LUAD 中 MCM4 的共表达及功能富集见图2。共表达分析显示，LUAD 中与 MCM4 呈正相关的基因有 4 868 个，负相关的基因有 5 892 个，见图2A（FDR0.01）。与 MCM4 呈正相关的前 20 个基因中，MCM2，MCM10，GINS4，CDC6 和 ORC1 与 MCM4 的相互作用最强，见图 2B。生存分析显示，与 MCM4 呈正相关的前 20 个基因中，19 个基因表达量升高与 LUAD 的 OS 短有关，见图 2C（均P0.05）；3 个基因表达量升高与 LUAD 的 DFS 短有关，见图2D（均P0.05）。GO-BP富集分析显示，MCM4 共表达基因主要参与染色体分离、DNA复制、细胞周期检查点等通路(均 FDR0.05)。KEGG 富集分析显示，MCM4 的共表达基因主要参与细胞周期、DNA 复制、P53 信号通路和错配修复等通路(均 FDR0.05)。A：LUAD 中 MCM4 共表达基因的火山图。横轴：相关性系数，纵轴：-log10（校正后 P value）；B：LUAD 中与 MCM4 正相关的前20 个基因的蛋白质互作网络；C：LUAD 中与 MCM4 正相关的前 20 个基因表达与 OS 的相关性；红色：高表达组 OS 短，蓝色：高表达组 OS 长。D：LUAD 中与 MCM4 正相关的前 20 个基因表达与 DFS 的相关性。红色：高表达组 DFS 短，蓝色：高表达组 DFS 长。图 2 LUAD 中 MCM4 的共表达分析118现代检验医学杂志第 38 卷第 5 期2023 年 9 月J Mod Lab Med,Vol.38,No.5,Spet.20232.4LUAD中MCM4的调控作用调控分析显示，LUAD 中与 MCM4 及其共表达基因相关的 miRNA靶点为“TACTTGA，MIR-26A，MIR-26B”，“CAGCAGG，MIR-370”，“ATCATGA，MIR-433”和“AGGGCCA，MIR-328”（均 P0.05）。LUAD 中与 MCM4 及其共表达基因相关性最强的前 5 个转录因子靶点为“V$E2F_Q4”，“V$E2F_Q6”，“V$E2F1_Q6”，“V$E2F4DP1_01”和“V$E2F_02”（均 FDR=0）。2.5LUAD 中 MCM4 表达与肿瘤免疫微环境的相关性见图 3。TIMER 分析结果显示，LUAD 中MCM4表达与中性粒细胞的浸润水平（Neutrophil）呈 正 相 关（partial.cor=0.14，P=0.002）；与 B 细胞 的 浸 润 水 平 呈 负 相 关（partial.cor=-0.152，P0.05）。图 3MCM4 表达水平与 LUAD 肿瘤免疫细胞浸润的相关性2.6影响 LUAD 患者预后的 COX 回归分析见图 4。单因素 COX 回归分析显示，MCM4 的 HR和 95%的置信区间为 1.238 和 1.086 1.411，见图 4A。多因素 COX 回归分析显示，MCM4 的 HR和 95%的置信区间为 1.227 和 1.051 1.431，见图 4B。综上，MCM4 是影响 LUAD 患者预后的独立因子（均 P0.05）。A：单因素 COX 回归分析影响 LUAD 患者预后的危险因素；B：多因素 COX 回归分析影响 LUAD 患者预后的危险因素。图 4影响 LUAD 患者预后的危险因素3讨论微小染色体维持蛋白 4（MCM4）是一个高度保守的蛋白编码基因，属于 MCM 蛋白家族。通过结合实验样本和公共数据库分析，我们发现 MCM4在 LUAD 癌组织中表达量升高，且其表达与 LUAD的 OS 及 DFS 有关。这些发现与之前报道中的发现119现代检验医学杂志第 38 卷第 5 期2023 年 9 月J Mod Lab Med,Vol.38,No.5,Sept.2023一致13-15。通过共表达网络和功能富集分析发现，MCM4与多种蛋白存在相互作用，且这些蛋白质主要参与肿瘤发生相关通路。LUAD 中与 MCM4 正相关的前 20 个基因中有 3 个基因的表达水平升高同时与 OS 和 DFS 短有关，它们分别是 BUB1B,EXO1和 CHEK1。BUB1B 基因编码一种与纺锤体检查点功能有关的激酶，有研究发现纺锤体检查点功能受损出现在多种癌症中。除此之外，有研究报道BUB1B 与多种癌症的发生发展有关，如肝细胞癌、前列腺癌、肺腺癌等16-18。CHEN19等通过 meta分析发现 BUB1B 是 LUAD 患者不良预后的重要标志物。EXO1（核酸外切酶 1）是 Rad2 核酸外切酶的家族成员之一。有研究报道 EXO1 在多个癌症中异常表达，如胃食管癌、乳腺癌、宫颈癌等20-22。ZHOU 等23发现 EXO1 是 LUAD 潜在的预后标志物，并报道其与 LUAD 的免疫细胞浸润有关。CHEK1（检查点激酶 1）基因编码的蛋白属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员。研究报道 CHEK1 在乳腺癌、卵巢癌等癌症中异常表达24-25。综上提示，BUB1B,EXO1 和 CHEK1 可能是 LUAD 的新型分子标志物，其功能仍需进一步研究探讨。通过调控分析发现，在 LUAD 中 E2F 转录因子家族是 MCM4 失调的主要转录因子。E2F 家族在决定细胞何时分裂方面起着关键作用，肿瘤中E2F表达和/或E2F靶表达升高与预后不良有关26。例如，E2Fs 在乳腺癌、肺癌、前列腺癌的癌组织中均高表达27-28；E2F1与NSCLC的不良预后有关29；E2F2是肺癌的肿瘤激活因子和独立预后标志物30。MCM4 可能是通过 E2F 调控因子影响 LUAD 患者的预后，后续需要进一步探究。多研究发现肿瘤免疫微环境与肿瘤的发生发展以及预后水平密切相关，探究 MCM4 与 LUAD 肿瘤免疫细胞浸润的相关性具有一定价值。结果显示MCM4 与中性粒细胞呈正相关，与 B 细胞浸润呈负相关。新近研究发现中性粒细胞可以通过释放活性氧导致 DNA 的碱基突变，促进肿瘤发生31。此外，中性粒细胞还可与肿瘤免疫微环境中的其他免疫细胞发生相互作用，如中性粒细胞通过 CXCR4-CX-CL12 配受体相互作用分泌 IL-10，从而抑制细胞毒性 T 细胞的功能，促进肿瘤发生31。识别 MCM4高表达群体中的“immune-hot”亚群患者，并对其进行有针对性的免疫治疗，可能会提高这部分患者的生存率。此方面的临床意义值得探索和研究。综上所述，LUAD 癌组织中 MCM4 表达升高，与预后及免疫微环境显著相关，可作为 LUAD 患者不良预后评估的分子标志物。但本研究仍存在一定的局限性，如本文中部分结果是基于公共数据库展开，故而缺乏相关的分子实验验证；同时受临床样本量的限制，可能导致分析统计的误差，后续需要扩大样本展开进一步研究。参考文献：1 SUNG H,FERLAY J,SIEGEL R L,et al.Global cancer statistics 2020:GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countriesJ.CA-A Cancer Journal for Clinicians,2021,71(3):209-249.2 DUMA N,SANTANA-DAVILA R,MOLINA J R.Non-small cell lung cancer:epidemiology,screening,diagnosis,and treatmentJ.Mayo Clinic Proceedings,2019,94(8):1623-1640.3 SWANTON C,GOVINDAN R.Clinical implications of genomic discoveries in lung cancerJ.New England Journal of Medicine,2016,374(19):1864-1873.4 CHAMPASA K,BLANK C,FRIEDMAN L J,et al.A conserved MCM4 motif is required for MCM2-7 double-hexamer formation and origin DNA unwinding J.Elife,2019,8:e45538.5 ISHIMI Y.Regulation of MCM2-7 functionJ.Genes&Genetic 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