![点击分享此内容可以赚币 分享](/master/images/share_but.png)
大黄素抑制VEGF165诱导下人脐静脉内皮细胞的增殖、迁移及侵袭的研究.pdf
《大黄素抑制VEGF165诱导下人脐静脉内皮细胞的增殖、迁移及侵袭的研究.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《大黄素抑制VEGF165诱导下人脐静脉内皮细胞的增殖、迁移及侵袭的研究.pdf(6页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、摇 作者简介:徐卫星(1991),男,河南郑州人,主治医师,硕士学位,主要研究方向为眼部衰老疾病。大黄素抑制 VEGF165 诱导下人脐静脉内皮细胞的增殖、迁移及侵袭的研究徐卫星,孔凡逍(锦州医科大学附属第三医院,辽宁 锦州 121000)摇 摇 摘要:目的摇观察大黄素(emodin,EMO)对重组人血管内皮生长因子 165(recombinant human vascular endothelialgrowth factor165,VEGF165)诱导下人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)增殖、迁移及侵袭的影响并探讨其
2、机制。方法摇 离体培养 HUVECs,MTT 检测细胞活力计算 EMO 最佳作用浓度。实验分组和干预措施如下:对照组(完全培养基培养)、VEGF 模型组(VEGF165 20 ng/mL 预处理 72 h)、EMO 治疗组(VEGF165 20 ng/mL+EMO 预处理 72 h)。采用划痕实验、Transwell 小室垂直迁移、侵袭实验检测各组细胞水平迁移、垂直迁移和侵袭能力,采用细胞免疫荧光实验检测 VEGF 表达,Western Blot 检测 VEGF、VEGFR2、ERK 和 SRC 蛋白表达的变化。结果摇HUVECs 活力值(A 值)随着 EMO 浓度增加而降低,半抑制浓度(IC
3、50)为20郾 27 滋mol/L,将20 滋mol/L 作为 EMO 的最佳有效浓度进行后续实验。EMO 治疗组相对水平迁移率、垂直迁移率和侵袭率均较 VEGF 模型组降低,差异均有统计学意义(P0郾 05)。EMO 治疗组细胞免疫荧光 VEGF 蛋白表达荧光强度低于 VEGF 模型组。EMO 治疗组 VEGF、VEGFR2、ERK 和 SRC 蛋白表达较 VEGF 模型组降低,差异均有统计学意义(P0郾 05)。结论摇 EMO 可以有效抑制 VEGF165 诱导下人脐静脉内皮细胞的增殖、迁移及侵袭能力,可能是通过抑制 VEGF/VEGFR2/MAPK/ERK 和 VEGF/VEGFR2/S
4、RC 信号通路实现的。关键词:大黄素;age-related macular degeneration;VEGF;HUVEC;新生血管中图分类号:R285摇 摇 摇 文献标志码:A摇 摇 摇 文章编号:2096-305X(2023)04-0033-06Study on the Inhibition of Emodin on the Proliferation,Migration and Invasionof Human Umbilical Vein Endothelial Cells Induced by VEGF165Xu Weixing,Kong Fanxiao(The Third Aff
5、iliated Hospital of Jinzhou Medical University,Jinzhou 121000 China)Abstract:Objective摇 To observe the effect of emodin(EMO)on the proliferation,migration and invasion of human umbilicalvein endothelial cells(HUVECs)induced by Recombinant Human Vascular Endothelial Growth Factor165(VEGF165)and explo
6、reits mechanism.Methods摇 HUVECs were cultured in vitro and the optimal concentration of EMO was calculated by MTT assay.Theexperimental grouping and interventions were as follows:control group(complete medium culture),VEGF model group(VEGF16520 ng/mL pre-treated for 72 h),and EMO treatment group(VEG
7、F165 20 ng/mL+EMO pre-treated for 72 h).Scratch test,Tran鄄swell chamber vertical migration and invasion assay were used to detect the horizontal migration,vertical migration and invasion abilityof each group of cells.Immunofluorescence assay was used to detect the expression of VEGF and Western Blot
8、 was used to detect thechanges of protein expression of VEGF,VEGFR2,ERK and SRC.Results摇 The viability of HUVECs(A value)decreased with theincrease of EMO concentration.The semi-inhibitory concentration(IC50)was calculated as 20郾 27 滋mol/L,and 20滋mol/L was usedas the best effective concentration of
9、EMO for subsequent experiments.The relative horizontal migration rate,vertical migration rateand invasion rate of the EMO treatment group were lower than those of the VEGF model group,and the differences were statisticallysignificant(P0郾 05).The immunofluorescence intensity of VEGF protein expressio
10、n in EMO treatment group was lower than that inVEGF model group.The protein expressions of VEGF,VEGFR2,ERK and SRC in EMO treatment group were lower than those inVEGF model group,and the differences were statistically significant(P0郾 05).Conclusion摇 EMO can effectively inhibit the prolif鄄eration,mig
11、ration and invasion of human umbilical vein endothelial cells induced by VEGF165,which may be achieved by inhibitingVEGF/VEGFR2/MAPK/ERK and VEGF/VEGFR2/SRC signaling pathways.Key words:emodin;age-related macular degeneration;VEGF;HUVEC;neovascularization33锦州医科大学学报J Jinzhou Medical University2023 Au
12、g.44(4)摇 摇 湿性年龄相关性黄斑变性(age-related macu鄄lar degeneration,ARMD)是发达国家中老年人失明的主要原因之一,主要病理表现为脉络膜新生血管(choroidalneovascularization,CNV)的 形成1-2。VEGF 抑 制 剂 雷 珠 单 抗 等 是 目 前 治 疗ARMD 的主要药物,需要多次玻璃体腔注射,具有临床治愈率低、易复发、费用高等缺点3-4。因此,急需为湿性 AMD 寻找更安全、更有效的替代治疗方案。大黄素(EMO)一种葸醌类物质,可以抑制炎症反应和肿瘤新生血管形成5-9。然而,目前 EMO 对 CNV 形成的影响尚
13、未被研究。人脐静脉内皮细胞(HUVECs)来源于新生儿的脐带组织,容易获取,没有伦理争议,且便于提取足量细胞10。它具有细胞成管的能力,容易建立实验模型,是体外研究血管内皮细胞功能的主要实验手段11。目前 EMO 研究主要集中在对 HUVECs 焦亡、炎症损伤的影响,对于 HUVECs 血管生成能力的影响却未见报道12-14。我们通过 VEGF165 体外诱导 HUVECs 模拟 ARMD 患者体内的新生血管状态,应用不同浓度的 EMO 进行干预,评价 EMO对人脐静脉内皮细胞的增殖、迁移及侵袭能力的影响。1摇 材料与方法1郾 1摇 材料大 黄 素(EMO,纯 度:HPLC 逸 98%,Z00
14、262)购自南京景竹生物科技有限公司;人脐静脉内皮细胞(HUVECs)购自河南北纳生物公司(BNCC342438);重组人血管内皮生长因子 165(VEGF165,P5561)、磷 酸 酶 抑 制 剂(50 伊,P1081)、PMSF(ST505)、超敏 ECL 化学发光试剂盒(P0018S)购自碧云天生物技术有限公司(上海);DMEM/F12 培养基(AH30012019)购自 cy鄄tiva(美国);胰蛋白酶(2522581)、青霉素-链霉素(J210031)、PBS 缓冲液(22305954)购自 HY鄄CLONE LABORATORIES(Logan,USA);胎牛血清(FBS)购 自
15、 NEWZERUM 公 司(新 西 兰,FBS-S011121);二甲亚砜(D5879)购自 Sigma-Aldrich(美国);MTT(Y23A8K42065)购 自 源 叶 生 物;ERK 抗体(AF0155)、SRC 抗体(AF6161)、VEGF抗体(AF5131)、P-VEGFR2 抗体(AF4426)购自Affinity Biosciences 公司(美国);Alexa Fluor 488兔抗小鼠多克隆抗体(GR3280065-1)购自美国Cell Signaling Technology 公 司;牛 血 清 蛋 白 V(80810511)购自 Solarbio 生命科学公司(美国
16、);Transwell 小室(14721085)购自 Corning Incorpo鄄rated(美国)。1郾 2摇 细胞培养HUVECs 在37 益、5%CO2培养箱中用含10%胎牛血清、1%青霉素链霉素混合液、89%DME/F-12 的完全培养基进行培养,细胞生长到对数期时进行传代。1郾 3摇 实验分组及处理将 HUVECs 随机分为对照组和大黄素浓度梯度处理组(5、10、15、20、25、30、35、40、50滋mol/L),通过 MTT 法确定大黄素的有效浓度范围和最佳作用浓度。根据有效浓度将 HUVECs 分为对照组、VEGF 模型组和 EMO 治疗组。VEGF165(20 ng/m
17、L)预 处 理 VEGF 模 型 组 细 胞 72 h,VEGF165(20 ng/mL)+EMO 预处理 EMO 治疗组细胞 72 h,对照组细胞采用完全培养基培养 72 h。1郾 4摇 细胞活力检测采用 MTT 法检测 HUVECs 细胞活力,将对数生长期的 HUVECs 接种在 96 孔板中,每个孔设置5 个重复孔,置于37 益细胞培养箱中培养24 h 后,每孔加入 20 滋L MTT(5 g/L),置于 37 益 培养箱中继续培养 4 h。停止培养后,吸出孔内液体,同时向每个孔加入 150 滋L DMSO15。将 96 孔板放在振荡器上震荡,待孔内结晶充分溶解后于酶标仪上490 nm
18、下测吸光度值,根据细胞活力确定 EMO 最佳作用浓度。1郾 5摇 细胞水平和垂直迁移实验1郾 5郾 1摇 细胞水平迁移实验将 HUVECs 接种于六孔板中,培养过夜至90%融合,用 1 mL 无菌移枪头划出宽度均匀的划痕,PBS 洗涤 3 次,培养箱孵育,分别在划痕 0、24 h 进行拍照,采用 Image-Pro-Plus 软件测量各组划痕宽度变化。1郾 5郾 2摇 细胞垂直迁移实验HUVECs 胰酶消化并计数,用无血清培养基重悬细胞,将细胞密度调整为 105个/毫升。在 Tran鄄swell 24 孔板的上室中加入 HUVECs 悬液 100 滋L,下室中加入含 10%血清的完全培养基 6
19、00 滋L。放入培养箱培养 24 h 后,擦去上室内未迁移的细胞。甲醇固定 10 min 后,将上室置于吉姆萨染色液中避光染色 30 min。将上室置于倒置显微镜下观察,取中间视野进行拍照(100伊),计算细胞迁移数目。1郾 5郾 3摇 细胞侵袭实验以下操作全程在冰上操作:将 Matrigel 基质胶43锦州医科大学学报摇 2023 年 8 月,44(4)用 F12 基础培养基以 1 颐 8 比例稀释,用已预冷的枪头吹打均匀,在预冷 Transwell 24 孔板的上室中加入60 滋L 基质胶,培养箱培养2 h。胰酶消化HU鄄VECs,将细胞密度调整为 1伊105个/毫升,上室加入 HUVEC
20、s 细胞悬液200 滋L,培养箱培养 24 h,擦去上室内未侵袭的细胞。甲醇固定 10 min 后,将上室置于吉姆萨染色液中避光染色30 min。将上室置于倒置显微镜下观察,取中间视野进行拍照(100伊),计算侵袭细胞数目。1郾 6摇 细胞免疫荧光染色将 HUVECs 接种于预先铺好盖玻片的六孔板中,培养 24 h。将细胞爬片在 4%多聚甲醛中固定30 min,0郾 5%Triton 作用 15 min,用 PBS 洗涤 3次。室温封闭 30 min,加入 VEGF 抗体,4 益孵育过夜。次日,用 Alexa Fluor 488 标记,在室温下孵育 1 h。孵育后用 PBS 洗涤细胞 3 次,
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 黄素 抑制 VEGF165 诱导 下人 静脉 内皮 细胞 增殖 迁移 侵袭 研究
![提示](https://www.zixin.com.cn/images/bang_tan.gif)
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。