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荧光检测在医学实验中的应用–复习题
第一章总论荧光的发生及基本检测原理
1何谓发光？
分子吸收辐射被激发后以光的形式释放，辐射跃迁而衰变回到电子基态→发光
2荧光与磷光的区别？
荧光：激发后马上发光，第一电子激发单重态辐射跃迁；延迟10-9～10-7秒后。基态S0→单重态S1、S2跃迁→基态。磷光：延迟时间长，几毫秒或更长10-3～10秒电子自旋未配对进入受激三重态，三重态→跃迁→基态
3完成良好荧光检测的有关条件？
1）选择相应的激发波长2）选择足够强度的激发光源，荧光强度与入射光强度成正比If＝φfI0(1-It/I0)；3）选择合适(QE)的发射波长检测器件；4）控制好样品制备与检测环境体系。
4荧光的种类
根据激发方式。1）光化发光2）化学荧光3）生物荧光。
按荧光素的标记过程可分为：1）免疫荧光2）组织荧光3）诱导荧光
5有哪几种荧光现象？
I次荧光现象：固有或自发荧光；一经辐射就可发出荧光的物质。II次荧光现象及荧光色素(标记物)又称继发荧光；样品分子不能或只能发出很弱的荧光，对此类分子需先经荧光色素标记结合或插入到不发光的大分子中去，根据荧光探针的荧光分析大分子。
6影响荧光强度（If）的因素
1光化分解：荧光物质吸收光能后，某些键断裂，导致荧光弱。制片时应避光。2荧光淬灭：（1）温度淬灭：加快震动弛豫而丧失振动能量；增加分子热运动高温荧光分子与液基环境中分子碰撞。温度适宜或低温。（2）浓度淬灭：浓度大时发光分子在样品中分布不均，深部的分子吸收不到光子，量子产额反而小。生成二聚体或多聚体，改变吸收光谱，If降低。（3）杂质淬灭：静态淬灭，杂质与荧光分子组成另一种化合物。环境净化。碰撞、转入三重态淬灭。3pH影响：破坏荧光物质环链结构，芳香族化合物的酸、碱功能团对pH敏感。
7半波宽定义：最大透光度Tmax波长1/2处对应的两波长差(λ1 -λ2)也称带宽(Bandwidth),带宽窄则光色纯。
第二章荧光成像检测
1光学显微镜分辨率定义及简易计算公式

2影响光学显微镜分辨率的主要因素？
影响分辨率的因素为衍射效应：圆斑像AIRY斑，阻碍分辨率。
3聚光镜与物镜孔径光阑的对应调节？
目的：产生与物镜相应的光束，使镜像的反差和焦深处于最佳状态。不同倍率物镜有不同的NA值，改换物镜聚光镜NA应做相应调节。观察：与物镜NA一致(100%)，以得到较好的分辨率；照像：相当于物镜NA的60~80%,以得到较好的反差、焦深。
4光学显微镜的有效放大＝所用物镜NA值的500～1000倍
5荧光量子效率（QE）
荧光量子效(产)率=放射量子数／吸收量子数
6医学实验中荧光检测常用的荧光检测传感器是哪两种？
1转换光学信号为电子信号-光学传感器,2彩色CCD
7显微镜照相术的定义?
将显微镜视场中的微观图像记录为放大图像的技术
8影响CCD成像效果的主要因素是什么?
温度和灵敏度，CCD工作时，表面会产生热量，使得在芯片形成暗电流，暗流将增加噪音、降低信噪比、导致降低成像质量。
9 CCD成像放大倍率的计算公式
显示或照片倍率＝OBJ倍率×光学适配器倍率×显示或照片对角线长度／CCD对角线长度
10荧光显微镜CCD成像与激光共焦显微镜成像的比较
数字CCD优点：价低，使用简便，成像块，测得FI同LSCM，彩色还原好，图像近于镜下，光化淬灭伤害小。Ratio测钙、使用TC板，适于标本：薄、层次简单。缺点：厚标本图像质量差，无光切功能，整合功能配置价格不菲
激光共焦扫描显微镜，优点：分辨率高，光切片，3D空间立体结构观测，集成荧光分析功能。缺点：成本高（专人、耗材），光化淬灭伤害较大
11免疫荧光染色的目的
将抗体标记上荧光素（如FITC、TRITC），与细胞内相应抗原（目标蛋白）结合后，通过观察、检测具有特征性的荧光，定性、定位及定量的显示和检测细胞内目的蛋白
12.免疫荧光染色常用方法
直接法、间接法和双标记法
13.影响免疫荧光染色结果的主要因素有
1）荧光染料标记的抗体的浓度，2）溶液的pH值，3）溶剂
14.举例说明自发荧光主要包括哪些
动物中一般为黄素类和卟啉类，植物中为叶绿素容易产生自发荧光。脂褐素的自发荧光，弹力蛋白和胶原UV激发下呈黄绿色荧光，培养死细胞很容易产生自发荧光。
15.免疫荧光染色前对细胞接种密度的要求
细胞密度：根据实验目的调整细胞接种密度。对细胞个体进行形态学观察以及定位荧光信号：细胞密度稍稀疏。使细胞充分伸展，显示出其应有的形态和结构；但也要注意保证视野内有一定数目的细胞，以便选取有代表性的细胞采图，要求细胞所占面积不低于视野的20%。
定量测定荧光强度（观察某种蛋白的表达量）：细胞密度应稍高。用于做大量细胞的统计定量，细胞至少要占到视野面积的80%；这时细胞要布满视野但相互之间还有空隙，细胞排列均匀，不聚堆拥挤，防止细胞间挤压变形，影响定量结果。达到通常所说的亚融合状态。
16荧光显微镜观察免疫荧光染色需要设置的对照及意义
正确设置对照组（非常必要）：1.阳性对照：已知抗原阳性的样品与待测样品同时进行免疫荧光染色，对照样品呈阳性结果，用于检验免疫荧光染色全过程是否符合要求，包括孵育温度、时间，一抗、二抗是否有问题，分析可能原因。如果阳性对照呈阴性，则说明实验过程有问题，需要对每个条件加以分析改进。2.阴性对照：已知抗原阴性的样品作对照，对照样品应呈阴性结果。包括空白对照（PBS代替一抗）和替代对照（非免疫血清代替一抗），用于排除非特异性染色。如果阴性对照呈阳性表达，同样检测样品的结果也是不可信的。3.不染色细胞空白组：不经免疫荧光染色，直接上机观察，用于检测由于细胞本身或固定造成的细胞自发荧光。
17共聚焦扫描显微镜（LCSM）光学成像原理
检测针孔和光源针孔始终聚焦于同一点，使聚焦平面以外被激发的荧光不能进入检测针孔--高分辨率的光学切片
18共聚焦扫描显微镜(LSCM)与传统荧光显微镜比较的优点
1）提高了敏感性及分辨率，2）扩大获取信息范围，3）实现了图像三维重建，4）客观记录荧光信息，5）同时显示多种标记物
19.定义：荧光漂白恢复(FRAP)：经荧光探针标记的细胞的某一区域一旦被高强度的激光照射后,荧光物质的光化学结构被破坏,荧光强度下降,但此处荧光强度会渐渐恢复,荧光强度和恢复的快慢和多少,代表周围分子扩散的速率,或分子运动速度。
20.定义：荧光共振能量转移(FRET)：受激态荧光素将其能量向另一个荧光素传递，使后者被激发，这一过程称荧光能量共振转移。能量的提供者叫供体荧光素，能量的接受者叫受体荧光素。
第三章荧光光度检测
1荧光分光光度计的构造示意图
光源→激发单色器→样品杯→发射单色器→检测器→电子放大及控制→显示
2微孔板荧光检测在医学实验的应用
1）利用报告基因检测目标基因的表达：将报告基因引入细胞DNA使之与某一特定分子事件相关，可以为这一分子事件带来可测性。通常检测的分子事件是基因功能，具有可测性的是发光。目前，市场上有许多发光报告基因出售。包括：萤火虫荧光素酶（firefly luciferase），β－半乳糖苷酶（B-galactosidase）等。2）ATP水平测定：所有活细胞都含有ATP。ATP可以从细胞中提取出来，用萤火虫荧光素酶检测。荧光强度与样品中ATP的含量成比例，相应的与提取ATP所用的细胞数成比例。可以检测样品中的所有微生物，因而被用于检测水中的大肠杆菌含量，用于药品，化妆品，牛奶以及其它食品的微生物控制，测定土壤和沉积物中的全部活生物含量，评价抗生素对微生物生长的影响，了解不同药物对哺乳动物细胞的影响等。3）离子测定：如细胞内钙离子测定。
3活细胞内钙离子浓度测定的方法
即从测量出的荧光信号中定量地计算出钙离子浓度。对于单波长激发或发射的荧光指示剂，可按下式计算[Ca2+]=Kd(F一Fmin)/(Fmax一F)，Kd：荧光剂与Ca2+形成配合物的解离常数，Fmin和Fmax为最小荧光强度和最大荧光强度。对于双波长的荧光指示剂，用率比值信号来计算细胞内游离Ca2+浓度，用下式计算细胞内游离Ca2+浓度，[Ca2+]=Kd(Fd/Fs)(R一Rmin)/(Rmax一R) Kd：荧光剂与Ca2+形成配合物的解离常数.Fd和Fs分别表示荧光剂没有结合Ca2+和被Ca2+饱和时的荧光强度.，R为实验观察到的荧光比值.
Rmin为细胞内荧光剂最小量结合Ca2+时的荧光比值.，Rmax为胞内荧光剂被Ca2+饱和时的荧光比值.
4 fura2指示剂测钙原理
Fura2:由紫外激发的一种率测量指示剂，因有较强的亲水性，难以进入细胞，在其负性基团部位结合上亲脂的乙酰羟甲基酯成为Fura-2/AM后，与细胞温孵时很容易透过细胞膜，胞浆内的酯酶可将Fura-2/AM水解成Fura-2而滞留在胞浆内，后者与胞内游离的钙离子结合形成Fura-2-钙离子复合物。当Fura-2与Ca2+结合后吸收峰发生改变，在最大和最小Ca2+浓度时,它的最大吸收峰分别在335nm和363nm处，在作率测量时，经常选用的波长是340nm和380nm；结合钙和游离钙形式Fura2的发射峰都是510nm，其发射光的强度与钙离子的浓度呈比例关系
第四章荧光细胞激活分选、分析
1简述流式细胞仪的工作原理
流式细胞仪的工作原理：将待测标本制备成单细胞悬液,经荧光染色后由气压装置送入流动室,流动室由样品管和鞘液管组成,鞘液管充满流动的鞘液,鞘液流与样品流压力不等,当两者压力差达到一定程度时,鞘液裹挟着样品流迫使细胞有序地排列成单列,逐个进入激光聚焦区。经激光束激发,产生散射光和荧光信号。通过一些波长选择通透性滤光片,即可将不同波长的散射光和荧光信号区分开来。散射光和荧光信号接收后转换成数字信号送计算机处理,可在计算机上直观地统计染上各种荧光染料的细胞各自的百分率。
2简述流式细胞仪的构造
1）流动室及液流驱动系统2）激光光源及光束成形系统3）光学系统4）信号检测与存贮、显示、分析系统5）细胞分选系统
3前向角散射定义(FSC，Forward Scatter)
前向角散射(FSC，Forward Scatter)：0°散射,与被测细胞的大小和面积有关，确切说与细胞直径的平方密切相关，通常在FCM应用中，选取FSC作阈值，来排除样品中的各种碎片及鞘液中的小颗粒，以避免对被测细胞干扰。
4侧向角散射定义(SSC，Side Scatter)
侧向角散射(SSC，Side Scatter)：90°散射,对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信息。
5试述Annexin V/PI染色应用流式细胞仪检测细胞凋亡的基本原理
基本原理：细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS暴露在细胞膜外表面。PS是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外。Annexin V是一种Ca2+依赖的磷脂结合蛋白,具有易于结合到磷脂类如PS的特性,对PS有高度的亲和性。该蛋白可充当敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS。
6简述PI（碘化丙啶）染色时出现细胞凋亡峰的原理
在凋亡细胞内，由于细胞核的解聚和凋亡小体的形成，核内的总DNA含量下降。由于在凋亡细胞内DNA含量下降，在G1峰前出现亚二倍体峰，称亚G1期峰，又称凋亡细胞峰。
7试述PI（碘化丙啶）染色应用流式细胞仪检测细胞周期的原理
碘化丙啶是一种双链DNA的荧光染料，可以和DNA结合，通过流式细胞术检测到的与DNA结合的PI的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。由于细胞周期各时相的DNA含量不同,通常正常细胞的G1／G0期具有二倍体细胞的DNA含量(2N),而G2/M期具有四倍体细胞的DNA含量(4N),而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。因此,通过流式细胞术PI染色法对细胞内DNA含量进行检测时,可以将细胞周期各时相区分为G1／G0期,S期和G2/M期,并可通过特殊软件计算各时相的百分率。
8流式细胞仪的细胞分选原理
流式细胞仪的分选功能是通过流束形成含有细胞的带电液滴而实现的。在流动室的喷嘴上装有一个超声振荡压电晶体片,该装置在充电后以每秒上万次的振动频率,使液束成为上万个液滴，待测细胞分散在这些液滴中。此时,细胞的荧光和散射光信号已被测量,经逻辑判断，给流束一个充电脉冲信号,小水滴就全部带上了正负不同的电荷，当液滴流经带有几千伏的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中。
9与其他分选方法相比流式细胞分选的特点
1）少量细胞分选时，流式细胞分选精度高，速度快。先进的流式分选速度可达25000个细胞/秒以上；一次分离的最大合理量为108次方个细胞。2）可以同时进行多个Marker分选，正选负选同时进行，也可以进行4路分选。3）不仅仅限于表面标记物，流式细胞仪可以根据任何能检测到的散射光（如细胞体积）或荧光（如DNA,?RNA或蛋白含量，酶活性，特异抗原）强度差异来分离细胞。4）如果只是偶尔做几次细胞分选的话，用流式细胞分选还是比较划算，只需准备样品和抗体，交纳一定的仪器使用费用即可，不需要购买配套的设备。
10同型对照
同型对照是使用与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同的免疫球蛋白及亚型的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性与细胞结合而产生的背景染色。同型对照是真正意义上的阴性对照，它不但可以用来设定流式细胞仪的电压，而且还可以帮忙省去昂贵与繁琐的重组细胞因子竞争封闭步骤
11侧群细胞：此类细胞能向不同类型和不同胚层的组织细胞分化,很可能代表了一群更原始的干细胞,且与干细胞的可塑性相关.
12 LCM技术的特点有哪些
激光器1.）单色性好，易于分离，2）.方向性好3）.亮度高，强度大4）.相干性、偏振性好。扫描器：1）分光镜：使激发光能到达样品，而发射光能通过分光镜进入后续的检测系统。2）.滤光镜：能够选择出一定波长范围的光进行检测。3）.检测针孔4）.PMT检测器
13 LCM技术的主要应用包括
激光共聚焦显微镜在生物医学中的应用：1）定量荧光测定，2）三维重建分析生物结构，3）动态观察生物结构，4.）荧光漂白恢复，5.）荧光共振能量转移
14 LEICA LMD6000型LCM系统工作原理
检测针孔和光源针孔始终聚焦于同一点，使聚焦平面以外被激发的荧光不能进入检测针孔--高分辨率的光学切片
15 LSCM使用免疫染色切片的目的
免疫荧光染色不佳的标本,用LSCM并不能获得更好的影像。原因:①检测针孔滤掉大部分光线,因此光量有限;②对染色不佳的标本,不得不将明亮度和对比度设置很高,这样在最终影像上引起光子噪声,形成颗粒化的图像。因此,适于LSCM的标本必须是免疫荧光染色切片。