当归芍药散对肝纤维化大鼠的干预作用及对TLR4通路的影响.pdf

当归芍药散对肝纤维化大鼠的干预作用及对 通路的影响王 雯胡传国梁伟林(.新疆维吾尔自治区人民医院新疆 乌鲁木齐.解放军总医院京西医疗区北京)摘要 目目的的 研究当归芍药散对四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化的影响并基于 样受体()通路探讨其可能作用机制 方方法法 取 只 大鼠随机选 只作为正常组其余大鼠采用腹腔注射四氯化碳 橄榄油法建立肝纤维化模型 将造模成功的大鼠随机分为肝纤维化组 组及当归芍药散低、中、高剂量组每组 只 当归芍药散低、中、高剂量分别给予./、/、/的当归芍药散灌胃 组腹腔注射/均 次/连续 周使用全自动生化分析仪测定血清谷丙转氨酶()、谷草转氨酶()、碱性磷酸酶()水平 法测定血清白细胞介素()、白细胞介素()、肿瘤坏死因子()水平及肝组织中型胶原()、型前胶原()、透明质酸()、层黏连蛋白()水平 染色进行肝组织病理学观察 法测定肝组织中、髓样分化因子()、肿瘤坏死因子受体相关蛋白()表达情况免疫组化法测定肝组织中、蛋白表达平均光密度值 法测定肝组织中、蛋白表达情况 结结果果 与正常组比较肝纤维化组大鼠血清、水平肝组织中 、水平肝组织中、及蛋白相对表达量和平均光密度值均显著升高(均.)肝组织炎症细胞浸润、纤维化增生与肝纤维化组比较当归芍药散各组及 组大鼠血清、水平肝组织中 、水平肝组织中、及蛋白相对表达量和平均光密度值均显著降低(均.)肝组织炎症细胞浸润和纤维化增生明显减轻且各项指标变化与当归芍药散的剂量呈依赖性 结结论论 当归芍药散能够显著改善肝纤维化大鼠肝功能抑制肝组织炎症修复肝组织纤维化其机制可能与调节 通路有关关键词 当归芍药散肝纤维化 样受体:./.中图分类号 文献标识码 文章编号 ()作者简介 王雯女本科研究方向为中西医结合内科通信作者 胡传国 :.基金项目 自治区卫生健康青年医学科技人才专项科研项目()第七批全国老中医药专家学术经验继承工作 (.):().().现代中西医结合杂志 ()./.()()()()()()()()()().(.)(.).:肝纤维化是临床中常见的肝脏疾病多见于病毒性肝炎、自身免疫性肝炎等患者 肝纤维化如不能及时得到治疗会进展为肝硬化甚至肝癌目前对于肝纤维化尚缺乏有效的治疗药物主要是改善肝功能、调节肝脏血流动力学等对症治疗但上述方法均不能有效遏止肝纤维化的进展所以肝纤维化治疗药物的研发仍是目前工作重点 研究发现 样受体()通路是肝纤维化发生及发展的关键信号通路其相关蛋白异常表达会促进肝组织胶原蛋白沉积等纤维化病理改变而调节 通路相关蛋白的表达能够抑制肝纤维化的进展 由此可见调节 通路可能是肝纤维化治疗的有效途径 当归芍药散是基于中医学理论由当归、芍药等组成的中药制剂近年来研究表明其对于肝纤维化具有一定的改善作用 然而其具体作用机制尚不明确 本实验基于 通路探讨了当归芍药散对肝纤维化大鼠的改善作用以进一步明确其药理作用机制 实验材料与方法 实验动物只健康清洁级雄性大鼠 周龄由广东省实验动物监测所提供实验动物生产许可证号:(粤)大鼠饲养于实验动物房温度 相对湿度 自然光照自然饮食 本实验经新疆维吾尔自治区人民医院伦理委员会审核批准()药品及试剂当归芍药散由中药配方颗粒当归(批号:)、芍药(批号:)、川芎(批号:)、茯苓(批号:)、白术(批号:)组成购自广东一方制药有限公司 (货号:美国 公司)大鼠白细胞介素 (货号:)、白细胞介素 (货号:)、肿瘤坏死因子 (货号:)试剂盒和 反应试剂盒(货号:)、二氨基联苯胺(货号:)购自碧云天生物科技有限公司型胶原()试剂盒(货号:上海江莱生物科技有限公司)型前胶原()试剂盒(货号:武汉菲恩生物科技有限公司)透明质酸()试剂盒(货号:上海广锐生物科技有限公司)层黏连蛋白()试剂盒(货号:南京森贝伽生物科技有限公司)染色试剂盒(货号:)、提取试剂盒(货号:)、过氧化物酶标记链霉素亲和素(货号:)、蛋白测定试剂盒(货号:)购自北京索莱宝科技有限公司辣根过氧化物酶标记山羊抗兔 (货号:现代中西医结合杂志 ()、兔多克隆抗体(货号:)、髓样分化因子()兔单克隆抗体(货号:)、肿瘤坏死因子受体相关蛋白()兔单克隆抗体(货号:)、兔单克隆抗体(货号:)购自艾博抗上海贸易有限公司 反转录试剂盒(货号:万类生物科技有限公司)引物设计及合成由赛默飞世尔科技有限公司完成 设备与仪器 全自动生化分析仪(西门子股份有限公司)台式冷冻离心机(德国 公司)凝胶成像仪(赛默飞世尔科技有限公司)梯度 仪(艾本德中国有限公司)荧光倒置显微镜(奥林巴斯销售服务有限公司)酶标仪(美谷分子仪器有限公司)实验方法随机取 只大鼠作为正常组其余大鼠参照文献方法建立肝纤维化模型:首次腹腔注射 的 橄榄油溶液 /随后按照 /隔日 次腹腔注射持续 周后随机取 只大鼠验证造模是否成功(以肝组织纤维增生视为造模成功)将造模成功大鼠随机分为肝纤维化组、组及当归芍药散低、中、高剂量组每 组只参考文献 确定当归芍药散给药剂量低、中、高剂量组分别按照./、/、/(以生药含量计)灌胃给予当归芍药散参考文献 组腹腔注射 /正常组和肝纤维化组给予生理盐水灌胃 各组干预均 次/连续 周 检测指标及方法 血 清 谷 丙 转 氨 酶()、谷 草 转 氨 酶()、碱性磷酸酶()水平 末次干预 后麻醉各组大鼠眼眶静脉丛取血于 条件下静置 后以 /速度 离心 使用全自动生化分析仪测定血清、水平 血清 、水平 腹主动脉取血分离血清按照试剂盒说明测定 、水平 肝组织中 、水平 取血后处死各组大鼠分离肝组织取部分肝组织研磨匀浆按照试剂盒说明测定肝组织匀浆液中 、水平 肝组织病理学表现取各组大鼠部分肝组织石蜡切片使用 铁苏木精染色 酸性乙醇分化 蒸馏水冲洗后 蓝化液染色 蒸馏水再次冲洗后丽春红染色 经磷钼酸溶液清洗后使用苯胺蓝染色 依次经梯度乙醇脱水、二甲苯透明处理中性树脂封片后置于显微镜下检查 肝组织中、表达情况 取各组大鼠部分肝组织提取总 并反转录为 根据试剂盒说明测定、表达量引物序列见表 反应程序为 预变性 变性 退火 延伸 进行 个循环 最终延伸 反应体系:正向、反向引物各 模版 加入蒸馏水补充体积至 表 各基因 检测引物序列基因正向引物序列反向引物序列引物长度/肝组织中、蛋白表达免疫组化染色及平均光密度值 取各组大鼠部分肝组织中性甲醛中固定 后使用石蜡包埋进行 切片依次脱蜡、水化、封闭液封闭、抗原修复后分别使用、兔抗体(稀释)和辣根过氧化物酶标记山羊抗兔抗体(稀释)孵育后 洗涤 次加入过氧化物 酶标记的链霉亲和素在 烘箱中孵育 再次使用 洗涤 次后使用二氨基联苯胺显色后依次复染、脱水、透明处理封片在显微镜下观察并拍照使用 .软件进行定量分析 肝组织中、蛋白表达情况 取各组大鼠部分肝组织提取总蛋白并进行定量使用凝胶电泳分离蛋白脱脂奶粉封闭后依次经、兔抗体(稀释)及辣根过氧化物酶标记山羊抗兔抗体(稀释)孵育后 化学发光液显影后用现代中西医结合杂志 ()凝胶成像系统成像使用 .处理图像并对各蛋白灰度值进行定量 统计学方法采用 .软件进行数据统计分析多组间比较采用单因素方差分析组间两两比较采用 检验.表示差异有统计学意义 结 果 各组大鼠血清、水平比较肝纤维化组血清、水平均明显高于正常组(均.)当归芍药散各组及 组血清、水平均明显低于肝纤维化组(均.)且当归芍药散低、中、高剂量组各指标水平呈剂量依赖性降低两两比较差异均有统计学意义(均.)见表 表 正常组和肝纤维化各组大鼠血清、水平比较(/)组别只数正常组.肝纤维化组.当归芍药散低剂量组.当归芍药散中剂量组.当归芍药散高剂量组.组.注:与正常组比较.与肝纤维化组比较.与当归芍药散低剂量组比较.与当归芍药散中剂量组比较 与当归芍药散高剂量组比较.各组大鼠血清 、水平比较 肝纤维化组血清 、水平均明显高于正常组(均.)当归芍药散各组及 组血清 、水平均明显低于肝纤维化组(均.)且当归芍药散低、中、高剂量组各指标水平呈剂量依赖性降低两两比较差异均有统计学意义(均.)见表 各组大鼠肝组织中 、水表 正常组和肝纤维化各组大鼠血清 、水平比较(/)组别只数 正常组.肝纤维化组.当归芍药散低剂量组.当归芍药散中剂量组.当归芍药散高剂量组.组.注:与正常组比较.与肝纤维化组比较.与当归芍药散低剂量组比较.与当归芍药散中剂量组比较 与当归芍药散高剂量组比较.平比较 肝纤维化组肝组织中 、水平均明显高于正常组(均.)当归芍药散各组及 组肝组织中 、水平均明显低于肝纤维化组(均.)且当归芍药散低、中、高剂量组各指标水平呈剂量依赖性降低两两比较差异均有统计学意义(均 )见表 各组大鼠肝组织病理学表现正常组大鼠肝组织无明显病理学改变肝纤维化组肝细胞排列不整齐炎症细胞浸润纤维化增生明显与肝纤维化组比较当归芍药散各组及 组肝组织中炎症细胞浸润和纤维化增生减轻肝组织细胞排列较整齐 见图 各组大鼠肝组织中、表达情况 肝纤维化组肝组织中、相对表达量均明显高于正常组(均 )当归芍药散各组及 组肝组织中、相对表达量均明显低于肝纤维化组(均.)且当归芍药散低、中、高剂量组、相对表达量呈剂量依赖性降低两两比较差异均有统计学意义(均.)见表 现代中西医结合杂志 ()表 正常组和肝纤维化各组大鼠肝组织中 、水平比较(/)组别只数 正常组.肝纤维化组.当归芍药散低剂量组.当归芍药散中剂量组.当归芍药散高剂量组.组.注:与正常组比较.与肝纤维化组比较.与当归芍药散低剂量组比较.与当归芍药散中剂量组比较 与当归芍药散高剂量组比较.图 正常组和肝纤维化各组大鼠肝组织病理学 染色表现()表 正常组和肝纤维化各组大鼠肝组织中、相对表达量比较()组别只数 正常组.肝纤维化组.当归芍药散低剂量组.当归芍药散中剂量组.当归芍药散高剂量组.组.注:与正常组比较.与肝纤维化组比较.与当归芍药散低剂量组比较.与当归芍药散中剂量组比较 与当归芍药散高剂量组比较.各组大鼠肝组织中、免疫组化染色表现及蛋白表达平均光密度值比较 肝纤维化组肝组织中、蛋白表达平均光密度值均明显高于正常组(均.)当归芍药 散 各 组 及 组 肝 组 织 中、蛋白表达平均光密度值均明显低于肝纤维化组(均.)且当归芍药散低、中、高剂量组、蛋白表达平均光密度值呈剂量依赖性降低两两比较差异均有统计学意义(均.)见图 及表 各组大鼠肝组织中、蛋白表 达情况比较肝纤维化组肝组织中、现代中西医结合杂志 ()图 正常组和肝纤维化各组大鼠肝组织中、蛋白表达免疫组化染色表现表 正常组和肝纤维化各组大鼠肝组织中、蛋白表达平均光密度值比较()组别只数正常组.肝纤维化组.当归芍药散低剂量组.当归芍药散中剂量组.当归芍药散高剂量组.组.注:与正常组比较.与肝纤维化组比较.与当归芍药散低剂量组比较.与当归芍药散中剂量组比较 与当归芍药散高剂量组比较.、蛋白相对表达量均明显高于正常组(均.)当归芍药散各组及 组肝组织中、蛋白相对表达量均明显低于肝纤维化组(均 .)且当归芍药散低、中、高剂量组、蛋白相对表达量呈剂量依赖性降低两两比较差异均有统计学意义(均.)见图 讨 论肝纤维化是由于病毒性肝炎、自身免疫性肝病、脂肪肝等多种肝脏疾病引起的肝组织细胞损伤进而导致肝组织在多种细胞因子的作用下出现结缔组织异常增生所致 临床中肝纤维化患者通常以食欲减退、慢性消化不良、消化道出血等为主要临床特征若不及时干预可能会进展为肝硬化严重影响现代中西医结合杂志 ()图 正常组和肝纤维化各组大鼠肝组织中、及 蛋白表达情况患者的生活质量同时随着肝纤维化的进展甚至可能发展为肝癌危及患者生命 目前对肝纤维化的治疗手段有限当归芍药散有健脾养血、利湿消肿等功效用于治疗肝脾两虚等病症 方中芍药为君药有柔肝缓脾、养血敛阴的功效白术、茯苓生血补气健脾运气为臣药当归养血活血川芎活血行气泽泻消肿祛湿、利水泄热 近年来临床及实验研究发现当归芍药散可改善肝纤维化如刘翔研究表明当归芍药散联合异甘草酸镁能够显著改善肝硬化患者肝脏纤维化降低患者口干、皮肤瘙痒、黄疸及乏力的发生率赖志红等研究发现当归芍药散能够显著降低肝硬化患者的门静脉血流量、门静脉主干及脾静脉内径改善血流动力学抑制肝纤维化的进展王雯等研究表明当归芍药散联合恩替卡韦较单独应用恩替卡韦能显著抑制肝炎患者的纤维化进展李文武等研究发现当归芍药散能保护肝组织细胞抑制胶原蛋白的产生进而显著减轻肝组织纤维化程度 由此可见当归芍药散在肝纤维化的治疗中具有较大潜力、及 是反映肝功能状态的临床常用指标这些指标水平升高提示肝组织细胞受损 、及 为常见的炎症因子参与肝纤维化的形成且这些指标水平与患者的肝纤维化程度呈正相关张海涛等发现降低肝纤维化患者血清 、水平能够提高肝纤维化的治疗效果 、及 是反映体内组织器官纤维化改变的重要指标参与肝纤维化的发生及进展下调肝组织中 、水平则能够抑制肝星状细胞的激活及胶原蛋白的沉积进而抑制肝纤维化进展 本实验结果表明肝纤维化大鼠血清、水平及肝组织中 、水平均显著升高而当归芍药散各组大鼠上述指标水平均明显降低提示当归芍药散能够显著改善大鼠肝功能抑制大鼠体内炎症反应和肝组织胶原沉积进而抑制肝组织纤维化的发生发展 通路是近年来发现的与肝纤维化进展密切相关的重要信号通路 在被病毒、炎症因子等激活后通过 及 等蛋白进行信号传导进而参与多种级联反应 王海兰等研究发现 及 水平的升高会激活肝星状细胞进而导致肝纤维化的发生庄子锐等研究证实下调 及 表达能够显著抑制肝纤维化的发生及进展王明亮等研究表明、水平的升高会激活肝星状细胞进而导致细胞外基质沉积进而参与肝纤维化及肝组织炎症的发生 由此可见调节 通路可能是治疗肝纤维化的有效途径和手段 是目前实验室常用的 通路抑制剂因此本实验使用 作为阳性对照药物 本实验结果表明肝纤维化组大鼠肝组织中、及蛋白表达量和平均光密度值明显升高当归芍药散各组大鼠肝组织中、及蛋白表达量和平均光密度值均明显降低且呈依赖现代中西医结合杂志 ()性降低 提示当归芍药散能够剂量依赖性地抑制 通路的激活进而抑制肝纤维化的发生及进展综上所述当归芍药散能够改善肝纤维化大鼠肝功能抑制肝组织炎症改变和肝组织纤维化其机制可能与调节 通路有关利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突参考文献 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