大蒜辣素对肉鸡肝组织中CYP1A 2 mRNA表达及其酶动力学的影响.pdf

畜牧兽医学报 2 0 2 3,5 4(9):3 9 0 5-3 9 1 5A c t a V e t e r i n a r i a e t Z o o t e c h n i c a S i n i c ad o i:1 0.1 1 8 4 3/j.i s s n.0 3 6 6-6 9 6 4.2 0 2 3.0 9.0 2 9开放科学(资源服务)标识码(O S I D):大蒜辣素对肉鸡肝组织中C Y P1A2 m R N A表达及其酶动力学的影响 袁何玲1,方 词1,黄金虎1,王晓明1,肖文浚2,3,刘睿婷2,3,史荣梅2,3,王丽平1*(1.南京农业大学动物医学学院,南京 2 1 0 0 9 5;2.新疆医科大学 药学院,乌鲁木齐 8 3 0 0 1 7;3.新疆大蒜药用研究重点实验室,乌鲁木齐 8 3 0 0 1 3)摘 要:大蒜辣素(a l l i c i n)具有较好的抗菌、抗氧化等活性,有望作为一种抗生素替代品用于畜禽养殖业,但其对肝药物代谢酶的影响尚不清楚。本研究旨在探究大蒜辣素对肉鸡C Y P 1 A 2酶活性、编码基因的mR NA表达和酶动力学的影响,为其在生产实践中的合理使用提供参考。9 0只1日龄AA肉鸡适应性饲养4 d后随机分为对照组(基础日粮组)、大蒜辣素低剂量组(4 0 m gk g-1)和高剂量组(8 0 m gk g-1),处理组每天2次、连续4 2 d于饲料中添加大蒜辣素。给药后第1 4、2 8 和4 2天时每组分别随机采集1 0只鸡肝组织,钙离子沉淀法提取肝微粒体,检测大蒜辣素对C Y P 1 A 2酶活性的影响;采用r e a l t i m e R T-P C R方法检测大蒜辣素对C Y P1A2和核受体C X R mR NA表达的影响;进一步采用体外探针药物法测定了大蒜辣素对 C Y P 1 A 2酶的抑制动力学参数。添加不同浓度大蒜辣素第1 4和2 8天,肉鸡肝微粒体中C Y P 1 A 2酶活性分别显著增加为对照组的1.2倍和1.4倍(P0.0 5);而在第4 2天时低剂量和高剂量大蒜辣素分别使C Y P 1 A 2酶活性极显著减少至对照组的8 0%和6 2%(P0.0 0 1)。大蒜辣素处理组对C Y P1A2和C X R mR NA表达量与酶活性的影响趋势基本一致。体外试验结果显示,大蒜辣素对C Y P 1 A 2的半数抑制浓度(I C5 0)为1 8.8 7 m o lL-1,抑制常数(Ki)为1 0.8 9 m o lL-1,并对C Y P 1 A 2呈现为非竞争性抑制作用,且其对C Y P 1 A 2酶活性的抑制作用呈现一定的时间和浓度依赖性。大蒜辣素可对C Y P 1 A 2酶活性及其编码基因的mR NA表达均产生影响,且表现为双向作用。该研究结果提示,大蒜辣素长期应用会对肉鸡C Y P 1 A 2产生影响,临床应注意其介导的药物间相互作用,避免产生不良反应。关键词:大蒜辣素;肝微粒体;肉鸡;C Y P 1 A 2;酶动力学中图分类号:S 8 3 1.5 文献标志码:A 文章编号:0 3 6 6-6 9 6 4(2 0 2 3)0 9-3 9 0 5-1 1收稿日期:2 0 2 2-1 2-1 6基金项目:江苏省自主创新项目C X(2 2)3 0 3 9作者简介:袁何玲(1 9 9 9-),女,河南周口人,硕士生,主要从事兽医药理和毒理学研究,E-m a i l:1 8 3 3 6 0 6 0 3 9 11 6 3.c o m*通信作者:王丽平,主要从事兽医药理和毒理学研究,E-m a i l:w l p 7 11 6 3.c o mE f f e c t s o f A l l i c i n o n m R N A E x p r e s s i o n o f C Y P1A2 a n d I t s E n z y m e K i n e t i c s i n B r o i l e r s L i v e r T i s s u eYUAN H e l i n g1,F ANG C i1,HUANG J i n h u1,WANG X i a o m i n g1,X I AO W e n j u n2,3,L I U R u i t i n g2,3,S H I R o n g m e i2,3,WANG L i p i n g1*(1.C o l l e g e o f V e t e r i n a r y M e d i c i n e,N a n j i n g A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y,N a n j i n g 2 1 0 0 9 5,C h i n a;2.C o l l e g e o f P h a r m a c y,X i n j i a n g M e d i c a l U n i v e r s i t y,U r u m q i 8 3 0 0 1 7,C h i n a;3.K e y L a b o r a t o r y o f G a r l i c M e d i c i n a l R e s e a r c h i n X i n j i a n g,U r u m u q i 8 3 0 0 1 3,C h i n a)A b s t r a c t:A l l i c i n h a s g o o d a n t i b a c t e r i a l a n d a n t i o x i d a n t a c t i v i t i e s,a n d i s e x p e c t e d t o b e u s e d a s a s u b s t i t u t e f o r a n t i b i o t i c s i n t h e l i v e s t o c k a n d p o u l t r y i n d u s t r y,h o w e v e r,i t s e f f e c t o n h e p a t i c d r u g e n z y m e(C Y P)r e m a i n s u n k n o w n.T h e s t u d y w a s t o i n v e s t i g a t e t h e e f f e c t s o f a l l i c i n o n C Y P 1 A 2 e n z y m e a c t i v i t y,mR NA e x p r e s s i o n o f c o d i n g g e n e a n d e n z y m e k i n e t i c s i n b r o i l e r s,a n d t o p r o v i d e 畜 牧 兽 医 学 报5 4卷 a f u r t h e r r e f e r e n c e f o r i t s r a t i o n a l u s e i n p r o d u c t i o n p r a c t i c e.N i n e t y o n e-d a y-o l d A r b o r A c r e s(AA)b r o i l e r s w e r e r a n d o m l y d i v i d e d i n t o c o n t r o l g r o u p(b a s a l d i e t g r o u p),l o w-d o s e a l l i c i n g r o u p(4 0 m gk g-1)a n d h i g h-d o s e a l l i c i n g r o u p(8 0 m gk g-1)a f t e r 4 d a y s o f a d a p t i v e b r e e d i n g.T h e t r e a t m e n t g r o u p s w e r e f e d w i t h a l l i c i n t w i c e a d a y f o r 4 2 c o n s e c u t i v e d a y s.O n t h e 1 4 t h,2 8 t h,a n d 4 2 n d d a y a f t e r t r e a t m e n t o f a l l i c i n,1 0 c h i c k e n s f r o m e a c h g r o u p w e r e r a n d o m l y s e l e c t-e d,r e s p e c t i v e l y a n d l i v e r m i c r o s o m e s w e r e e x t r a c t e d b y c a l c i u m i o n p r e c i p i t a t i o n m e t h o d t o d e t e c t t h e e f f e c t s o f a l l i c i n o n C Y P 1 A 2 e n z y m e a c t i v i t y a n d e n z y m e k i n e t i c s p a r a m e t e r s.T h e mR NA e x p r e s s i o n o f C Y P1A2 a n d n u c l e a r r e c e p t o r e n c o d i n g g e n e C X R w e r e d e t e c t e d b y r e a l t i m e R T-P C R.A l l i c i n(4 0 m gk g-1,a n d 8 0 m gk g-1)s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d t h e p r o d u c t i o n o f a c e t a m i n o p h e n,t h e m e t a b o l i t e p h e n a c e t i n c a t a l y z e d b y C Y P 1 A 2,o n t h e 1 4 t h a n d 2 8 t h e d a y a f t e r t r e a t m e n t b y 1.2 t i m e s a n d 1.4 t i m e s o f t h e c o n t r o l g r o u p,r e s p e c t i v e l y(P0.0 5),h o w e v e r,t h e p r o d u c t i o n o f a c e t a m i n o p h e n o n t h e 4 2 n d d a y,w e r e s i g n i f i c a n t l y d e c r e a s e d t o 8 0%a n d 6 2%o f t h e c o n t r o l g r o u p,r e s p e c t i v e l y(P9 8%)购自上海源叶生物科技有限公司;R NA-e a s y I s o l a t i o n R e a-g e n t(R 7 0 1)、R e v e r s e-t r a n s c r i b e d t o c D NA(V a z y m e R 2 2 3-0 1)和C h a mQ q P C R S Y B R G r e e n M a s t e r M i x(Q 3 1 1-0 2/0 3)均购自南京诺唯赞生物科技有限公司。1.3 方法1.3.1 肉鸡分组及处理 9 0只1日龄AA肉鸡,适应性饲养4 d后,随机分为3组,分别为对照组、大蒜辣素处理组(4 0和8 0 m gk g-1),每组肉鸡等分为3批,于给药后不同时间点采集肝组织用于制备微粒体并提取肝总R NA。试验具体分组和处理情况见图1所示。图1 动物分组与处理F i g.1 G r o u p i n g a n d p r o c e s s i n g o f a n i m a l s1.3.2 鸡肝微粒体的制备 参考刘婉玉等1 5的钙离子沉淀法制备肝微粒体。将冻存的肝组织置于研钵中(液氮)研磨后称重,按照肝重蔗糖溶液为1 4的比 例 加 入0.2 5 m o lL-1蔗 糖 溶 液 后 匀 浆5 m i n(在冰上进行)。制备好的肝匀浆液于4、1 2 0 0 0 rm i n-1离心1 5 m i n,取上清液,按照体积比1 0 1加入浓度为8 8 mm o lL-1的C a C l2溶液,置于冰水浴中轻搅混匀5 m i n,然后再于1 2 0 0 0 rm i n-1、4离心1 5 m i n后,取沉淀,用0.0 5 m o lL-1、p H 7.4的T r i s-HC l缓冲液冲洗沉淀(除去多余的钙离7093畜 牧 兽 医 学 报5 4卷 子)并重悬,1 2 0 0 0 rm i n-1、4离心1 5 m i n,再次重悬离心后取沉淀,用含2 0%甘油的T r i s-HC L缓冲液重悬,保存至-8 0冰箱备用。1.3.3 H P L C检测鸡肝微粒体中对乙酰氨基酚1.3.3.1 样品的前处理及H P L C检测条件的确定:样品的前处理:样品加入5 5 L冰乙腈后立即置于-2 0冰箱中终止反应,1 2 0 0 0 rm i n-1、4,离心1 5 m i n,取上清 过0.2 2 m滤膜,用 于H P L C分析。优化的H P L C检测条件:色谱柱为D i a m o n s i l砖石 代C 1 8(5 m,2 5 0 mm4.6 mm),柱温为室温,进样量 为2 0 L。流 动 相 为 水(A)和 甲 醇(B),流速为1 m Lm i n-1,流动相比例为A B=5 5 4 5,检测波长为2 5 4 n m。1.3.3.2 标准曲线、检测限和定量限的测定:取灭活的空白鸡肝微粒体1 0 L,分别加入2.5 L系列浓度的对乙酰氨基酚标准溶液,配制成浓度为0.0 0 5、0.0 1、0.0 2、0.0 4、0.1、0.2、0.4和0.8 mm o LL-1的对乙酰氨基酚,再加入5 L 5 0 mm o lL-1 NA D-P H溶液,最后用T r i s-HC L溶液补足至2 5 0 L,涡旋混匀后于4 1 振荡摇床中孵育4 0 m i n,按 照“1.3.3.1”方法处理样品。分别以对乙酰氨基酚的浓度为横坐标,峰面积为纵坐标绘制标准曲线,并计算相关系数。选择低浓度对乙酰氨基酚的样品,经前处理之后,将样品测定3次,不同时间内重复上述3次,取9次测定结果的均值S和N,以信噪比S/N3时 样 品 的 最 低 浓 度 为 该 方 法 的 检 测 限(L O D),以达到信噪比S/N1 0时样品的最低浓度为该方法的定量限(L OQ)。1.3.3.3 准确度和精密度的测定:取灭活的空白鸡肝微粒体1 0 L,加入系列浓度的对乙酰氨基酚标准溶液配成终浓度0.0 3、0.1 0和0.6 0 mm o lL-1后,加入5 L NA D P H溶液,用T r i s-HC l溶液补足至2 5 0 L,涡旋混匀后,于4 1振荡摇床中孵育4 0 m i n后取出,按照“1.3.3.1”方法处理样品。日内不同时间每个浓度重复3次,连续测定3 d,分别计算日内和日间变异系数,并代入标准曲线计算回收率(%)。如果日内相对标准偏差(R S D)和日间R S D均小于1 5%,则符合生物样品定量检测的要求。1.3.4 大蒜辣素处理对肉鸡C Y P 1 A 2酶活性的影响 分别将对照组、4 0和8 0 m gk g-1大蒜辣素处理组肝微粒体于冰上解冻,每组各取1 0 L微粒体混合液置于2 m L E P管内,加入探针底物非那西丁,用T r i s-HC L溶液补足至2 4 5 L,4 1振荡预孵育5 m i n后,加入5 L NA D P H启动反应(微粒体孵育总体系为2 5 0 L),继续在4 1振荡孵育4 0 m i n后取出,按照“1.3.3.1”方法处理样品,以对乙酰氨基酚的生成量反映C Y P 1 A 2酶活性的变化。每次测定均设置5个平行。1.3.5 大蒜辣素 处理 对 肉 鸡C Y P1A2 和C X R mR NA表达的影响 按照R NA提取试剂说明书提取肝总R N A,测定A2 6 0 n m/A2 8 0 n m比 值 为1.82.0以 及A2 6 0 n m/A2 3 0 n m比值大于2.0。按照反转录试剂盒说明书操作将R NA反 转 成c D NA,依 次 加 入2C h a mQ S Y B R q P C R M a s t e r M i x、特异性引物及d d H2O涡旋混匀并离心之后进行c D NA扩增(注意避光操作)。内参-a c t i n基因和目的基因C Y P1A2、C X R的上下游引物均用P r i m e r 5软件设计,由擎科生物科技有限公司合成。引物序列如表1所示。目的基因的mR NA相对表达量采用2-C t法计算1 6。表1 目的基因及内参基因的引物序列T a b l e 1 P r i m e r s e q u e n c e s o f t a r g e t g e n e s a n d r e f e r e n c e g e n e s基因G e n e引物序列(5 3)P r i m e r s e p u e n c e-a c t i nF:T T G G C G C T T G A C T C AG G A T TR:T A GAA C T T T G G G G G C G T T C GC Y P1A2F:C A C C A C G C T T C C C C T T AG T TR:C AG GA G C AG G C A G AAAG T G GC X RF:C A T T G A C C A G C T G C AG G AG AR:C A G C A G T T T G G C G T AG AG G A1.3.6 大蒜辣素对C Y P 1 A 2酶动力学的影响 1.3.6.1 -萘黄酮和大蒜辣素对C Y P 1 A 2酶的半数抑制浓度(I C5 0)测定:鸡肝微粒体孵育总体系为2 5 0 L。取1 0 L空白微粒体混合液置于2 m L E P管中,加入底物非那西丁和系列浓度-萘黄酮或大蒜辣素后,具体操作如“1.3.4”方法所述,孵育体系中-萘黄酮的终浓度分别是0.0 5、0.1、0.2、0.5、0.8、1.0、2.0和5.0 m o lL-1;大蒜辣素的终浓度分别是5、1 0、2 5、5 0、1 0 0和2 0 0 m o lL-1。以剩余肝C Y P 1 A 2的活性作为纵坐标,-萘黄酮或大蒜辣素浓度的对数 作为横坐标 绘图。采用G r a p h P a d P r i s m 9软件计算抑制作用的I C5 0,每次测定均设置3个平行。1.3.6.2 -萘黄酮和大蒜辣素对C Y P 1 A 2酶的抑8093 9期袁何玲等:大蒜辣素对肉鸡肝组织中C Y P1A2 mR NA表达及其酶动力学的影响 制常数(Ki)测定:鸡肝微粒体孵育同“1.3.6.1”方法所述,孵育体系中-萘黄酮的终浓度为0.1 0和0.5 0 m o lL-1;大蒜辣 素的终浓度 为1 0、2 0和4 0 m o lL-1;探针非那西丁的浓度分别是2 5、5 0、1 0 0、1 5 0和2 0 0 m o lL-1。并对酶动力学数据采用L i n e w e a v e r-B u r k双倒数作图法进行非线性曲线拟合,确定抑制类型,采用G r a p h P a d软件计算Ki值。每次测定均设置3个平行。1.3.6.3 大蒜辣素在不同处理时间和浓度时对C Y P 1 A 2抑 制 作 用 的 影 响:鸡 肝 微 粒 体 孵 育 同“1.3.6.1”方法,孵育体系中大蒜辣素的终浓度分别是1 0、2 0和4 0 m o lL-1,预孵育时间分别为0、5、1 5和3 0 m i n。分别以预孵育时间为横坐标,剩余肝C Y P 1 A 2的活性为纵坐标,运用G r a p h P a d作图,得到预孵育时间-酶活性-抑制剂浓度的关系。每次测定均设置3个平行。1.3.7 数 据 分 析 各 组 间 显 著 性 差 异 采 用G r a p h P a d软 件 进 行 单 因 素 方 差 分 析。*.P0.0 5;*.P0.0 1;*.P0.0 0 1。2 结 果2.1 对乙酰氨基酚的H P L C方法学考察2.1.1 专属性 经优化处理之后,获得了鸡肝微粒体样品中非那西丁及其代谢产物对乙酰氨基酚的H P L C最佳检测条件。结果如图2所示,待测药物与杂质峰分离良好,表明该法的特异性和专一性良好,对乙酰氨基酚和非那西丁的出峰时间分别为3.2 2和1 0.9 0 m i n。A.空白肝微粒体;B.流动相加入标准品(对乙酰氨基酚1 0 0 m o lL-1,非那西丁5 0 m o lL-1);C.空白肝微粒体加入标准品(对乙酰氨基酚1 0 m o lL-1,非那西丁2 0 0 m o lL-1)。1和3.对乙酰氨基酚;2和4.非那西丁A.B l a n k l i v e r m i c r o s o m e;B.M o b i l e p h a s e a d d e d w i t h s t a n d a r d s u b s t a n c e(a c e t a m i n o p h e n 1 0 0 m o lL-1,p h e n a c e t i n 5 0 m o lL-1);C.B l a n k l i v e r m i c r o s o m e s a d d e d w i t h s t a n d a r d s u b s t a n c e(a c e t a m i n o p h e n 1 0 m o lL-1,p h e n a c e t i n 5 0 m o lL-1).1 a n d 3.A c e t a m i n o p h e n;2 a n d 4.P h e n a c e t i n图2 空白鸡肝微粒体中非那西丁和对乙酰氨基酚的色谱图F i g.2 C h r o m a t o g r a m o f p h e n a c e t i n a n d a c e t a m i n o p h e n i n b l a n k c h i c k e n l i v e r m i c r o s o m e s2.1.2 标准曲线方程及检测限和定量限 如图3所示,在0.0 10.8 0 mm o lL-1,对乙酰氨基9093畜 牧 兽 医 学 报5 4卷 酚浓度与峰面积的线性关系良好,标准曲线回归方程为y=6.5 9 5 1x-0.0 5 7 0,R2=0.9 9 9 4。对乙酰氨基酚的检测限(L O D)和定量限(L OQ)分别为0.0 0 5和0.0 1 mm o lL-1。图3 对乙酰氨基酚的标准曲线F i g.3 T h e s t a n d a r d c u r v e o f a c e t a m i n o p h e n2.1.3 准确度和精密度 如表2所示,鸡肝微粒体中对乙酰氨基酚回收率为9 4.6 1%9 6.3 2%,日内R S D2.8 5%,日间R S D1 4.8 3%,均符合生物样品的测定要求。2.2 大蒜辣素对肉鸡肝C Y P 1 A 2酶活性的影响大蒜 辣 素 对 肉 鸡C Y P 1 A 2酶 活 性 的 影 响 见图4。添加不同浓度大蒜辣素第1 4和2 8天时,肉鸡肝微粒体中C Y P 1 A 2酶活性分别显著增加为对照组的1.2倍和1.4倍(P0.0 5),但第4 2天时4 0和8 0 m gk g-1大蒜辣素分别使C Y P 1 A 2酶活性极显著下降至对照组的8 0%和6 2%(P0.0 0 1)。该结果提示大蒜辣素对肉鸡C Y P 4 5 0酶活性的影响呈现双向作用。表2 对乙酰氨基酚在鸡肝微粒体中的准确度和精密度(n=5)T a b l e 2 A c c u r a c y a n d p r e c i s i o n o f a c e t a m i n o p h e n i n c h i c k e n l i v e r m i c r o s o m e s (n=5)药物D r u g浓度/(mm o lL-1)C o n c e n t r a t i o n日内R S D/%I n t r a d a y R S D日间R S D/%I n t e r d a y R S D回收率(xsx)/%A c c u r a c y(xsx)对乙酰氨基酚A c e t a m i n o p h e n0.0 32.8 51 4.8 39 4.7 80.2 20.1 01.8 49.3 69 4.6 11.1 10.6 02.8 52.0 69 6.3 21.4 6结果用“xsx”表 示,下 同。*.P0.0 5,*.P0.0 1,*.P0.0 0 1T h e r e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s“xsx”,t h e s a m e a s b e l o w.*.P0.0 5,*.P0.0 1,*.P0.0 0 1图4 大蒜辣素对肉鸡C Y P 1 A 2酶活性的影响(n=5)F i g.4 E f f e c t o f a l l i c i n o n C Y P 1 A 2 e n z y m e a c t i v i t y o f b r o i l e r s(n=5)2.3 大 蒜 辣 素 对 肉 鸡 肝 组 织C Y P1A2和C X R m R N A表达的影响 R T-q P C R检测肝组织中C Y P1A2和C X R的基因表达情况如图5所示。结果显示不同浓度大蒜辣素分别处理肉鸡后第1 4 和2 8天时,高剂量(8 0 m gk g-1)大蒜辣素可使C Y P1A2基因的mR NA表达量分别极显 著 上 升 为 对 照 组 的1.8倍 和4.0倍(P0.0 5),第4 2天时,高剂量和低剂量大蒜辣素处理组C Y P1A2基因的表达量均显著下调为对照组的5 0%(P0.0 5;P0.0 1);大蒜辣素对肉鸡肝C X R的mR NA表达量影响呈现与C Y P1A2相似情况,即8 0 m gk g-1大蒜辣素处理肉鸡后第1 4 和2 8天时,C X R基因的表达量均显著上调(为对照组的1.8倍)(P0.0 5),而在第4 2天时,4 0和8 0 m gk g-1大蒜辣素处理组C X R基因的表达量均极显著下调(P0.0 1),为对照组的5 0%。0193 9期袁何玲等:大蒜辣素对肉鸡肝组织中C Y P1A2 mR NA表达及其酶动力学的影响*.P0.0 5,*.P0.0 1,*.P0.0 5图5 大蒜辣素对肉鸡C Y P1A2和C X R m R N A表达的影响(n=6)F i g.5 E f f e c t s o f a l l i c i n o n C Y P1A2 a n d C X R m R N A e x p r e s-s i o n i n b r o i l e r s(n=6)2.4 大蒜辣素对C Y P 1 A 2底物非那西丁O-脱乙基化活性的半数抑制浓度(I C5 0)图6 A和B分别为C Y P 1 A 2的经典抑制剂-萘黄酮和大蒜辣素对C Y P 1 A 2 抑制作用的拟合抑制曲线。计算可得-萘黄酮对C Y P 1 A 2的I C5 0值为0.2 9 m o lL-1,表现为较强的抑制作用,对量效关系进行线性回归,-萘黄酮对数浓度在-1.00.3范围内呈现良好的线性关系,线性回归方程为y=-4 5.9 1x+2 0.3 0,R2=0.9 9(图6 C)。在此条件下,测得大蒜辣素的I C5 0值为1 8.8 7 m o lL-1,大蒜辣素浓度在0.6 9 91.6 9 9范围内呈现良好的线性 关 系,线 性 回 归 方 程 为y=-7 5.1 8x+1 5 3.1 0,R2=0.9 8(图6 D)。2.5 大蒜辣素对非那西丁O-脱乙基化活性的抑制常数(Ki)图7(A和C)是-萘 黄 酮 和 大 蒜 辣 素 对C Y P 1 A 2抑制曲线采用L i n e w e a v e r-B u r k 双倒数法作图获得的直线。结果显示直线均相交于X轴。当无抑制剂时,非那西丁O-脱乙基化活性的最大反应速率Vm a x为(1 6.0 30.3 4)n m o l(m gm i n)-1,图6 -萘黄酮(A、C)和大蒜辣素(B、D)对鸡C Y P 1 A 2活性的抑制曲线(n=3)F i g.6 I n h i b i t o r y e f f e c t o f -n a p h t h o f l a v o n e(A,C)a n d a l l i c i n(B,D)o n C Y P 1 A 2 a c t i v i t y o f c h i c k e n(n=3)1193畜 牧 兽 医 学 报5 4卷 当有抑制剂-萘黄酮和大蒜辣素存在时,Vm a x随抑制剂浓度增加而变小,米氏常数Km均保持不变,为(1 2 8.5 74.3 6)m o lL-1,表明-萘黄酮和大蒜辣素对鸡肝微粒体C Y P 1 A 2的抑制作用类型为非竞争性抑制。采用Km/Vm a x和抑制剂浓度作线性回归,计算-萘黄酮和大蒜辣素对非那西丁O-脱乙基反应的抑制常数Ki分别为0.9 7 m o lL-1(图7 B)和1 0.8 9 m o lL-1(图7 D)。图7 -萘黄酮(A,B)和大蒜辣素(C,D)对鸡C Y P 1 A 2抑制曲线的L i n e w e a v e r-B u r k图及Ki转换图(n=3)F i g.7 L i n e w e a v e r-B u r k p l o t a n d K i t r a n s f o r m a t i o n o f t h e i n h i b i t i o n c u r v e s o f c h i c k e n C Y P 1 A 2 b y -n a p h t h o f l a v o n e(A,B)a n d a l l i c i n(C,D)(n=3)2.6 大 蒜 辣 素 在 不 同 处 理 时 间 和 浓 度 下 对C Y P 1 A 2抑制作用的影响 图8显示,不同浓度大蒜辣素与鸡肝微粒体预孵育不同时间时,其对鸡肝微粒体代谢非那西丁O-脱乙基化活性的抑制作用。图8 A显示,同一浓度大蒜辣素处理时,C Y P 1 A 2剩余酶活性随预孵育时 间的增加而极显著降低(P0.0 0 1),呈现时间依赖性;图8 B显示,预孵育时间相同时,C Y P 1 A 2剩余酶活性随大蒜辣素浓度的增加而极显著降低(P0.0 0 1),且呈浓度依赖性。该结果提示大蒜辣素对鸡肝微粒体C Y P 1 A 2的抑制作用表现为时间和浓度依赖性。对乙酰氨基酚的生成量与对照组的百分比表示C Y P 1 A 2剩余酶活性。*.P0.0 1,*.P0.0 5T h e a m o u n t o f a c e t a m i n o p h e n p r o d u c e d a s a p e r c e n t a g e o f t h e c o n t r o l r e p r e s e n t s t h e r e m a i n i n g C Y P 1 A 2 e n z y m e a c t i v i t y.*.P0.0 1,*.P0.0 5图8 大蒜辣素在不同处理时间(A)和浓度(B)下对鸡C Y P 1 A 2抑制作用的影响(n=3)F i g.8 E f f e c t o f a l l i c i n o n C Y P 1 A 2 i n h i b i t i o n i n c h i c k e n s a t d i f f e r e n t t r e a t m e n t t i m e s(A)a n d c o n c e n t r a t i o n s(B)(n=3)2193 9期袁何玲等:大蒜辣素对肉鸡肝组织中C Y P1A2 mR NA表达及其酶动力学的影响 3 讨 论研究已证实兽医临床中因C Y P 4 5 0介导药物间相互作用发生而导致严重不良反应,如泰妙菌素、泰乐菌素等与聚醚类抗生素在家禽联用时,因前者可抑制C Y P 4 5 0酶活性导致聚醚类抗生素代谢障碍引起鸡中毒甚至死亡1 7。除此之外,红霉素、诺氟沙星、依诺沙星、柚子汁等对C Y P 1 A 2具有显著抑制作用1 8-1 9。通常情况下,酶抑制所导致的药物间相互作用要远大于酶促反应,约占酶系统全部作用的7 0%左右2 0。因此新兽药和饲料添加剂进行安全性评价时,也应考虑其对肝药酶的影响。基于此,本试验以蒜粉中的活性成分大蒜辣素为研究对象,率先评 价 了 其 对 肉 鸡 肝 药 酶C Y P1A2的 表 达 及C Y P 1 A 2酶活性的影响。大蒜辣素性质不稳定,常温下易分解失活6,2 1,为充分发挥大蒜辣素的活性,作者采用前体物质蒜氨酸和蒜酶制备大蒜辣素添加到肉鸡饲粮中2 2,并优化条件建立了体外肝微粒体孵育体系和探针药物法评价其对C Y P 1 A 2酶活性的影响。值得注意的是大蒜辣素连续给与肉鸡后第1 4和2 8天时,会显著增加C Y P 1 A 2酶活性,但在第4 2天时,C Y P 1 A 2酶活性反而会极显著下降,进一步对编码该酶的基因表达水平进行检测,发现与酶活性变化的趋势基本一致,即大蒜辣素对C Y P 1 A 2酶活性和mR NA表达的影响均表现出明显的先诱导后抑制的双向作用。这与常伟宇2 3的有关黄连素对C Y P 3 A先诱导后抑制的作用一致,但是也有文献显示五味子水提物对大鼠肝微粒体 C Y P 3 A也表现为双重的调节作用,但表现为先抑制后诱导的现象2 4-2 5。由此可见,天然化合物或者中药对机体肝药物代谢酶的影响较为复杂,大蒜辣素对C Y P 1 A 2酶表现的双重作用机制尚需深入探讨。此外,草药成分或天然产物改变C Y P 4 5 0的表达或活性对C Y P 4 5 0底物的吸收和生物利用度具有重要意义2 6。因此,本研究后续还需进一步研究大蒜辣素处理对C Y P 1 A 2底物非那西丁在肉鸡体内的药代动力学的影响,进而阐明其临床意义。研究表明,小鼠和人的肝C Y P2B和C Y P3A基因受组成型雄烷受体C A R(c o n s t i t u t i v e a n d r o-s t a n e r e c e p t o r)和孕烷X受体P X R(p r e g n a n e X r e-c e p t o r)调控2 7-2 8。鸡组织中未发现P X R或C A R,但发现核内受体C X R(c h i c k e n x e n o b i o t i c r e c e p t o r)具有与哺乳动物P X R和C A R相似功能,可调节异源代谢酶C Y P 2 H 1和C Y P 2 C 4 5以及A B C G22 9。因此作者进一步探究了大蒜辣素对肉鸡肝C X R mR NA表达的影响,结果显示,其对CX R也表