葱白提取物对油酸诱导HepG2细胞脂代谢的影响及其机制.pdf

():.崔亚运黄古叶陈梓洋等.小柴胡汤防治肝病的实验研究进展.中医药临床杂志():.胡倩金司仪李丹清等.柴胡挥发油的研究进展.中南药学():.章德林汤丹丰郑琴等.具有抗感染作用的中药分类研究.中草药():.王莉博刘泽干雷攀等.小儿柴胡退热栓的制备及质量标准研究.中国药业():.杨光义叶方杜士明等.鄂西北地区不同采收期竹叶柴胡根及地上部分总黄酮含量动态变化研究.中国药师():.蔡华杜士明叶方等.鄂西北地区竹叶柴胡不同采收期柴胡皂苷、含量动态积累研究.现代中药研究与实践():.周蕾为盼盼韩文静等.不同产地柴胡的皂苷含量和 序列比较.中国现代中药():.葱白提取物对油酸诱导 细胞脂代谢的影响及其机制胡松刘莉李璐璐胡磊邹冲冲黄传奇刘慷洁孙安妮(.湖北中医药大学药学院武汉.武汉市中西医结合医院药学部武汉.长江航运总医院、武汉脑科医院药学部武汉.华中科技大学同济医学院附属梨园医院药剂科武汉)摘 要 目的 以油酸诱导的 细胞为模型探讨葱白提取物调节脂代谢的作用及其机制 方法噻唑蓝()法选择适宜的葱白提取物()实验浓度后酶联免疫吸附测定()法检测不同浓度 对油酸诱导的 细胞三酰甘油()、活性氧()生成量的影响格里斯试剂法分析各组一氧化氮()生成量实时荧光定量聚合酶链反应()观察各组 和 的相对含量免疫印迹实验()检测各组、和 的相对生成量 结果 可显著降低油酸诱导的 细胞、及其蛋白、的相对生成量上调、及其蛋白、的相对含量 结论 可有效调控油酸诱导 细胞的脂代谢其机制可能是通过抑制 等关键蛋白来减少脂质堆积以及通过激活 等信号通路来促进脂质氧化关键词 葱白提取物油酸脂代谢氧化应激中图分类号.文献标识码 文章编号()./.开放科学(资源服务)标识码().(.).().().医药导报 年 月第 卷第 期 .非酒精性脂肪性肝病()作为目前世界范围内最常见的慢性肝病 严 重 危 害 着 全 球 约 成 年 人 的 健 康 主要包括普通脂肪肝和非酒精性脂肪性肝炎()两类前者以肝细胞的脂肪堆积为特征而后者可进展为肝硬化甚至肝癌 医学界至今尚未明确 的具体发病原因但脂质代谢异常、氧化应激、炎症的影响等被认为是可能的高致病因素且临床上至今缺乏治疗 的有效药物葱白提取物(.)是本课题组对火葱 .的葱白进行二氧化碳超临界萃取的产物由该萃取物制成 的 医 疗 机 构 制 剂 博 心 通 软 胶 囊(鄂 药 制 字每粒 谷甾醇含量不低于.)已在临床使用多年 虽然长期的临床研究和动物实验均表明 可调节脂质代谢并可显著改善其动脉粥样硬化、心肌梗死等临床症状 但是 发挥以上功效的分子机制尚未被完全揭示 因此本研究拟建立油酸诱导的人肝癌细胞()高脂模型观测 对肝脂质代谢关键蛋白(、和)、氧化应激调节因子影响并分析该作用的潜在分子机制 材料与方法.实验药品及试剂 由武汉市中西医结合医院制剂中心提供(批号:)实验前以二甲亚砜()配制成一定浓度的储存液并冷冻于 备用(实验中各组 浓度均.)油酸(批号:)购于 公司达尔伯克必需基本培养液()(批号:)、胎牛血清(批号:)、磷酸盐缓冲液(批号:)和噻唑蓝()试 剂 盒(批 号:)均购自 公司格里斯试剂(批号:)购于 公司活性氧(收稿日期 修回日期 基金 项 目 湖 北 省 自 然 科 学 基 金 资 助 项 目()作者简介 胡松()男湖北武汉人教授硕士硕士生导师 研究方向:中药制剂功效物质发掘及其转化:电 话:.)酶 联 免 疫 吸 附 测 定()试剂盒(批号:)购 于 冬 歌 生 物 科 技 有 限 公 司 三 酰 甘 油()(批号:)、试剂盒购于 公司二喹啉甲酸()蛋白定量试剂盒(批号:)、总 提取试剂(批号:)购自天根生化科技有限公司逆转录试剂盒(批号:)、实时荧光定量试剂盒(批号:)均购自 公司单核苷酸引物由生工生物工程股份有限公司合成 ()、()、()、()、()、()一抗均购自 公司.细胞与细胞培养 人肝癌细胞 购自中国典型培养物保藏中心以 高糖培养基胎牛血清青链霉素双抗在 二氧化碳、细胞培养箱中培养至对数期用于后续实验.细胞活性测定 以适量甲醇溶解油酸()并以适量超纯化水将其溶解配制成.溶液备用 接种于 孔板的细胞(每孔 个)以.在 下预处理 再以梯度浓度()在 下孵育 随后加入 溶液 和 值.的磷酸盐缓冲液 孵育 后弃去上清液加 溶液 溶解结晶于酶标仪中低速震荡 后在波长 下读板.细胞给药 以 细胞每孔 个的密度在 孔板中接种并孵育 之后正常对照组细胞加培养基孵育 模型对照组和各 组在.溶液中孵育 弃去培养液正常对照组和模型对照组加培养基各 组加梯度浓度的(、)孵育 每组设置复孔 个所有实验平行重复 次.细 胞 测 定 细 胞 给 药 后 每 孔 加 入 二氯荧光素二乙酸酯孵育后在波长 和 下测定各组荧光强度 搜集各组细胞裂解后以 蛋白试剂盒测定各组细胞蛋白质浓度并计算单位蛋白质浓度下的相对荧光强度来评估各组细胞的相对 含量.的测定 细胞给药后搜集各组细胞并裂解根据 和 试剂盒说明测定各组 水平和各组蛋白含量计算得到各组 相对含量 .实时定量聚合酶链反应()细胞给药后搜集各组细胞并以 试剂裂解并提取总 测定提取总 的/以确保纯度 总 以逆转录试剂盒逆转录为 再以实时荧光定量试剂扩增 扩增方案为两步法:第一步 保持 预变性第二步 保持 保持 重复 个循环 反应、引物和内参寡核苷酸序列见表 以 计算各组细胞相对 含量表 、引物和内参寡核苷酸序列.基因名称序列:.免疫印迹分析 细胞给药后搜集各组细胞于冰上裂解 下冷冻离心 并以 蛋白试剂盒测定各组蛋白浓度 总蛋白经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳()后转膜至聚偏二氟乙烯()膜以 脱脂牛奶室温封闭 后与相应的一抗(、)孵育 洗膜 次后以辣根过氧化物酶()标记的二抗孵育 洗膜 次后在 发光液中孵育 以感光胶片压片成像后以 凝胶成像系统测定各组灰度值.统计学方法 所有计量资料以 .版软件进行单因素方差分析()方差齐时结合 检验比较组间统计学差异方差不齐时采用 检验 以.)、对 细胞有细胞毒性(.)因此后续实验中给药组以、进行实验.正常对照组.模型对照组.组.组.组.组.组.组 与正常对照组比较.与模型对照组比较.、.图 组 细胞的活力比较().().葱白提取物对 细胞 生成的影响由实验结果(图)可知与正常对照组比较 可显著提高 细胞的 生成量(.方差齐)与模型对照组比较所有实验浓度的 均可显著降低 细胞的 生成量(.).葱白提取物对 细胞 生成的影响 由实验结果(图)可知相对于正常对照组 可显著提高 细胞 的生成量(.)、的 可显著提升 的生成量(.).葱白提取物对 细胞 生成的影响由实验结果(图)可知与正常对照组比较 可显著提高 细胞的 生成量(.方差齐)与模型对照组比较所有实验浓度的 均可显著降低 细胞的 生成量(.).葱白提取物对 细胞 和 相对含量的影响由实验结果(图)可知与正常对照组比较 可显著提高 细胞 医药导报 年 月第 卷第 期.正常对照组.模型对照组.组.组.组.组 与正常对照组比较.与模型对照组比较.图 组 细胞 生成量比较().().正常对照组.模型对照组.组.组.组.组 与正常对照组比较.与模型对照组比较.图 组 细胞 生成量比较().()的相对含量(.方差齐)与模 .正常对照组.模型对照组.组.组.组.组 与正常对照组比较.与模型对照组比较.图 组 细胞 生成量比较().()型对照组比较 可显著降低 细胞的 的相对含量(.)另一方面与正常对照组比较 可显著降低 细胞 的相对含量(.方差不齐)与模型对照组比较所有实验浓度的 均可显著提升 细胞 的相对含量(.).对 细胞脂代谢、氧化应激相关蛋白的影响结果见表 和图 与正常对照组比较模型对照组的 和 的相对含量显著降低(.)而、和 的相对含量显著升高(.)与模型对照组比较 的 和 的 分别使 和 相对含量显著提升(.)的 组 相对含量显著高于模型对照组(.)的 组、和 的相对含量显著高于模型对照组(.)讨论 的发生和发展主要经历 个阶段:其一是肝脏脂质的累积是形成 和胰岛素抵抗的重要原因其二是以氧化应激和炎症为特征的肝损伤 在 .正常对照组.模型对照组.组.组.组.组 与正常对照组比较.与模型对照组比较.与正常对照组比较.图 组 细胞 和 水平比较().()当今全球经济迅速发展的大环境下 的发病率在全球范围内都保持着上升趋势 因此寻找能够安全、有效控制 的药物具有重要的社会意义和潜在的经济价值 是我院经典医疗机构制剂博心通软胶囊的主要原料前期临床研究中发现博心通软胶囊能显著降低患者血清 水平减轻患者动脉粥样硬化等临床症状 为了探究 治疗 的机制本研究以 诱导 细胞这一经典 细胞模型为基础 观察了 对、生成量以及、等关键靶蛋白相对含量的影响 是 肝脏中的主要脂质成分同时 的肝内堆积也是 的特征性病理表现 与此同时 的肝内堆积不仅仅起到损伤肝细胞的作用同时也是机体对抗脂毒性及过量生成 的一种保护机制 可促进肝细胞启动自身针对 过量的自我保护机制体外实验表明大多数具有治疗特性的膳食化合物在高浓度的情况下都可以作为有效的促氧化剂分子 这种促氧化作用增加了 的产生 此外 既是 中衡量氮化应激程度的指标也是判断肝细胞发生氧化应激损伤程度的指标 可有效抑制油酸对 细胞的氧化应激和氮化应激损伤 是马铃薯糖蛋白磷脂酶家族成员之一它参与多项肝脏脂肪酸代谢活动同时是 致病的关键蛋白之一临床数据证实 对纤维化、肝脂肪积累和炎症的发展有积极的直接影响 突变可能通过 种方式促进疾病进展:通过直接激活纤维化途径或通过炎症表 组 细胞脂代谢、氧化应激相关蛋白比较.组别/正常对照组.模型对照组.组 组.组.组.与正常对照组比较.与模型对照组比较.医药导报 年 月第 卷第 期 .正常对照组.模型对照组.组.组.组.组图 组 细胞脂代谢、氧化应激相关蛋白的表达.基因 的多态性是糖尿病 患者肝纤维化和心血管疾病风险的标志 基因突变与 有显著的相关性提示可能发展 治疗的新的酶学位点药物 对 的生成具有从 到蛋白表达的全面抑制作用 此外 还直接调控 而 参与调控多种肝内脂肪合成关键酶的生成 可通过抑制 和 的生成来控制肝内脂肪堆积 是细胞核上参与调控脂质氧化的关键受体前期动物实验中也验证了 通过诱导 治疗 的可行性结合 对 的上调作用本研究提示 可能通过提高肝细胞脂肪氧化来抑制肝内脂肪堆积 蛋白调控着肝内解毒、抗氧化等多项功能一般认为细胞中 蛋白越丰富其抗氧化能力越强 然而 在氧化应激反应中的双重对立作用应该被严格考虑在一个复杂的层次调控网络中在刺激其协同介导的抗氧化细胞保护反应之前还可以在不同的细胞系中触发一定的 产量 同时 对于 的上调作用说明 可增强肝细胞的抗氧化能力并对氧化应激反应起到协调作用 是多种异源物的单加氧酶它参与多种有毒物质的代谢 可显著抑制油酸对 细胞的毒性作用 作为一种泛素连接酶参与人体多种脂肪酸和类固醇等脂质的合成 也可能通过抑制 的生成来发挥其降低脂质生成的临床作用综上 所 述 一 方 面 通 过 下 调、等靶点抑制脂质的生成堆积并降低氧化应激的损伤另一方面通过上调 和 加速脂质氧化来加速脂质代谢 虽然本研究在细胞层面对 调节脂质代谢的机制进行了较全面地解释但 中发挥调节脂质代谢的活性成分(群)尚不明确 调节脂质代谢的其他靶标蛋白、目的细胞尚不明确 本课题组将继续开展深入研究参考文献 .:.():.().():.:.():.:.():.():.:.():.():.():./.():.张耕程璐徐宏峰.博心通软胶囊质量标准研究.医药导报():.刘云郭洁张曼玲等.葱白提取物改善非酒精性脂肪性肝病大鼠糖脂代谢的机制.中华中医药杂志 ():.谢婷婷邢若丹顾歆韵等.葱白提取物对心肌梗死后心衰大鼠心室重构及细胞凋亡的影响.中国中医基础医学杂志():.():.():.:.?.():.():.():.:?.():./.():.:.():.:.():.():.:.:.().():.()():.()():.():.():.():./:.()():.().():.医药导报 年 月第 卷第 期