第二章-工业微生物第2次课.pptx

,常用的基因表达系统,(,一,),原核生物：,大肠杆菌,(1977,年,Boyer),、枯草芽胞杆菌,沙门氏菌,生长迅速、蛋白产量高,;,表达蛋白的纯化、分离及分析快速；,外源基因的导入相对容易；,已建立了整套表达理论及技术,(,二,),真核细胞表达系统,1.,酵母,(,既是微生物又是真核细胞,),生长迅速，营养要求不高，易培养；,安全性好；,比哺乳动物细胞操作简单；,具有一定的修饰蛋白的能力。,2.,中国仓鼠卵巢细胞（,CHO,细胞）表达系统,具有准确的转录后修饰功能；,具有产物胞外分越功能，便于下游产物分离纯化；,具有重组基因的高效扩增和表达能力；,具有贴壁生长特性，也可进行悬浮生长；,CHO,很少分泌自身的内源蛋白。,微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生产对于某一种特定的产品，只有特定的微生物才具有大量表达的潜力。,问题：,生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？,礼来,(Eli lilly),花了,10,年的时间从,40,万株微生物中，发现了三种有潜力的新抗生素。,例：,第二节 工业微生物菌种的选育,一、自然分离,二、菌种选育,（一）自然选育,（二）诱变育种,（三）原生质体融合,（四）分子育种,一、自然分离,菌种分离的一般过程：,采样,增殖培养,分离,复筛,性能,鉴定,定方案,定方案：,查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。,采样：,有针对性地采集样品。,增殖：,人为地通过控制养分或培养条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。,分离：,利用分离技术得到纯种。,发酵性能测定：,进行生产性能测定。,（一）采样,1.,采样对象,土壤，水，空气等,2.,气候、湿度,3.,采样方式,要根据筛选的目的，微生物的分布概况及菌种的主要特征与外界环境关系等，进行综合地、具体地分析来决定。,土壤是微生物的总来源和大本营,，尤其细菌和放线菌在土壤中存在得更多。所以，如果我们不知道某种产品的微生物属类或某些特征时，一般都可以土壤为样品进行分离。,一般有机质较多的土壤，微生物数量也多。在田园土和耕作过的土中，以细菌和放线菌为主；在有很多动植物残体的土壤中，在沼泽土中，酵母和霉菌就较多。,细菌和放线菌在中性或微碱性土壤中较多，而酵母菌和霉菌则在偏酸性土壤中居多。,采土的深度不同，其通风、养分、水分、光照等情况就不同，表层土由于日光直接照射，水分也较少，所以不利微生物生长，数量也少，,一般离表层,5-15,厘米深处的土含微生物最多。,土壤的植被情况对微生物的类型有着一定关系。如豆科植物下的土，根瘤菌较多；果树下的土，酵母菌较多。采样时加以注意，对我们今后的工作会有帮助。,1.,采样,-,何处采样,2.,采样,-,什么季节,春秋季温度、湿度对微生物的生长繁殖最合适，因此，土壤中微生物数量最多，所以,春秋两季采样是合适的,。,在采样时，还应,避免水分过多,的问题。土壤中水分过多，往往造成缺氧状态，因此，即使具有酵母、霉菌需要的温度、湿度，但也不利于其生长。放线菌也在水分较少的情况下繁殖得好。,一般应,避免雨季,采土，而以秋季采土比较理想。,3.,采样,-,方法,采土方法多在选好适当地点后，用,小铲子,除去表土，,取离地面,5-15,厘米处,的土几十克，盛入预先消毒过的,牛皮纸中（塑料袋最好），,扎好，,记录采样时间、地点、环境情况等，以备查考。,一般土壤中芽孢杆菌、放线菌和霉菌的孢子忍耐不良环境能力较强，因此不太容易死亡。但是由于采样后的环境与天然条件有着不同程度的差异，微生物逐渐死亡而减少，种类也会起变化，,所以应尽快分离,。,特性菌种的采样,对于,酵母类或霉菌类,微生物，由于它们对碳水化合物的需要量比较多，一般又喜欢偏酸性，所以在,普通植物花朵、瓜果种子及腐植质等上面较多。,若要筛选一些具有明显特性的菌种，如利用糖质原料的,耐高渗透压酵母,，则样品采集的重点可以是蜂蜜、蜜饯、花蜜、糖果及常有糖质流经或贮积的土壤、,含糖浓度较高,的植物流出汁等；,若要筛选,纤维素酶,产生菌，可根据纤维素酶分解植物微素的特性，在采样时，可以,采集枯枝、落叶和朽木,等作为样品。,筛选以,石油为基质的微生物,时，在,含油土壤,中，含有能利用石蜡和芳香烃的微生物比一般土壤多；油田的,浸油土壤,是优良的分离样品，而在原油中很难分出微生物。,2.,富集的方案：,（,1,）选择培养基,:,A.,特定营养成分，如碳源，糖，淀粉，纤维素。,B.,特定抗生素，青霉素，放线菌酮，制霉菌素，脱氧胆酸钠,(2),特殊培养条件：,pH,温度,氧供给等,（二）增殖培养（富集，定向培养）,1.,富集的目的：,提高目的菌株的相对生长速率，让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。,（三）分离纯化,why?,尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化,。,How?,继续应用增殖培养的,选择性控制条件,，控制得细一点，好一点,。,纯种分离方法的应用：稀释分离，划线分离,稀释分离,1.,分离的培养条件,-,控制营养成分,各种微生物对这些营养物质的要求是有差异的。控制分离培养基的营养成分对提高分离效果是有好处的。,要分离分解纤维素的微生物，可以把纤维素作为唯一碳源。用淀粉作为唯一碳源，则具有淀粉酶类的微生物就能很好生长。但并不绝对。只是在这种营养条件下更快、更准确的分离。,产生诱导酶类的微生物，必须要有某种分解底物存在，才能产生这类酶或者产得更多。,在一般情况下，也可以按照各大类微生物常用的培养基进行分离，例如分离细菌常用蛋白胨牛肉膏琼脂培养基，分离放线菌常用淀粉琼脂培养基，分离酵母、霉菌常用麦芽汁或米曲汁培养基等。,2.,分离的培养条件,-,培养基酸碱度,微生物生长繁殖的适宜酸碱度是不同的。细菌和放线菌一般要求中性或偏碱性的培养基（,pH7.0,或稍高），酵母和霉菌一般要求偏酸性（,pH4.0-6.0,）。所以，结合一定的营养，将培养基调至一定的,pH,值，更有利于排除不需要的微生物类型。,筛选一些产有机酸类型的菌种，采用控制,pH,值的方法更为见效。例如，用酸性滤纸法筛选柠檬酸产生菌，就是利用含,30%,甘薯粉醪和,10%,的柠檬酸的培养基，使,pH,值在,2.0-2.5,。这样得菌种几乎全部是产柠檬酸的黑曲霉。若要分离其它霉菌，在分离培养基中滴加几滴乳酸就可抑制细菌生长。,在采用含糊,40%,葡萄糖浓度的培养基分离耐高渗压酵母时，若,pH,值控制在,2.0-4.0,，则分离出来的几乎全是耐高渗透压酵母。,从土壤分离放线菌，培养基,pH,值为,7.0-7.2,，以可溶性淀粉为唯一碳源。若加入部分葡萄糖，则细菌就会大量生长。,3.,热处理,每一种微生物都有它的最高生长温度，超过最高生长温度就不能生长和繁殖，甚至死亡。,热处理就是根据芽孢对热的耐性而淘汰不产芽孢的细菌和其他微生物。一般不产芽孢的细菌和其他微生物的营养型细胞，在,60-70,温度下,10,分钟被杀死，而芽孢则能抵抗,100,或更高的温度。,要筛选芽孢杆菌，可将样品稀释液经过,80,，,10,分钟的水浴处理，将不产芽孢的营养细胞杀死，然后再进行分离，这样的筛选效果就很高。至于热处理条件，由于芽孢的耐热性，会因培养条件不同而产生差异，所以应根据具体情况有所变化。,4.,添加抑制剂,分离用的培养基，除控制营养，调节,pH,值外，还可添加一些专一性抑制剂，这样筛选效果还会提高。例如在分离放线菌时，可先在土壤样品的悬浮液中加,10%,酚数滴，以抑制分离时霉菌和细菌的生长。添加一些抗菌素对某些微生物更有专一性的抑制，如分离酵母和霉菌，在培养基中添加一定量的青霉素、链霉素或新霉素以抑制细菌的生长。,对不同菌类起抑制作用的抗菌素种类和浓度是有差异的。一般的抑制剂对芽孢和孢子的作用力弱，对营养细胞的作用力强，所以也应区别分离对象，灵活添加。,分离霉菌时，特别是菌丝蔓延的根霉、毛霉等，菌落有的很快连成一片，不易挑取单菌落。若在培养基中添加,去氧胆酸钠约,0.1%,左右，或山梨糖（在察氏培养基中加山梨糖,0.1%,，蔗糖,0.01%,），这样可防止菌丝蔓延，便于挑取。,（四）性能鉴定,毒性试验,自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种，更应慎重。,据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌,作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。,（四）性能鉴定,生产性能的测定,分离后获得菌种才是筛选工作的第一步。在菌种分离中，获得大量的各种菌株，虽然它们可能有一些共同的特点，但是只有进一步进行生产性能的测定，才能确定哪些菌株适合生产要求，可用于生产。,由于纯种分离后，得到的菌株数量很大，往往有数百株到数千株，如果每一株都作全面或精确的性能测定，工作量就十分巨大，而且是不必要。,一般分两步进行，即初筛和复筛,，经过多次重复筛选直至获得,1-3,株较好的菌株，供发酵条件的摸索和生产试验，并进而作为育种的 出发菌株。这种直接从自然界分离得到的菌株称为,野生型菌株,。以区别于人工育种方法得到的变异菌株。,实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选,采样（造纸厂）,80,度,30,分钟处理,文献,:,产生菌为中性,芽孢,杆菌，,嗜碱芽孢杆菌,、放线菌及霉菌,0.0075%,曲利本蓝,1%CMC,（羧甲基纤维素），,pH10.5,培养,3,4,天，选择有凹陷圈的菌落,从,285,个土样中获得,62,株,26,株为组成型,36,株为诱导型,例：醛肟水解酶的筛选,-Journal of biotechnology 94(2002),65-72,培养基中含,0.05%of Z-PAOx,每隔,2-3,天移去一半培养物，补充新鲜培养基,不断分析样品，,2-3,个月后,Z-PAOx,降低后，稀释分离菌落,第二节 工业微生物菌种的选育,一、自然分离,二、菌种选育,（一）自然选育,（二）诱变育种,（三）杂交育种,（四）原生质体融合,（五）分子育种,(,代谢工程育种）,二、菌种选育,目的,提高生产能力,提高产品质量,开发新产品,解决生产实际问题,防止菌种退化,方法,基因突变：,自然选育、诱变育种,基因重组：,杂交、原生质体融合、基因工程,基因的直接进化：,点突变、易错,PCR,、,DNA Shuffling,等,(,一,),自然选育（,What?),不经人工处理，利用微生物的自然突变,(spontaneous mutation),进行菌种选育的过程称为自然选育。,自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为,10,-8,10,-9,(,一,),自然选育（,Why?),自然突变产生的两种原因,：,多因素低剂量的诱变效应,互变异构效应等复制自身产生错误,自发突变,碱基罕见异构体形成的错误碱基配对,(,引自,Griffiths,A.J.F 1999),DNA,复制错误,在,DNA,碱基中互变异构移位产生的突变,(,引自,Griffiths,A.J.F 1999),自发的化学变化,图,17-,5,DNA,的脱嘌呤,(,引自,Griffiths,A.J.F.,et al,.:MODERE GENETIC ANALYSIS,1999,W.H.Freeman and Company.Fig.7-13),胞嘧啶,胞嘌呤,自然突变有两种情况,：,一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰退和生产质量的下降，这种突变成为,负突变,。,另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利，这种突变成为,正突变,。,(,一,),自然选育（,How?),How?,自然选育操作步骤：,一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。,单细胞,(,孢子,),悬液的制备,平板分离,挑选单菌落,(,注意形态的观察,),发酵试验,(,二,),诱变育种,（,1,）概念：,利用,物理或化学诱变剂,处理均匀分散的微生物细胞群，促进其,突变率大幅度提高,。然后采用简便、快速和高效的,筛选,方法，从中挑选少数符合育种目的的突变株，以供生产实践或科学研究之用。,1,、概述,（,2,）原理：,染色体畸变,：染色体或,DNA,片段缺失、易位、逆位、重复等,基因突变：,颠换,嘌呤（嘧啶）被嘧啶（嘌呤）取代；,转换,一种嘌呤（嘧啶）被另一种嘌呤（嘧啶）取代；,移码,、大片段的,缺失、重复,等,（,3,）常用诱变剂及作用机理,1,）物理诱变剂,紫外线,：,DNA,链的断裂（致死），或形成二聚体（,TT),导致复制错误（缺失），错义（移码）,其他：,X,射线，激光，,射线，快中子，,离子注入,等,2,）化学诱变剂,A.,与核酸碱基直接作用的,a.,烷化剂：硫酸二乙酯（,EDS),、甲基磺酸乙酯（,EMS),、亚硝基胍（,NTG),，烷基化的碱基（,G,）发生错配或丢失导致转换或颠换。,b.,亚硝酸盐：使得碱基氧化脱氨基，引起转换或者,DNA,双链交联。,c.,羟胺：专一性的与,C,作用，生成,N-4-,羟基,C,，与,A,配对，发生转换,B.,碱基类似物（结构类似）,5,氟尿嘧啶，,8,氮鸟嘌呤等，复制时掺入,DNA,，引起转换,C.,移码突变的诱变剂,丫啶类染料（丫啶黄，丫啶橙等），引起,DNA,分子中的一个或者少数几个核苷酸的插入或者缺失,