成年小鼠心脏灌流.docx

成年小鼠心脏灌流

实验材料：需要观察脑切片的小鼠
试剂/试剂盒：乙醚；生理盐水（37℃水浴）；4%PFA；30%蔗糖
仪器：蠕动泵；剪刀；镊子；针头；导管
实验步骤：
1、准备实验器材：两个锥形瓶（1个装生理盐水，一个装4%多聚甲醛，记得要用封口膜封口）
2、用生理盐水冲洗导管，并排除管内气体。（灌流时选用雄性动物比选用雌性动物要好，原因是雌性动物受其激素周期影响，雄性的结果更为可靠）
3、在密闭容器内加适量乙醚，麻醉小鼠。（需要注意的是，小鼠清醒一点比死掉要好，防止血液凝固给灌流带来阻力）
4、待小鼠麻醉后立即将其用针头固定在泡沫板上（用针头插住四肢）。
5、一只手用镊子扯起胸部皮肤，另一只手用剪刀剪开胸腔的皮肤和肋骨，暴露出心脏和肝脏。
6、将注射针头插入小鼠左心室（如针头不稳可用镊子将其固定在泡沫板上），同时将小鼠肝脏减掉，以使血液流出。灌流速度5.8rpm。（灌注生理盐水的时间维持在10min左右，血液排除后四肢、肝脏和舌头会变白）
7、对小鼠进行剪尾取样，以备测定其基因型。同时，将小鼠信息卡片上记录灌流信息，并将灌流小鼠的信息记录在自己的实验记录本上，以方便后续的重新基因型鉴定操作。
8、待小鼠四肢、肝脏和舌头变白之后，将导管始端从生理盐水中拿出，将其放入冰浴的4%PFA溶液（4℃）中，用4%PFA灌流固定时，当PFA流至大脑处可能会使小鼠尾巴略有反射现象（有时可能没有），此时可将灌流速度由5.8rpm调至4.8rpm，以使固定更加充分。整个PFA灌流时间约为20min。（固定原理：多聚甲醛可以使蛋白质交联）
9、将导管始端从PFA中拿出，待管中液体流尽后，将心脏上的针头拔下，如果固定的较好，可发现小鼠眼球呈现白色。将托盘中的血液倒至废液桶内，并准备下一步的取脑操作。
10、拿出一条纸巾，将小鼠尸体放在上面，沿颈部剪下头颅。
11、剪开头部皮肤，露出白色头盖骨。将延髓上包被的软骨剪开，除去多余的结缔组织。需要注意的时，眼睛要由剪刀剪下，不能够直接扯下来，因为眼睛后部连着视神经，如果扯的话有可能会损坏视交叉上核等其他脑部组织。
12、将头盖骨小心剥开，露出白色的脑部，在剥嗅球部位时要格外小心，必要的话可以先将嗅球前部的碎骨留着待进一步固定之后再去除。
13、将头盖骨剥开后，将脑下部连接的神经逐条剪短（可看到视神经交叉），待全部剪断后将脑整个剥离出来。
14，将剥离出来的脑浸泡在4%PFA中，过夜固定。
15、将PFA液换为30%蔗糖进行脱水（防止冷冻切片时形成冰晶和孔洞），初始脱水时脑会浮在蔗糖上面，待完全脱水后脑会沉底。此时可将脑取出进行冷冻切片。