环孢素对大鼠牙龈组织形态影响的定量分析.pdf

华西口腔医学杂志第2 7 卷第6 期2 0 0 9 年1 2 月W e B tC l l i I l aJ o 岫“o f 鼬a t 0 1 0 l g yV o L 2 7N o 6D 2 95 9 9 环孢素对大鼠牙龈组织形态影响的定量分析刘培红马肃刘薇婷(哈尔滨医科大学口腔医院牙周科，黑龙江哈尔滨1 5 0 0 0 1)【摘要J目的定量分析环孢素(c s P)对大鼠牙龈组织形态影响的部位特异性和时间依赖性。方法将舳只7 周龄雄性w i 8 k 盯大鼠随机分为实验组和对照组，每组又分为1 0、2 0、3 0、4 0d 亚组。实验组胃饲含C s P 的鲜牛奶，对照组胃饲等量鲜牛奶。内固定取材后制作下颌第一磨牙颊舌向石蜡切片，H E 染色，利用图像分析系统分别测量颊侧和舌侧牙龈上皮面积、结缔组织面积、最长钉突长度，行完全随机分组两因素析因设计资料的方差分析。结果实验组大鼠牙龈增厚，颊侧附着龈近膜龈联合处上皮钉突明显增生伸长。实验组大鼠颊侧和舌侧牙龈上皮面积和结缔组织面积以及颊侧最长钉突长度均显著大于对照组(颊侧P O 0 l，舌侧O 0 1(P O 0 5)，2 组间舌侧最长钉突长度差异无统计学意义。各时间点相比，颊侧和舌侧上皮面积、结缔组织面积以及最长钉突长度间差异无统计学意义。结论C s P 对大鼠颊侧膜龈联合端附着龈上皮的影响存在部位特异性，对大鼠牙龈的影响无时间依赖性。【关键词】环孢素；药物性牙龈增生；形态计量学；上皮：结缔组织【中图分类号】R7 8 0 2【文献标志码】A【d o i】1 0 3 9 6 9，j i 9 蛐1 0 0 0-1 1 8 2 2 0 0 9 0 6 0 0 5Q 岫删t 撕w 柚柚y s i s 恤e 疵c to fa d 惦p o r m 恤g i n g i V mt i 娜em 砌a l 姆o fm 缸删i 勘，眵埘鼠U u 形e f _ t 嚼咖厶矿P e 触，l t o 蛔Bc 妣铲矿跏m 肋如弘日扔讯胁拙以邮咄蹦f n1 5 0 0 0 1，c h 砌【A h t m c qO b j e c t i V eQ u 蚰t i t a t i v e 蛐a l y s i st h e 弛g i 蚰a l8 p i f i c 畸a n dt i n 扯d e p e n d e n c e0 fC i c l p o r i n(c s P)g i I l g i y a lt i s 鲫e 贼I a l i t y0 fm t 8 M e 妇l o 出E i g h t ys P Fg r a d em a l ew i s t a rr 出0 f7w l【8o l dw e r e 删1 d o m l yd i l，i d e di n t o 掣r i m e n t a lg m u p 舳dc o n t m lg r o u p，舳de a c hg m u pw 鹊d i“d e di I I t o4s I I b g m u p sa c c o 耐i n gt ot I l ed 岫t i 0 f 仃e 砒m m(1 0，2 0，3 0 舳d4 0d a y s)T h e 懿p 商呲n t a lo b j e c t sw 眦g i v e ni n t 嘲a 舸ca d m i I l i B h 撕o n0 f 矗e s hm i l ki 加l u d i I I gC s P，锄dt l l e 咖砌伽唧g i v i 肿哦即t r i ca d m i I l i s n 眦i 0 f 缸s hn l i l I【t l l e 蛐e 鹪t l l e 既p e r i m 蛐t a lo b j e c t 8 A f t l 盯g i、r i n gp I 舶i o n4 p 舡缸妇t r a n B h t 湛r tt oi m e m a lf i 瑚以o I l t l l es p e c i m e n sw e 弛g e t 舳dm a d eb u c c o l i I l g u a lp a E a 伍n$e c t i o m 址l 洲e rf i 坞t 咖l l 盯衄d 叫d e 既s t a i l l i I l g 1 k 蝴0 fb u c c a la n dl i n g u a lg i n g i v a le p i t l l e l i a la I l d 咖n e c t i v et i 昭眦，t l l el e n g t l l0 ft l I e1 0 I l g e s tr e t ep e 铲w e m e 鹧I l r e dw i t I lt l l ei n l a g ea n a l y s i 8s y 吼e 札D a t aw e ma l l a l y z e db yt w o w a ya I l a l y s i s0 fv a r i 姐c eo fl h c t o r i a ld e 8 i g n 胁呵缸T h em t s0 ft l I ee x p e r i m e m a l 鲫pkp kg i n g i v a lo v e r g r d W t h，蚰dt I I er e t ep e 轳0 fg i n g i v a l 印i t l l e l i 衄0 fa t t h e dg i n g i v aa p p I o h 咖c o g i n g i v a lj 岫c t i 咖w e 坨p m l o n g e d T l l ea 瑚0 fb u e c a l 趴dl i n g t l a l 西n g i v a l 印i t h e l i 啪“c 咖e c t i v et i 鸥u e，t h el e n g t l lo fb c a l1 0 n g e s tD e t ep e 轳0 ft I l e 既p e r i m e n t a lg r o u p 慨8 i 印i f i c 明yI l i g I I e r 血蚰t I l 砒0 ft l l ec o n 咖lg m u pr a B 锄l c c aP(o 0 1，l i n g 阻O 0 l 尸I 0 0 5)I kl e n g t l l0 fl i n g u a ll o I 唱e s tr e t ep e 伊o ft h e 饮p e r i m e n t a l 刚pw e 坨肿d i 任确呲et l I a r It l l a to ft l I e 咖酬伊伽pm 协T h ea 瑚0 fb u c c a Ia I l dl i n g I l a lg i n g i V a le F i t I l e l i a l，c o 衄e c v et i 船u e，t l l el e n g t l l0 fl o r I g e 酿r e t ep e 黟a m o r I g 麟p e r i m e n t a lg m u p sw e 弛础b r 朗o D n c l 的皿C 8 Pm a yh a v et h er e g i o n a ls p e c i f i c i t y 伽t h e 朋t s g i n g i v a le p i t l l e l i 唧0 fb u c c a Ia 从北h I 射g i n g i v aa I p m h 咖c o g i n g i v a lj m 姒i o 玛b l l tm ee 瑾t0 fC 8 P 明t l l e 础g i n g i 张w n ot i m ed e p e n d 即c e【K e yw o r d 嘲C i c l 硝p o 血；d n I g i n d u c e dg i n g i v a lo v e r g 附w t h；m 唧h o m e t l y；e p i t l l e l i 岫；n n e c t i v et i 8 鲫e环孢素(C i c l 0 8 p 砸n，C s P)是一种强效的免疫抑【收稿日期】2 0 0 9-o l 1 2：【修回日期12 0 0 9 0 5 2 l【基金项目】黑龙江省卫生厅科研基金资助项目(2 6 枷9)：黑龙江省教育厅科研基金资助项目(“5 2“1 1)#哈尔滨市科技刨新人才研究专项基金资助项目(2 0 0 9 R 麟2 1 4)；哈尔滨医科大学附属第一医院科研基金资助项目(Q 埘5)【作者简介】刘培红(1 9 7 6)，女，黑龙江人，主治医师。硕士【通讯作者】马肃，1 I e l：0 4 5 l 一8 5 5 5 3 9 8 8制剂，被广泛应用于器官移植术后抗排异反应和自身免疫性疾病的治疗。C s P 在治疗相关疾病的同时，可诱导牙龈组织增生，发病率高达3 0 一5 0【”。C s P诱导牙龈组织增生的发病机制尚不十分清楚闭。本实验以大鼠为实验对象，定量分析C 8 P 对大鼠磨牙区牙龈上皮层和固有层不同部位的差异影响，旨在探讨C s P 作用的部位特异性和时间依赖性。万方数据6 D D 华西口腔医学杂志第2 7 卷第6 期2 0 0 9 年1 2 月W e s tC h i 触J o u n“0 fS t o m 8 t o l o g yV 0 1 2 7 N o 6D e c 2 0 0 91 材料和方法1 1 药物和仪器C s P(商品名：新山地明，瑞士诺华制药)，隔离器(V i t r e o u sP l a s t i cI s o l a t o l l sP L Y L T D，澳大利亚)，k i c aD M 2 5 0 0 光学显微镜(徕卡公司，德国)，M o t i cM e d6 O 数码医学图像分析系统(北京麦克奥迪图像技术有限公司)。1 2 动物的选择、分组和建模选取由哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供的S P F 级7 周龄雄性W i s t a r 大鼠8 0 只，随机分为实验组和对照组，每组又分为1 0、2 0、3 0、4 0d 亚组。隔离器饲养，正常食水。实验组胃饲浓度为5I I l g m L 一的C 8 P 鲜牛奶混浊液，C s P 摄入量为每天3 0m g k g-I；对照组胃饲不含C s P 的等量鲜牛奶。1 3 取材和组织病理学检测使用1 0 水合氯醛行大鼠腹腔注射麻醉，解剖暴露心脏，0 9 生理盐水和4 多聚甲醛经心脏灌注内固定，取下颌磨牙区牙周一牙体联合组织块，外固定和微波脱钙后，以下颌第一磨牙近中面为包埋面常规方法制作蜡块，5 仙m 厚颊舌向连续切片。选择下颌第一磨牙近远中面中点处组织切片3 张，H E染色。1 4 结果判断光镜下观察牙龈形态，利用M o t i cM e d6 O 数码医学图像分析系统摄片，采用手动测量选项分别进行颊侧和舌侧牙龈上皮面积、结缔组织面积、最长钉突长度6 个指标的测定，测量由同一人完成，每个标本测3 张切片，每张切片测3 次，取平均值。1 5 统计学分析采用S P S S1 3 0 软件包对每一指标进行完全随机分组两因素析因设计资料的方差分析。2 结果2 1 组织形态学观察结果2 组大鼠牙龈组织形态的观察结果见图1、2。同对照组相比，实验组大鼠牙龈面积明显增加，牙龈上皮发生明显的具有部位特异性的增厚，棘层细胞层数和数目增多，上皮钉突伸长变宽，增生钉突主要集中于附着龈近膜龈联合处；固有层面积增加，细胞外基质大量堆积，成纤维细胞增多，血管明显扩张且数目增加。颊侧牙龈比舌侧牙龈增生明显。实验组和对照组大鼠牙龈组织内均未见到炎性细胞浸润和组织水肿现象。A：l O d 亚组；B：2 0 d 亚组；C：3 0 d 亚组；D：4 0 d 亚组。图l 对照组大鼠牙龈组织形态眦伽F i g1A p P e a 咖c eo fg i I l g i V a ld 8 嘣o fm ec 州卿皿4 l D oA：1 0 d 亚组；B：2 0 d 亚组；C：3 0 d 亚组；D I4 0 d 亚组图2 实验组大鼠牙龈组织形态H E4 0 0F i g2A p p e 咖e0 fg i n g i v a l6 鹅嘲o ft h ee 珥唧诋m a lg 哪l pH E4 0 0万方数据华西口腔医学杂志第2 7 卷第6 期2 0 0 9 年1 2 月W 船tC h i r mJ o 岫：l a Io f m a l o l o 秽V o L 2 7N o 6D 2 0 0 96 D J。2 2 测量分析结果2 2 1实验对照主效应实验组与对照组相比，颊度、舌侧上皮面积和舌侧结缔组织面积间差异有统计学意义(颊侧P 0 0 5)(表1)。表1 析因分析P 值T a bln e 嘲眦o fPb ya p p l y i n gf h c 衙a n a l y s i s2 2 2 时间主效应各时间点相比，颊侧和舌侧上皮面积、结缔组织面积以及最长钉突长度间差异无统计学意义(尸 0 0 5)(表1)。实验组颊侧上皮面积、颊侧结缔组织面积、舌侧结缔组织面积曲线表现为随时间增加而减少，舌侧上皮面积曲线表现为1 0 2 0d 增加，2 0 4 0d 减少；g置蠢1 0 0 0 0 0陶兰9 0 0 0 0暮聚一暑j蟊嬗繇嗣嚣j 暮 n一昌i蟊恒毯q暮佃对照组这4 种面积曲线均表现为1 0。2 0d 增加，2 0 4 0d 减少，实验组大于对照组(图3)。最长上皮钉突均出现在附着龈近膜龈联合处，实验组和对照组颊侧和舌侧最长上皮钉突长度曲线均表现为1 0 3 0d 增加，3 0 4 0d 减少，实验组长于对照组(图3)。j京恒繇岛翡j 基疑上：从左至右依次为颊侧上皮面积、舌侧上皮面积、烦侧结缔组织面积；下：从左至右依次为舌侧结缔组织面积、颊侧钉突长度、舌侧钉突长度。图3 牙龈组织测量统计图魂3s t a：嘣c a lc h a r t B0 fg i n g i v a l 妇3 讨论R a t e i t h a k P l t i s s 等闭首次报告C 8 P 可以诱导牙龈增生。多年来学者们对其进行了大量研究，但其确切的发病机理尚不清楚。一般而言，药物性牙龈增生患者常伴有菌斑微生物所导致的牙龈炎，加之因科研需要而进行的人增生牙龈标本定期取材难以实施，故本实验拟通过动物模型来观察C s P 对牙龈组织的动态影响。大鼠因其价廉、易饲养、变量可控性好、牙龈组织增生与人牙龈组织增生相似而被应用于药物性牙龈增生发病机制的研究问。雄性W i s t a r大鼠于出生后4 0 5 0d 性成熟，8 0 9 0d 体成熟旧，小于1 2 周龄的雄性W i s t a r 大鼠对药物最敏感同，并且大鼠下颌第一磨牙的牙周牙体组织结构与人牙最为接近嘲。基于此，本实验以7 周龄雄性W i 船大鼠为初始研究对象，选取下颌第一磨牙为牙龈观察部位。C s P 对牙龈形态影响的研究目前仅局限于对牙龈石膏模型或组织切片维指标和非动态指标的测量观察嗍。为了探讨C s P 对牙龈上皮层和固有层的动态差异影响，首先在M o t i cM e d6 0 数码医学图像万方数据华西口腔医学杂志第”卷第6 期2 0 0 9 年1 2 月。6 D 2 W e B tC h i 舱J o 明1 a Io fS t o m a t o l o g yV 0 1 2 7 N o 6D e c 2 0 0 9分析系统下，分别测量2 组大鼠下颌第一磨牙颊侧和舌侧牙龈上皮面积和结缔组织面积，定量分析C s P 对大鼠颊侧和舌侧牙龈上皮面积和结缔组织面积的影响。结果显示：在本实验周期内，实验组大鼠颊侧牙龈上皮面积和结缔组织面积显著大于对照组瞅O 0 1)，舌侧牙龈上皮面积和结缔组织面积明显大于对照组(0 O l P 0 0 5)。实验组大鼠牙龈颊侧上皮面积、颊侧结缔组织面积、舌侧结缔组织面积随C s P 用药时间的延长而呈减弱趋势，但无统计学差异。此外，2 组大鼠牙龈组织内均未见到炎性细胞浸润和水肿现象。结果表明，在本实验周期内，C s P 可分别诱导大鼠牙龈上皮和结缔组织面积增加，为药物性牙龈增生而非牙龈炎症导致。但是牙龈结缔组织由胶原纤维、细胞和基质组成，其间有大量血管通过【1】。C s P 对牙龈结缔组织面积的影响究竟源于对结缔组织和或血管还需进一步研究。本实验组织形态学观察还显示，C s P 使牙龈上皮增厚是非均匀性的，即上皮增厚和上皮钉突增多伸长变宽主要发生在附着龈近膜龈联合处。各实验组大鼠颊侧牙龈最长钉突长度显著大于对照组瞅O 0 1)，舌侧牙龈最长钉突长度与对照组相比较差异无统计学意义。给药1 0、2 0、3 0d 时，大鼠颊侧最长钉突长度呈逐渐增加趋势，此结果与硝苯地平诱导的大鼠牙龈上皮增生分析结果相似，所不同的是硝苯地平诱导的大鼠牙龈增生部位在龈乳头处旧：给药4 0d 时颊侧最长钉突长度伸长程度弱于给药3 0d 时。结果表明，C s P 可诱导大鼠牙龈上皮面积增加和上皮钉突伸长，并且C s P 对牙龈上皮的影响具有部位特异性，即颊侧附着龈近膜龈联合处的牙龈上皮可能为C s P 作用的靶部位。服用C s P 的大鼠牙龈上皮组织观察分析结果与在临床上观察到的C 8 P 诱导牙龈增生的患者体征相符，而临床上这种患者牙龈乳头体积增大可能主要源于菌斑微生物的刺激。C s P 对牙龈上皮影响的这种部位性差异发生机制尚需深入研究。在本实验周期内，C s P 对大鼠牙龈颊侧上皮面积、颊侧和舌侧结缔组织面积的影响随用药时间的延长而呈减弱趋势，此结果与S p o l i d o r i o 等【嘲对大鼠牙龈结缔组织宽度和高度的测量结果相似。但是与以往研究不同的是，本研究采用析因设计资料的方差分析不仅可以分析实验组与对照组的差异，还可以同时分析各时间点间的差异。结果可见在时间主效应下，C s P 对大鼠牙龈的影响并无统计学差异，可以认为短期内C s P 对大鼠牙龈的影响无时间依赖性，但C s P 对大鼠牙龈的长期影响尚需进一步研究。致谢：哈尔滨医科大学基础医学院形态学中心黄淇、毕延忠老师，哈尔滨医科大学口腔医学院口腔病理教研室赵尔扬教授。【参考文献】【l】孟焕新牙周病学瞰】3 版北京：人民卫生出版社。2 0 0 8：1 2 一1 3。1 8。1 4 5 M E N GH 嘞一x i n P e r i o d o n t o l o g y 叫】3 r de d B e i j i n g：P e 叩l e 亭M e d i c a lP u b l i 8 h i l l gH o u 8 e，2 0 0 8：1 2 一1 3，1 8，1 4 5【2】刘培红，马肃环孢素诱导牙龈上皮细胞增生的机制叨国际口腔医学杂志，2 0 0 9，3 6(1)：8 l 一8 3 U UP e i-h o l l g，M AS u P g t l l o g e 北8 i so fC i c l 0 8 p 谢n i n d u c e dg i n g i 划印汕e l i a lh y p e f p l a 8 i 棚h tJs I o 眦吼2 0 0 9 3 6(1)：8 1 8 3【3】R a t e i t 8 c h a I【一P l n E M，H e 舳A，U r t h e r 咒e ta 1 I l l i t i a lo b 一眈n，a l i t l l a tc y c l o B p o l i n Ai n d u c e 8g i n g i v a le n l a r g e m e n ti nm 锄田JC I i nP e r i o d o n t o L1 9 8 3，l O(3)：2 3 7 2 4 6 4】G B uC H，C h 伽T C，C l l i uH C，毗B 1 E 珏b c t0 fc y c l 0 8 p o r i nAo nt l l e 眈p r 8 i o n0 fi n d u c i b l eI l i 试co x i d es y I l t l l 船ei l lt I I eg i n g i v ao f 舳 刀J 晰o d o n t o l 2 0 0 5，7 6(1 2)：2 2 6 0 2 2 6 6【5】T uH P C h e nr r S l l i e hY S e lB 1 C y c l p o n i m l u c e dd 鲫咖它一g I I l“仰o ft I l ee 砷s s i 明0 fE c a d l l e r i nd u r i I I g 肚训0 fe d e m l l l sg i n g i v a le p i t l”l i u mi n 胁田JP e r i o d o n t 吐2 0 0 6，7 7(5)：8 3 2 8 3 9 网崔淑芳实验动物学瞰l3 版上海：第二军医大学出版社2 0 0 r 7：1 1 5 3 1 0 C u IS h u f a n g L 丑b o 唧锄i m a l8 c i e n c e【M】3 I de d S h 舳g l B i：n e2 n dA r m yM e d i c a lC o u e g eP I l b I i s h i n gH 0 u，2 0 0 7：1 1 5，3 lo【7】N i 8 l l i k a w aS，N a 差华妇T，M o r i 舶“I，e tB 1 P 口山o g e n e 8 i 8o fd m g i n d u c e dg i n g i v a lo v e r；g r a w t h A 他“e w0 f 咖d i e Bi l It I I er 砒m o d e l田JP e r i o d o n t o l，1 9 9 6，6 7(5)；4 6 3 埘1【8】W e i l l b e r：gM A，B r a lM h b o 呲o r ya r 曲l a lm o d e l si n 删o d o n t o l o 酬J】JC hP e r i o d o n t o l，1 9 9 9，2 6(6)：3 3 5 3 4 0【9】S p o l i d o r i oL C，S p o l i d o r i oD M，B e r 城陋C，e ta 1 C 讲n b i I 把d 枷f e c t 80 fc y c l p o r i n 柚dl l i f 毛d i p i n eo ng i n g i v a lo v e r g r a w t l li nm t 8i sn o ta g ed e p e n d e n 棚J 蹦0 d 佣t a lR e s，2 0 0 3，3 8(4)：3 7 5 3 7 9【l o】S p o l i d 谢oI J c，S p o l i d 谢oD M，H o l z h 眦nM E&c t 8o fl o I I g 一咖c y c l o s p o r i nt I I e m p y t l I e 删o d o 埘啪0 fr a t 8 忉JP e r i 一0 d o n t a lR e B。2 0 0 4。3 9(4)：2 5 7 2 6 2 11 1P r a b h uA，M e h t aD S Am o r p h o l o g i cc o m P“嘲o fg i n g i v a lc h a n g e si n n u e n c e db yc y c l p o r i n 明dt 雠r o l i I 加8i nm 协：A n既p 耐眦n t a ls t l I d y 们JP e r i o d o n c o l，2 0 0 6，7 7(2)：2 6 5 2 7 0【1 2】C e 血l k a y aB O，A c i k g o zG，A y d i n0 e tA 1 1 k 弛L“o m h i pb e t w np m U f e r a l i n gc e Un u c l e 甜a n t i 雷e ne l p 陀B s i 吼锄dh i s t o m o r p h o m e 耐c a la l t e r a t i 咖i nc y c l o s p o r i nA i n d u c e dg i r l g i v a lo v 盯一g r o w t I Ii nr a t 8【J】T 假i c o lP 目t l l o】，2 I)0 1 6，3 4(2)：1 8 0 1 8 6【1 3】s h i“锄Y，k aM，s e t oH c ta I N 如d i p i n ei n d u c e sg i n g i v B I 叩i t I I e l i a lh y p e 甲l 舶i ai n 豫t st l l r o u g hi r I I I i b i t i o fa p o p t i 8叽JP e r i o d o n t 0 1 2 0 0 2 7 3(8)：8 6 l 一8 6 7(本文编辑王晴)万方数据