咬合力缺失对牙槽骨中成骨与纤毛基因表达变化的实验研究.pdf

探究咬合力缺失牙槽骨中成骨基因与初级纤毛基因表达变化的相关性。方法：建立 6 周龄雄性野生型（wild type，WT）小鼠右侧下颌咬合力缺失模型，将左侧作为自身对照。2 周后收样，应用微型 CT（micro-CT）扫描分析骨改建情况。用组织学染色法观察骨组织内细胞改变情况，实时定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）法检测成骨及破骨基因表达。用荧光染色法观察初级纤毛改变情况，并检测纤毛相关基因表达。对成骨与纤毛相关基因表达水平行Pearson相关性分析，用荧光染色法观察二者分布情况。结果：小鼠下颌失力侧骨体积分数（bone volume/total volume，BV/TV）显著下降（P0.05）。成骨细胞减少伴基因表达量降低，破骨细胞反之（P0.01）；纤毛出现率和基因表达显著下降（P0.05）。小鼠失力侧的成骨与纤毛相关基因表达呈正相关关系（P0.05）；成骨细胞位于根分叉顶部，且表面有初级纤毛分布。结论：咬合力缺失后，牙槽骨密度降低、骨吸收加快，成骨细胞和纤毛数量均显著减少，相关基因表达下降，且二者呈正相关。关键词咬合力缺失；成骨细胞；初级纤毛；牙槽骨改建中图分类号 R782 文献标志码 ADOI：10.12439/kqhm.1005-4979.2023.04.001Occlusal hypofunction affects the gene expression of osteoblast and primary cilia in the alveolar bone:An experimental studyHU Lingwei,SUN Yao(Department of Oral Implantology,Stomatological Hospital and Dental School of Tongji University,Shanghai Engineering Research Center of Tooth Restoration and Regeneration,Shanghai 200072,China)Abstract Objective:To investigate whether the gene expression changes of the primary cilia and osteoblast in the alveolar bone are associated with occlusal hypofunction.Methods:The unloading model was established in the right mandible on 6-week-old wild type(WT)male mice and the left side was used as a self-control study.Samples were sacrificed 2 weeks after the operation,and the parameters of alveolar bone were scanned and analyzed by micro-CT.The changes in the number and position of osteoblasts and osteoclasts were observed histologically,and real-time quantitative polymerase chain reaction(RT-qPCR)was used to detect the expression of osteoblastogenesis and osteoclastogenesis.The changes in the number and location of primary cilia were observed by co-staining,and the expression of cilium-related genes was detected.The Pearson correlation analysis was used to detect the expression of cilium-related genes and osteoblastogenesis,and the colocalization was observed by co-staining.Results:Analysis of the unloading side revealed a significant decrease in bone volume/total volume(BV/TV)(P0.05).The number of osteoblasts decreased while the number of osteoclasts increased significantly(P0.01).Both the occurrence rate of primary cilia and expression of cilium-related genes showed a decreasing trend(P0.05).Furthermore,the expression of osteoblastogenesis and intraflagellar transport genes were significantly correlated(P0.05).Co-staining results showed that osteoblasts were located on the top of root furcation,and there were primary cilia on the surface.Conclusion:The parameters of alveolar bone on the experimental side were significantly decreased and bone resorption accelerated on the unloading side.Both the number of osteoblasts and primary cilia as well as the expression of related genes decreased significantly and the expression levels 收稿日期：2022-09-29接受日期：2023-03-20基金项目：国家自然科学基金(81822012)作者简介：胡凌玮，硕士研究生.E-mail:通信作者：孙瑶，教授.E-mail:基础研究口腔颌面外科杂志 2023 年 8 月 第 33 卷 第 4 期Journal of Oral and Maxillofacial Surgery Vol.33 No.4 August,2023 204 of related genes were positively correlated.Keywordsocclusal hypofunction;osteoblast;primary cilia;alveolar bone remolding二抗（Invitrogen 公司，美国）一起用于免疫荧光：Runx2 抗体（Thermo Fisher Scientific 公司，美国）、乙酰化-微管蛋白（-tubulin）抗体、Arl13b 抗体（Proteintech 公司，美国）；4，6-二脒基-2-苯基吲哚（4，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（Sigma 公司，美国）；直立荧光显微镜（Nikon 公司，日本）；逆转录试剂盒（Roche 公司，瑞士）；PCR SYBR Green Master Mix（上海翊圣生物科技有限公司，中国）；Light Cycler 96 实时荧光定量 PCR 仪（Roche 公司，瑞士）。1.3实验方法1.3.1Micro-CT 数据分析小鼠经 4%多聚甲醛灌流并固定 48 h 后，取两侧下颌骨用 micro-CT 扫描，采用 Mimics 13.0 软件（Materialise 公司，比利时）行分析重建。取下颌第一磨牙根分叉处牙槽骨作为感兴趣区域（region of interest，ROI），即从根分叉顶点至两根尖连线处,分析 ROI 的骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数目（trabecular number，Tb.N）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁分离度（trabecular space，Tb.Sp）。1.3.2小鼠取材固定和切片小鼠的下颌骨灌流收样后在 4 4%多聚甲醛中固定。脱钙 1 个月后经组织处理仪梯度脱水，用石蜡包埋。切取 4 mm厚切片并将其贴附在载玻片上，对每个样本模型的同一截面进行组织学检查分析。1.3.3形态学染色选取适当切片，经二甲苯及梯度乙醇脱蜡水化，采用标准程序进行 HE 染色、TRAP 染色。随后经烘箱烤干、二甲苯透明后用中性树脂封片，直立显微镜下观察并摄片。1.3.4免疫荧光染色将组织切片在二甲苯及梯度乙醇中脱蜡，于37 恒温箱中用透明质酸酶修复后用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤 3 次，每次 5 min。在 37 温箱中用 5%山羊血清封闭样品 1 h。加入一抗 4 孵育至少 12 h，PBS 洗涤 3 次，每次 5 min。加入相应的荧光二抗，在室温下孵育 1 h 后洗净。加入 DAPI 孵育 5 min后洗净，使用的一抗为 Runx2、Arl13b、-tubulin，每个实验进行 3 次重复。1.3.5RNA 提取及实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）分析分别收集小鼠两侧第一磨牙下方牙槽机械刺激影响骨的发育、维持和重塑，其在骨量和骨骼结构的调节中发挥重要作用1。牙槽骨终身改建活跃，能积极响应力学刺激（如咬合负荷）2。咬合接触丧失（如早期牙齿缺失或延迟修复）会导致牙槽骨重塑及其支持组织的丧失3-6。作为一种重要的骨骼发育相关的细胞力学刺激感受器，初级纤毛是细胞膜上的非运动性独特突起7，能耦合大量受体和离子通道8，接收机械信号后启动级联信号介导机械成骨及骨改建过程9。纤毛基因突变会导致窒息性胸廓发育不良、短肋多指综合征等多种骨骼发育疾病10。因此，本研究通过建立小鼠牙槽骨咬合力缺失模型，探究力学刺激缺失的下颌骨的骨改建过程，对改善临床患者口腔咬合力缺失导致牙槽骨丧失的治疗具有积极意义。1材料和方法1.1动物模型建立选取 24 只 6 周龄的雄性野生型（WT）小鼠，体质量为 1520 g。采用异氟烷对小鼠行吸入性麻醉，麻醉显效后牵拉口角，暴露术野，用碘伏消毒，取尖头直镊夹持右侧上颌第一磨牙的颊舌侧，进行持续轻度地颊舌向摇动，无须使用垂直向脱位力即可完整拔除磨牙，脱位后仔细检查是否断根，并采用干棉球充分止血。术后密切观察小鼠生理状况，及时应用镇痛和消炎药物。于拔牙术后 2 周收取两侧下颌骨样本用于后续研究，观察咬合力缺失的下颌第一磨牙根分叉处牙槽骨（以下简称咬合力缺失组）和咬合力正常的下颌第一磨牙根分叉处牙槽骨（以下简称对照组）的变化。实验小鼠购于斯贝福（北京）生物技术有限公司，清洁等级为 SPF 级，实验在同济大学附属口腔医院伦理委员会的批准 批准号：（2022）-DW-06 下进行。1.2主要仪器与试剂Micro-CT 机（Scanco Medical 公司，瑞士）；石蜡切片机（Thermo Fisher Microm 公司，美国）；苏木精-伊红（hematoxylin and eosin，HE）染色试剂盒（上海威奥生物科技有限公司，中国）；抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）染色试剂盒（Sigma 公司，美国）；以下一抗与 AlexaFluor 口腔颌面外科杂志 2023 年 8 月 第 33 卷 第 4 期Journal of Oral and Maxillofacial Surgery Vol.33 No.4 August,2023 205 1.4统计学分析所有数据结果均采用 GraphPad Prism 9.0 软件（GraphPad Software 公司，美国）进行统计学分析，2 组 比较通过Students t检验进行，相关性分析采用Pearson相关分析检验，以 P0.05 认为差异有统计学意义。2结果2.1失去咬合力后,第一磨牙根分叉处 BV/TV 下降取拔牙 2 周的 6 周龄 WT 小鼠下颌骨行 micro-骨，使用 TRIzol 法提取 RNA，经逆转录后进行 RT-qPCR，分析基因表达情况。按以下条件反应：95 初始变性 30 s，95 变性 5 s，55 复性 10 s，72 表 1RT qPCR 引物序列Table 1Primer sequences for RT-qPCR基因名正向引物序列(5-3)反向引物序列(5-3)GADPHTGTGTCCGTCGTGGATCTGACCTGCTTCACCACCTTCTTGAOsterixTCTCTCCATCTGCCTGACTCGTCAGCGTATGGCTTCTTTGRunx2GCACAAACATGGCCAGATTCAAAGCCATGGTGCCCGTTAGALPGATCATTCCCACGTTTTCACATTTTCACCGTCCACCACCTTGTCTSKGAAGAAGACTCACCAGAAGCAGTCCAGGTTATGGGCAGAGATTIFT140CAGACCTGGACAGCACCATCCAGTGCGCTGGTCCACATAGIFT144CAGTATTCACGGGCACTAAAGCGTACTTGGCGTCCTTTGGCIFT88TGAGGACGACCTTTACTCTGGGAAAACCCGTGTCATTCTCCAABBS2CCTCATGGACCAACACGAGCGTTCCAAACGTCCTGTTCCAAEVCTGCTGGCTGGGAATATCCTGGGGCTTCTCTTGAAATATCGCT?A.下颌第一磨牙根分叉处牙槽骨micro-CT三维重建剖面图；B.下颌第一磨牙根分叉处牙槽骨X线片扫描分析图，白色虚线圈指示骨量分析区域；CF.对照组及咬合力缺失组 BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp 的定量分析结果，*表示 P0.05，*表示 P0.01，*表示 P0.001，与对照组比较。图 1Micro-CT 扫描结果和定量分析结果Figure 1Results of micro-CT scanning and quantitative analysis退火延伸 15 s，总计 45 个循环。用 2-Ct 法计算目的基因相对表达量，以 GADPH 作为内参对照。扩增反应所用引物序列见表 1。CT 扫描和三维重建。micro-CT 结果（图 1A）显示，相较于对照组，咬合力缺失的第一磨牙根分叉处牙槽骨的近冠方 1/2 牙槽骨骨小梁分散稀疏，分布明显空腔，骨吸收陷窝数量增加；近根方 1/2 处腔隙显著扩大。X 线片结果（图 1B）显示，根分叉处牙槽骨透射范围增大。定量分析结果表明，咬合力缺失组牙槽骨 BV/TV、Tb.N、Tb.Th 较对照组均明显降低，Tb.Sp 明显上升，以上所有差异均有统计学意义（P0.05，图 1CF）。口腔颌面外科杂志 2023 年 8 月 第 33 卷 第 4 期Journal of Oral and Maxillofacial Surgery Vol.33 No.4 August,2023 206 2.2咬合力缺失导致牙槽骨内成骨细胞减少，破骨细胞增加HE 染色法观察建模 2 周后的组织，见牙周膜厚度变小，下方牙槽骨内腔隙增多，骨小梁分散稀疏（图 2A）。TRAP 染色观察建模 2 周后样本，相较于对照组，咬合力缺失组牙槽骨中骨吸收陷窝增加，大 量破骨细胞分布于骨陷窝表面，提示此时破骨过程活跃，且骨单位长度破骨细胞数量（osteoclast number per bone perimeter，Oc.NB.Pm）显著高于对照组（P0.001，图 2BC）。Runx2 和 Osterix 是指导骨间充质细胞 进入成骨细胞谱系的关键转录因子11。对建模 2 周 后的样本进行免疫荧光染色，Runx2 作为成骨细胞特异性的转录因子表达减少（图 2D），提示此时成骨过程活跃性下降，且骨单位长度成骨细胞数量（osteo-blast number per bone perimeter，Ob.NB.Pm）显著低于 对照组（P0.01，图 2E）。应用 RT-qPCR 法观察咬合力缺失状态下牙槽骨内成骨及破骨相关基因表达变化，结果显示，相较于对照组，成骨相关基因 Runx2、前成骨细胞转录因子 Osterix 表达量下降（P0.05），破骨基因 CTSK 表达量升高（P0.05，图 2FH）。?(?)?(?)?(?)?(?)?(?)?(?)?A.建模 2 周后对照组及咬合力缺失组 HE 染色结果；BC.建模 2 周后对照组及咬合力缺失组 TARP 染色及破骨细胞数量统计结果，黑色箭头指示破骨细胞；DE.Runx2 免疫荧光共染及成骨细胞统计结果，绿色标记 Runx2,蓝色标记细胞核,白色箭头指示成骨细胞表达部位；FH.对照组及咬合力缺失组成骨及破骨相关基因表达水平。*表示 P0.05，*表示 P0.01，*表示 P0.001，与对照组比较。图 2牙槽骨组织学染色情况与成骨及破骨相关基因的表达情况Figure 2Histological staining of alveolar bone and the expression of genes related to osteoblast and osteoclast口腔颌面外科杂志 2023 年 8 月 第 33 卷 第 4 期Journal of Oral and Maxillofacial Surgery Vol.33 No.4 August,2023 207 2.3咬合力缺失处初级纤毛相关基因表达量下降，牙槽骨成骨细胞内纤毛数量减少作为纤毛的常用标记物，Arl13b 基因编码 ADP核糖基化因子样家族的成员，编码蛋白是包含 N 末端和 C 末端鸟嘌呤核苷酸结合基序的小 GTP 酶，该蛋白定位于纤毛，在纤毛形成和纤毛维持中起到作用12。-tubulin 作为纤毛轴丝的组分，乙酰化蛋白与调节微管稳定性、细胞运动和轴突再生相关13。通过免疫荧光标记 Arl13b 和-tubulin 后的结果表明，咬合力缺失组及对照组的牙槽骨中都存在初级纤毛，主要分布于牙周膜下方的牙槽骨处，且在咬合力缺失组中数量减少（图 3A）。应用 RT-qPCR法观察咬合力缺失状态下牙槽骨内纤毛转运蛋白及组件相关基因表达变化，结果显示，相较于对照组，纤毛转运蛋白复合体 A 的组分 IFT140、纤毛转运蛋白复合体 B 的组分 IFT88 14的相关基因表达水平均显著下降。BBS2 作为 BBSome 的复合物的组分，参与纤毛振动频率的调节与纤毛运动15；EVC 纤毛复合体亚基 1（EVC）位于纤毛基底和纤毛膜上，是质膜蛋白复合物的组分16，两者相关基因也存在明显下降趋势，以上所有差异均具有统计学意义（P0.05，图 3BE）。?A.-tubulin 和 Arl13b 免疫荧光共染结果，红色标记 -tubulin，绿色标记 Arl13b，蓝色标记细胞核，白色箭头指示初级纤毛表达部位；BE.WT 小鼠咬合力缺失处初级纤毛相关基因表达水平变化，*表示 P0.05，*表示 P0.01，*表示 P0.001，与对照组比较。图 3咬合力缺失处牙槽骨成骨细胞纤毛减少Figure 3The primary cilia were reduced in the unloading alveolar bone2.4咬合力缺失侧牙槽骨中纤毛基因与成骨基因的表达变化具有正相关性通过对第一磨牙根分叉处牙槽骨中成骨细胞特异性基因 Osterix、ALP 相关基因及纤毛转运蛋白特异性基因 IFT144、IFT140 的表达水平分别进行相关性分析，结果显示，Osterix 与 IFT140（r=0.749，P=0.020）、IFT144（r=0.830，P=0.006）的表达具有正相关性；ALP 与 IFT140（r=0.739，P=0.023）、IFT144（r=0.697，P=0.037）的表达具有正相关性（图4AD）。牙槽骨内Runx2和-tubulin免疫荧光共染色结果显示，牙槽骨表面的成骨细胞与初级纤毛共定位。成骨细胞主要分布在第一磨牙根分叉顶部，即咬合刺激直接作用区域，且细胞表面存在初级纤毛分布（图 4E）。上述结果说明，力学刺激变化时，成骨细胞与初级纤毛的生成呈正 相关。口腔颌面外科杂志 2023 年 8 月 第 33 卷 第 4 期Journal of Oral and Maxillofacial Surgery Vol.33 No.4 August,2023 208 3讨论临床上咬合功能或咬合接触缺失，如开颌错颌、早期牙齿缺失、先天性牙齿缺失或延迟修复会导致局部牙槽骨及其支持组织的丧失，牙槽骨上的咬合力卸载会导致牙槽骨和牙周组织的萎缩性变化3-6。拔除对颌牙造成的咬合力缺失在 2 周后可引发牙槽骨骨量丢失，是研究牙槽骨稳态破坏的重要模型。骨稳态取决于各种激素和细胞因子调节的破骨细胞和成骨细胞活性之间的平衡17。本研究发现，在咬合功能减退的初始阶段，骨形成受到抑制，骨吸收显著加速。成骨细胞减少，破骨细胞增加，成骨相关因子表达水平明显下调，破骨因子表达水平明显上调，提示该因素导致的骨改建过程与成骨及破骨细胞密切相关。研究18表明，在力学刺激突变的情况下，成骨细胞容易受到局部组织压力变化的直接影响。在机械力变化导致的骨改建过程中，成骨细胞中多个机械敏感感受器激活，并响应外部信号。主要机械传感器包括细胞骨架、基于整合素的黏着斑、基于连接蛋白的细胞间连接、离子通道、细胞外基质和初级纤毛等19，初级纤毛存在其独特的突出结构和功能特异性20。本研究发现，在力学刺激减弱后，作为直接感受机械刺激的初级纤毛数量发生了显著下降，纤毛转运蛋白与纤毛蛋白组件基因表达水平均有明显降低。研究21表明，仅在原发性纤毛存?(?)?(?)?AD.咬合力缺失组牙槽骨中纤毛相关基因与成骨相关基因表达水平的相关性分析；E.Runx2 和-tubulin 免疫荧光共染结果，绿色标记 Runx2，蓝色标记细胞核，红色标记 -tubulin，白色箭头指示 Runx2 阳性的成骨细胞，右下角白色方框内为放大 4 倍的成骨细胞，成骨细胞膜上可见纤毛分布。图 4咬合力缺失侧牙槽骨中纤毛相关基因与成骨相关基因表达水平的相关性分析Figure 4Correlation analysis of genes associated with primary cilia and osteoblastogenesis in the unloading alveolar bone口腔颌面外科杂志 2023 年 8 月 第 33 卷 第 4 期Journal of Oral and Maxillofacial Surgery Vol.33 No.4 August,2023 209 在时，机械刺激例如流体剪切应力才能调节成骨细胞基因的表达和成骨细胞分化。本研究中，当牙槽骨力学刺激减弱时，纤毛出现率及相关基因均有明显下降趋势，表明初级纤毛可能直接参与骨组织的机械转导，在力学传感中起重要作用。本研究发现，牙槽骨失去咬合力刺激时，细胞纤毛中纤毛转运蛋白相关基因下降，且成骨细胞中的相关基因表达水平明显下调，同时初级纤毛及成骨细胞在牙槽骨中的出现率均显著下降。两者关联性分析结果显示，力学刺激变化时，初级纤毛与成骨细胞在基因表达水平和数量上存在显著正相关关系。成骨细胞表面存在初级纤毛的共定位，且咬合力缺失侧成骨细胞及纤毛同步减少，表明两者具有数量和位置分布的相关性。当力学刺激发生变化时，初级纤毛能及时感知这一变化并传导至成骨细胞内，从而调控成骨细胞的功能及分化。研究 22表明，应变或压缩形式的机械负荷改变会导致纤毛缩短并减少 Hedgehog 信号转导，机械刺激可以改变成骨细胞初级纤毛的形态或数量，影响关键 Hedgehog 成分（如 SMO、Arl13b 和 Ptch1）的纤毛向运输，从而调节 Hedgehog 信号转导和下游机械调节。综上所述，本研究发现在牙槽骨的改建过程中，骨组织的丧失与机械刺激减少密切相关，成骨细胞由于缺乏机械刺激导致成骨活性下降。作为感受机械刺激的重要细胞器，初级纤毛出现率和成骨细胞数目均显著下降，呈显著正相关。本研究发现，咬合力学刺激缺失后，初级纤毛数量会下降，表明初级纤毛在介导力学刺激过程中有重要作用。参考文献：1 Man J,Graham T,Squires-Donelly G,et al.The effects of microgravity on bone structure and functionJ.NPJ Micro-gravity,2022,8(1):9.2 Lin WM,Li QW,Zhang DT,et al.Mapping the immune microenvironment for mandibular alveolar bone homeostasis at single-cell resolutionJ.Bone Res,2021,9(1):17.3 Rusu Olaru A,Popescu MR,Dragomir LP,et al.Clinical study on abfraction lesions in occlusal dysfunctionJ.Curr Health Sci J,2019,45(4):390-397.4 Motokawa M,Kaku M,Matsuda Y,et al.Effects of occlusal hypofunction and its recovery on PDL structure and expression of VEGF and bFGF in ratsJ.Clin Oral Investig,2015,19(4):929-935.5 Liu J,Jin ZL,Li Q.Effect of occlusal hypofunction and its recovery on the three-dimensional architecture of mandibular alveolar bone in growing ratsJ.J Surg Res,2015,193(1):229-236.6 Walker CG,Dangaria S,Ito Y,et 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59。参数与偏差范围的表示：数值范围 31038103不能写成 38103；百分数范围 20%30%不能写成2030%；具有相同单位的量值范围，前一个量值的单位可省略，如 1.53.6 mA 不必写成 1.5 mA3.6 mA；偏差 范围（251）、（1002）%不能写成 251、1002%。尺寸单位的数值相乘按 50 cm80 cm100 cm书写，不能写成 5080100 cm 或 5080100 cm3。2 计量单位“物质的量”单位用摩尔（mol）表示。统一用升（L）作为表示体积基准单位的分母（不用 mm3、dL 等）；浓度单位为 mol/L、mmol/L、mol/L；压强单位用 kPa（或 Pa）；转速单位用 r/min；放射性活度单位为 Bq；吸收剂量单位为 Gy；时间表示用国际符号，即 d（天）、h（时）、min（分）和 s（秒）；计量单位采用国际符号，用正体书写，并注意字母大小写；量符号必须用斜体字母表示。同一组合单位内不得有2条或2条以上斜线，如 mg/kg/d 应改为 mg/(kg d)或 mg kg-1 d-1。3 统计学符号统计量符号均用斜体字母表示。如，样本大小用 n，样本算术平均数用小写 x，