液相色谱基础知识——HPLC与UPLC课件_Waters.pdf

2010 Waters Corporation液相色谱基础知识液相色谱基础知识HPLC与与UPLCWaters 北京实验室北京实验室袁汉成袁汉成Han_cheng_010-52093814139100057642010 Waters Corporation色谱法简介色谱法简介?色谱法(色谱法(Chromatography)溯源)溯源100多年前俄国植物学家100多年前俄国植物学家Tswett(茨维特茨维特)分离植物色素时采用的实验方法分离植物色素时采用的实验方法他将植物色素的石油醚提取液倒入装有碳酸钙的直立玻璃管,再加入石油醚使其自由流下,结果色素中各组份互相分离形成各种不同颜色的谱带他将植物色素的石油醚提取液倒入装有碳酸钙的直立玻璃管,再加入石油醚使其自由流下,结果色素中各组份互相分离形成各种不同颜色的谱带Tswett用希腊语用希腊语chroma(色)和(色)和graphos(谱)描述他的实验方法，即现在的(谱)描述他的实验方法，即现在的Chromatography(色谱法)(色谱法)2010 Waters Corporation一根长玻璃管填充碳酸钙的颗粒一根长玻璃管填充碳酸钙的颗粒将碾碎之植物叶片的提取液灌入柱中将碾碎之植物叶片的提取液灌入柱中随着石油醚提取液向下流过柱子，现出展宽的色带随着石油醚提取液向下流过柱子，现出展宽的色带分离出不同的化合物分离出不同的化合物Chromato-颜色颜色Graphy-图像图像Tswett 的实验的实验注注:Tswett：俄文的意思是颜色：俄文的意思是颜色2010 Waters CorporationTswett 的色谱实验装置的色谱实验装置2010 Waters Corporation色谱法原理色谱法原理?色谱法的原理色谱法的原理 是利用混合物中各组份在不同的两相中溶解,分配,吸附等化学作用性能的差异,当两相作相对运动时,使各组分在两相中反复多次受到上述各作用力而达到相互分离是利用混合物中各组份在不同的两相中溶解,分配,吸附等化学作用性能的差异,当两相作相对运动时,使各组分在两相中反复多次受到上述各作用力而达到相互分离 两相中有一相是固定的,叫作两相中有一相是固定的,叫作固定相固定相(Stationary Phase),有一相是流动的,称为,有一相是流动的,称为流动相流动相(Mobile Phase),流动相又叫流动相又叫洗脱剂洗脱剂,溶剂溶剂?相相(Phase):物理化学术语物理化学术语,特指在某一系统中特指在某一系统中,具有相同成分及相同物理、化学性质的均匀物质部分。各相之间有明显可分的界面。具有相同成分及相同物理、化学性质的均匀物质部分。各相之间有明显可分的界面。2010 Waters Corporation色谱法原理色谱法原理分离是一个物理过程分离是一个物理过程固定相固定相(Stationary Phase)流动相流动相(Mobile Phase)进样进样(Injection)洗脱洗脱(Elution)相互作用相互作用(Interaction)2010 Waters Corporation色谱法的分类色谱法的分类?按流动相的按流动相的物态物态分:分:气相色谱气相色谱(Gas Chromatography,GC)用气体作为流动相(又叫载气)用气体作为流动相(又叫载气)液相色谱液相色谱(Liquid Chromatography,LC)用液体作为流动相(又叫洗脱剂)用液体作为流动相(又叫洗脱剂)?按固定相的按固定相的形态形态分:分:平面色谱平面色谱o纸色谱纸色谱o薄层色谱薄层色谱柱色谱柱色谱2010 Waters Corporation色谱法分类示意图色谱法分类示意图色谱液相色谱柱色谱纸色谱薄层色谱高效液相色谱HPLC高效液相色谱HPLC气相色谱2010 Waters Corporation色谱法的分类色谱法的分类?按流动相和固定相的按流动相和固定相的相对极性相对极性分:分:正相色谱正相色谱(Normal Phase Chromatography)o固定相的极性大于流动相固定相的极性大于流动相反相色谱反相色谱(Reversed Phase Chromatography)o固定相的极性小于流动相固定相的极性小于流动相?有机化合物的极性有机化合物的极性分子间作用力分子间作用力(静电引力静电引力,偶极力偶极力,色散力色散力,氢键力氢键力)综合表现的一种描述综合表现的一种描述?注意:此分类法仅适用于液相色谱注意:此分类法仅适用于液相色谱2010 Waters Corporation有机化合物极性示例有机化合物极性示例CH3COOCH3溶剂样品的官能团极性 非极性水 甲醇 异丙醇 乙腈 THF 乙酸乙酯 CH2Cl2CHCl3己烷NH3X/ArOH/RCOOH CNH2ROH RCN 醛/酮 N(R)2 NO2 卤代烷烃 烷烃2010 Waters Corporation色谱法的分类色谱法的分类?按分离过程的按分离过程的机理机理分分:吸附色谱吸附色谱(Absorption Chromatography)o 根据样品组分对活性固定相表面吸附亲和力的不同实现分离根据样品组分对活性固定相表面吸附亲和力的不同实现分离分配色谱分配色谱(Partition Chromatography)o 分离基于样品组分在固定相和流动相中的溶解度分离基于样品组分在固定相和流动相中的溶解度(分配系数分配系数)不同不同离子交换色谱离子交换色谱(Ion Exchange Chromatography)o 根据样品组份离子交换亲和力的差异分离根据样品组份离子交换亲和力的差异分离,简称离子色谱简称离子色谱(IC)体积排除色谱体积排除色谱(Size Exclusion Chromatography)o GPC(Gel Permeation Chromatography)固定相是疏水性凝胶固定相是疏水性凝胶,流动相是有机溶剂流动相是有机溶剂o GFC(Gel Filtration Chromatography)固定相是亲水性凝胶固定相是亲水性凝胶,流动相是水溶液流动相是水溶液2010 Waters Corporation?高效液相色谱法高效液相色谱法HPLC(High Performance Liquid Chromatography)是一种区别于经典液相色谱,基于仪器方法的高效能分离手段:是一种区别于经典液相色谱,基于仪器方法的高效能分离手段:o高性能色谱柱,高精度输液泵,高灵敏度检测器高性能色谱柱,高精度输液泵,高灵敏度检测器广泛应用于各个领域:广泛应用于各个领域:o医药,环保,石化,生命科学,食品工业,农业医药,环保,石化,生命科学,食品工业,农业无论在技术上还是在应用上仍有较大的发展空间无论在技术上还是在应用上仍有较大的发展空间什么是什么是HPLC?2010 Waters Corporation?超高效液相色谱超高效液相色谱UPLC(Ultra Performance Liquid Chromatography)是区别于是区别于HPLC的液相色谱新领域的液相色谱新领域基于小颗粒填料和基于小颗粒填料和LC原理的一种创新技术原理的一种创新技术实现超高分离度、灵敏度、分析速度实现超高分离度、灵敏度、分析速度是是Waters公司对液相色谱的新贡献(2004年3月正式推出)公司对液相色谱的新贡献(2004年3月正式推出)什么是什么是UPLC?2010 Waters CorporationHPLC的流程的流程 溶剂溶剂(流动相流动相)泵进样器色谱柱泵进样器色谱柱(固定相固定相)检测器废液数据系统检测器废液数据系统2010 Waters CorporationHPLC的图形结果的图形结果色谱图(色谱图(Chromatogram):):色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图,其纵坐标为信号强度,横坐标为时间色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图,其纵坐标为信号强度,横坐标为时间色谱峰时间色谱峰时间(分分)基线基线峰高峰高峰宽峰宽响应值响应值2010 Waters Corporation液相色谱图名词术语(1)液相色谱图名词术语(1)?色谱图名词术语色谱图名词术语:色谱峰色谱峰(Peak):o 色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号峰底峰底(Peak Base):o 峰的起点与终点之间连接的直线峰的起点与终点之间连接的直线峰高峰高(Peak Height):o 峰最大值到峰底的距离峰最大值到峰底的距离切线峰宽切线峰宽(Peak Width):o 在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离半半(高高)峰宽峰宽(Peak Width at Half Height):o 通过峰高的中点作平行于峰底的直线通过峰高的中点作平行于峰底的直线,其与峰两侧相交两点之间的距离其与峰两侧相交两点之间的距离2010 Waters Corporation液相色谱图名词术语(2)液相色谱图名词术语(2)?色谱图名词术语色谱图名词术语:峰面积峰面积(Peak Area):o 峰与峰底之间的面积峰与峰底之间的面积,又称响应值又称响应值标准偏差标准偏差()(Standard Error):o 0.607倍峰高对应峰宽的一半倍峰高对应峰宽的一半拖尾峰拖尾峰(Tailing Peak):o 后沿较前沿平缓的不对称峰后沿较前沿平缓的不对称峰前伸峰前伸峰(Leading Peak):o 前沿较后沿平缓的不对称峰前沿较后沿平缓的不对称峰鬼峰鬼峰(Ghost Peak):o 并非由试样所产生的峰并非由试样所产生的峰,亦称假峰亦称假峰2010 Waters Corporation液相色谱图名词术语(3)液相色谱图名词术语(3)?色谱图名词术语色谱图名词术语:基线基线(Baseline):o 在正常操作条件下在正常操作条件下,仅由流动相所产生的响应信号仅由流动相所产生的响应信号基线飘移基线飘移(Baseline Drift):o 基线随时间定向的缓慢变化基线随时间定向的缓慢变化基线噪声基线噪声(N)(Baseline Noise):o 由各种因素所引起的基线波动由各种因素所引起的基线波动谱带扩展谱带扩展(Band Broadening):o 由于纵向扩散由于纵向扩散,传质阻力等因素的影响传质阻力等因素的影响,使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象2010 Waters CorporationHPLC分离原理公式与术语分离原理公式与术语?这是一张由仪器提供的表示分离状况的色谱图这是一张由仪器提供的表示分离状况的色谱图?这张色谱图含有丰富的信息这张色谱图含有丰富的信息?现在我们来测量色谱图并以此对一些基本理论展开讨论现在我们来测量色谱图并以此对一些基本理论展开讨论2010 Waters Corporation常用的色谱参数常用的色谱参数?V-保留体积保留体积?Vo-死体积死体积?tr-保留时间保留时间?k 保留因子或容量因子保留因子或容量因子?-选择因子或分离因子选择因子或分离因子?N 塔板数塔板数?w-峰宽峰宽?R 分离度分离度2010 Waters Corporation洗脱体积和峰宽洗脱体积和峰宽?这些是导出理论和定义所必需的基本测量这些是导出理论和定义所必需的基本测量V0=无保留化合物的洗脱体积无保留化合物的洗脱体积,等于一个柱体积等于一个柱体积V1=化合物化合物1的洗脱体积的洗脱体积V2=化合物化合物2的洗脱体积的洗脱体积W2=化合物化合物2的峰宽的峰宽(以体积计以体积计)，用切线法计算，用切线法计算2010 Waters Corporation保留因子保留因子(k ):保留能力的量度保留能力的量度?k 是样品与填料作用强度的直接量度 是样品与填料作用强度的直接量度 3.5.5-2 k2=0V0V1V k1=:公式1.5.5-1 k1=9.5.5-5 k3=V0V1V2V3时间时间.5 1 2 5描述了峰距离描述了峰距离Vo有多远与流速、时间和柱子尺寸无关有多远与流速、时间和柱子尺寸无关2010 Waters Corporation保留因子保留因子k?k与组分在流动相和固定相之间的平衡有关与组分在流动相和固定相之间的平衡有关?k是一个平衡常数是一个平衡常数2010 Waters Corporation在正相和反相色谱中的保留因子k在正相和反相色谱中的保留因子k?保留因子的大小取决于流动相和固定相的极性保留因子的大小取决于流动相和固定相的极性?可以通过改变流动相中有机相的比例来改变流动相的极性可以通过改变流动相中有机相的比例来改变流动相的极性?只适用于吸附和分配色谱只适用于吸附和分配色谱2010 Waters Corporation通过改变流动相的极性改变通过改变流动相的极性改变 k2010 Waters Corporation分离因子分离因子():峰分离程度的量度峰分离程度的量度 0V1V0V2V 1k2k =或3.5-1.5-2 =12/的峰峰9 .5-1.5-5 =13/的峰峰V0V1V2V3时间时间.5 1 2 5 1,2 1,3 相邻两个峰相邻两个峰k值的比值值的比值 描述的两个峰的相对位置描述的两个峰的相对位置 取决于系统的取决于系统的“化学化学”属性属性?是两个化合物在同一套色谱系统上保留差异的数值表述是两个化合物在同一套色谱系统上保留差异的数值表述2010 Waters Corporation分离因子分离因子()的影响因素流动相的影响因素流动相?取决于流动相的取决于流动相的“化学化学”属性，即选择不同的有机相属性，即选择不同的有机相2010 Waters Corporation选择因子选择因子()固定相固定相2010 Waters CorporationN:理论塔板数 柱效的量度理论塔板数 柱效的量度?理论塔板数计算公式：理论塔板数计算公式：W方法方法Wtan16切线法切线法Wh5.54半峰高半峰高W393W4164W525521=WVN 2010 Waters Corporation理论塔板数理论塔板数(N):分离效率的量度分离效率的量度?理论塔板数或柱效是一个数值理论塔板数或柱效是一个数值,它表示作为保留时间函数的峰展宽的量度它表示作为保留时间函数的峰展宽的量度1600 N.5516 NWV16N22=100N2516NWV16N22=PW=.5PW=22010 Waters Corporation柱效的计算柱效的计算5 方法 方法2010 Waters Corporation分离度分离度(R)的定义式的定义式?简单说来,分离度即是两峰相对于其峰宽分开得有多远简单说来,分离度即是两峰相对于其峰宽分开得有多远2010 Waters CorporationR:分离程度的量度分离程度的量度?此处是几个计算分离度的实例此处是几个计算分离度的实例()2112WW21t tR+=()8.5.5211-5tR1-3=+=()2.5.5211-2tR1-2=+=t0t1t2t3时间时间.5 1 2 52010 Waters Corporation分离度方程式分离度方程式()+=1N141R分离因子柱效容量因子分离因子柱效容量因子?分离度方程式描述了分离度与选择性分离度方程式描述了分离度与选择性,柱效和容量因子之间的关系柱效和容量因子之间的关系?它是评价一张色谱图以及决定如何解决、开发和优化分离方法的依据它是评价一张色谱图以及决定如何解决、开发和优化分离方法的依据2010 Waters Corporation分离度方程式分离度方程式如果如果N增加增加2倍或倍或3倍，倍，R会怎样？会怎样？+=+=1 141RN2010 Waters CorporationN对分离度（对分离度（R）的影响）的影响2010 Waters Corporation分离度方程式分离度方程式?如果k=1,2，10，20 分离度分别是多少？()()=+1 N141R2010 Waters CorporationK对分离度的影响对分离度的影响2010 Waters Corporation分离度方程式分离度方程式?如果 1或 1.4分离度分别是多少？()()+=+=1N41R12010 Waters Corporation 对分离度的影响 对分离度的影响2010 Waters Corporation，k，N:如何控制分离度如何控制分离度?2010 Waters Corporationab5%峰高处的峰宽峰高处的峰宽色谱峰对称性的测量方法色谱峰对称性的测量方法abUSP 拖尾因子（拖尾因子（Tailing Factor）:Tf不对称因子不对称因子(Assymmetry Factor):Asab)(a2+2010 Waters Corporation中国药典对系统适用性的规定中国药典对系统适用性的规定中国药典要求对仪器进行适用性试验中国药典要求对仪器进行适用性试验,即用规定的对照品即用规定的对照品对仪器进行试验和调整对仪器进行试验和调整,要达到规定的要求要达到规定的要求或规定在分析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度、或规定在分析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度、重复性和拖尾因子重复性和拖尾因子要求要求:理论塔板数理论塔板数N大于规定值大于规定值(按半峰宽法计算按半峰宽法计算)拖尾因子拖尾因子T应在应在0.95-1.05之间之间分离度分离度R应大于应大于1.5重复性重复性:连续进样连续进样5次次,峰面积的相对标准偏差不大于峰面积的相对标准偏差不大于2.0%注注:以上数据摘自以上数据摘自2005年版中国药典年版中国药典2010 Waters Corporation液相色谱柱简介液相色谱柱简介?色谱柱是一根填满填料的管子色谱柱是一根填满填料的管子?柱管的材料柱管的材料(塑料塑料,玻璃玻璃,不锈钢不锈钢)和尺寸和尺寸(内径内径,长短长短)不尽相同不尽相同?管内的填料更是种类繁多管内的填料更是种类繁多,主要分为两大类主要分为两大类硅胶基质硅胶基质聚合物基质聚合物基质?色谱柱的性能主要取决于填料的性质和填充技术色谱柱的性能主要取决于填料的性质和填充技术2010 Waters Corporation2010 Waters Corporation色谱柱结构色谱柱结构固 定 相固 定 相筛 板筛 板2010 Waters Corporation色谱柱的装填色谱柱的装填筛板筛板球形颗粒球形颗粒无定形颗粒填充床无定形颗粒填充床(固定相固定相)填充色谱柱的流动方向填充色谱柱的流动方向2010 Waters Corporation柱填充材料类型柱填充材料类型?硅胶（无机）硅胶（无机）二氧化硅二氧化硅o与海砂相似与海砂相似?铝（无机）铝（无机）氧化铝氧化铝?锆（无机）锆（无机）?聚合物（有机）聚合物（有机）塑料塑料?杂化（无机杂化（无机/有机）有机）?碳碳2010 Waters CorporationC18 填料的合成填料的合成(1)Tetraethoxysilane(TEOS)Polyethoxysilane(PEOS)传统硅胶颗粒基质 合成步骤：合成步骤：1.合成硅胶基质基质 2.键合配体（键合相）3.端基封口硅羟基硅羟基2010 Waters CorporationC18 填料的合成填料的合成(2)键合相键合相(配体配体)：C18残留硅羟基残留硅羟基端基封口基团端基封口基团硅胶基质硅胶基质 合成步骤：合成步骤：1.合成硅胶基质 2.键合配体（键合相）3.端基封口2010 Waters Corporation带有内嵌极性配体的色谱填料带有内嵌极性配体的色谱填料 OSiCH3CH3PolarGroup内嵌极性基团配体OSiCH3CH3传统直链烷基配体(由一步合成过程而来由一步合成过程而来)?Waters Symmetry Shield RP182010 Waters Corporation四乙氧基硅烷四乙氧基硅烷(TEOS)硅甲基嵌入型聚乙氧基硅烷硅甲基嵌入型聚乙氧基硅烷(MPEOS)甲基三乙氧基硅烷甲基三乙氧基硅烷(MTEOS)Waters 专利技术荣获专利技术荣获2000年全球年全球 R&D 100 大奖大奖第一代杂化颗粒的合成过程第一代杂化颗粒的合成过程2010 Waters CorporationXBridge:第二代杂化填料的合成第二代杂化填料的合成硅胶基体中插入的桥式乙基硅胶基体中插入的桥式乙基Anal.Chem.2003,75,6781-6788美国专利号美国专利号 6,686,035 B2Tetraethoxysilane(TEOS)Bis(triethoxysilyl)ethane(BTEE)+4Polyethoxysilane(BPEOS)SiEtOEtOOEtEtOSiEtOEtOCH2EtOCH2SiOEtOEtOEtSiEtOOCH2CH2SiOSiEtOOEtSiOOOEtOSiOSiOEtOOOEtEtEtn2010 Waters Corporation不同色谱填料的选择性差异不同色谱填料的选择性差异2010 Waters Corporation?填料的品牌填料的品牌-不同硅胶颗粒基质不同硅胶颗粒基质o密度，表面积，孔径密度，表面积，孔径o纯度纯度(残留硅羟基活性不同残留硅羟基活性不同)?键合相的种类键合相的种类:C18,C8,Shield RP18?不同不同 C18配体键合水平配体键合水平o单键键合单键键合,双键键合双键键合,三键键合三键键合o配体覆盖率配体覆盖率(疏水性不同疏水性不同)选择性差异来源选择性差异来源2010 Waters Corporation用用 HETP 表示柱效表示柱效H=HETP(Height Equivalent to Theoretical Plate)要求要求 H 尽可能小尽可能小,这样就可以往柱子里这样就可以往柱子里装装更多的更多的板板N=#Plates(来自蒸馏理论来自蒸馏理论)5 块板块板10块板块板(较大的较大的 H)(较小的较小的 H)“较厚较厚”“较薄较薄”L柱长柱长HETPL N=PlateHETP2010 Waters Corporation理论塔板数理论塔板数 vs 柱效柱效每根柱子都有自己特别的曲线，取决于不同的尺寸和粒径每根柱子都有自己特别的曲线，取决于不同的尺寸和粒径只有一个流速可得到最大柱效只有一个流速可得到最大柱效优化的优化的2010 Waters Corporation范第姆特范第姆特(van Deemter)方程方程线速度=+=CBAH?范第姆特范第姆特(van Deemter)方程能够推导出流动相的线速度对给定峰的理论板高方程能够推导出流动相的线速度对给定峰的理论板高(H)的影响的影响其中其中:A项项:叫作涡流扩散项叫作涡流扩散项,与填料的颗粒度及其分布和填充技术相关与填料的颗粒度及其分布和填充技术相关B项项:叫作轴向叫作轴向(纵向纵向)扩散项扩散项,与流速有关与流速有关C项项:叫作传质扩散项叫作传质扩散项,与填料颗粒度和流速有关与填料颗粒度和流速有关HETP=Height Equivalent to a Theoretical Plate)=柱长柱长/塔板数塔板数=L/N2010 Waters Corporation流动相的线速度流动相的线速度u经典的定义：经典的定义：u0=L/t0其中：其中：L-柱长，柱长，u0 没有保留化合物的洗脱时间没有保留化合物的洗脱时间2010 Waters Corporation被分析物谱带和被分析物谱带和van Deemter A 项项XXXX谱带扩散样品分子谱带扩散样品分子填料填料溶剂溶剂XX柱内的不同流路可用来通过分子柱内的不同流路可用来通过分子.被分析物谱带展宽被分析物谱带展宽较小颗粒可以装填得更致密较小颗粒可以装填得更致密减少孔隙通道间的空间减少孔隙通道间的空间减少谱带展宽减少谱带展宽涡流扩散涡流扩散颗粒尺寸?颗粒尺寸?A 项?项?H?柱效?柱效?空隙体积或通道空隙体积或通道2010 Waters CorporationBB较慢的线速度较慢的线速度 u,(或流速或流速),更大的轴向谱带扩散更大的轴向谱带扩散=宽峰宽峰=更大的更大的“B”项项较高的线速度较高的线速度 u,谱带轴向扩散的时间减少谱带轴向扩散的时间减少=较尖锐的峰较尖锐的峰=小的小的“B”项项被分析物谱带和被分析物谱带和van Deemter B项项u?B 项?项?H?柱效?柱效?轴向扩散轴向扩散2010 Waters Corporation被分析物谱带和被分析物谱带和van Deemter C项项C 项由三部分贡献组成项由三部分贡献组成:流动相流动时的传质阻力流动相流动时的传质阻力流动相停滞时的传质阻力流动相停滞时的传质阻力固定相的传质阻力固定相的传质阻力（吸附（吸附/解吸动力学）解吸动力学）XXX谱带展宽谱带展宽XXXXXX谱带展宽谱带展宽XX谱带展宽谱带展宽传质扩散项传质扩散项2010 Waters Corporation样品样品/组分带组分带与与van Deemter 方程方程 C项项?其中：其中：Dm-流动相的扩散相关系数流动相的扩散相关系数Dsm-流动相的停滞扩散系数流动相的停滞扩散系数Ds-固定相的扩散系数固定相的扩散系数dp 粒径粒径df 固定相膜厚度固定相膜厚度cm,csm,cs是常数是常数2010 Waters CorporationVan Deemter 曲线曲线注：若线速度（流速）超过了最佳线速度，则HETP增加，塔板数降低dpcbdpaH2)()(+=线速度线速度HETP低低 HETP=优化的塔板数优化的塔板数mm/secC 项项(质量传递质量传递)B 项项(轴向扩散轴向扩散)C 项项B项项2010 Waters CorporationVan Deemter 曲线减小粒径曲线减小粒径?粒径减小，柱效增加粒径减小，柱效增加?随着粒径减小，保持高柱效的流速范围扩大随着粒径减小，保持高柱效的流速范围扩大?为同时提高分离度和流速提供了可能为同时提高分离度和流速提供了可能?颗粒成为分离的关键因素颗粒成为分离的关键因素van Deemter曲线的挑战曲线的挑战是否颗粒度的发展已经到达一个极限？2010 Waters Corporation小于小于2um的粒径的粒径-UPLC使用的填料使用的填料?Van Deemter 曲线的承诺曲线的承诺这就是这就是UPLCTM速度、灵敏度和分离度的完美结合速度、灵敏度和分离度的完美结合现有的HPLC技术亚2um 填料2010 Waters Corporation温度对柱效的影响温度对柱效的影响Van Deemter?随着温度提高，随着温度提高，HETP减小，柱效增加，得到更高的线速度，流动相粘度减小，改善了传质阻力减小，柱效增加，得到更高的线速度，流动相粘度减小，改善了传质阻力HETP,H(um)