β-catenin 蛋白H36P 突变对肝癌细胞的增殖的影响.pdf
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1、医学分子生物学杂志,2023,20(5):450-454 J Med Mol Biol,2023,20(5):450-454DOI:10.3870/j.issn.1672-8009.2023.05.012通讯作者:李勤新(电话:13891080890,E-mail:13072672 )Corresponding author:LI Qinxin(Tel:86-13891080890,E-mail:13072672 )-catenin 蛋白 H36P 突变对肝癌细胞的增殖的影响吴忠坤1,宋平辉1,张毅1,李春博1,李勤新21陕西省核工业二一五医院普通外科 陕西省咸阳市,7120002兴平市人民医
2、院儿科 陕西省兴平市,713199【摘要】目的 探究-catenin 蛋白 H36P 突变对肝癌细胞的增殖的影响。方法通过 PCR 扩增法扩增CTNNB1 基因,包括 WT-CTNNB1、G34R-CTNNB1 和 H36P-CTNNB1。通过双酶切法克隆至 p-CMV5 质粒载体,将相对应的质粒瞬转至 Huh7、HepG2 细胞中,并检测其蛋白表达情况。其次,使用 CHX 按时间梯度处理表达目的基因的细胞,比较 H36P-catenin 与 WT-catenin、G34R-catenin 的泛素化降解情况并分析蛋白稳定性。随后通过质核分离检测 H36P-catenin 核转位能力。最后,通过
3、 CCK-8 计数法检查 H36P-catenin 对肝癌细胞增殖能力的影响。结果 突变体 G34R、H36P 的蛋白质表达水平,与野生型-catenin 无明显差异。在 HepG2 细胞株中,CHX 作用 8 h 时 WT-catenin 几乎完全降解,而 G34R 和 H36P 只降解了75%和 60%。Huh7 细胞株中的情况类似,6 hrs 时 WT-catenin 几乎完全降解,而 G34R 和 H36P 只降解了约40%。以上结果差异均具有统计学意义(P0.05)。相较于 WT-catenin,G34R 和 H36P 促使 HepG2细胞增殖量提升。在表达-catenin 突变体的
4、肝癌细胞泛素化降解受抑制的情况下,与 WT-catenin、突变体 G34R 相比,表达突变体 H36P 的肝癌细胞核转位明显增加。结论-catenin 蛋白 H36P 突变蛋白表达稳定、核转位情况增多,泛素化降解过程受阻,并能促进 HepG2 和 Huh7 肝癌细胞的增殖。【关键词】-catenin 蛋白;突变;肝癌;增殖【中图分类号】R735.7Effect of-catenin H36P Mutation on Proliferation of HepatocellularCarcinoma CellsWU Zhongkun1,SONG Pinghui1,ZHANG Yi1,LI Chu
5、nbo1,LI Qinxin21Department of General Surgery,No.215Hospital of Shaanxi Nuclear Industry,Xianyan,Shaanxi,712000,China2Department of Pediatrics,Xingping Municipal Peoples Hospital,Xingping,Shaanxi,713199,China【Abstract】Objective To investigate the effect of-catenin H36P mutation on the proliferationo
6、f hepatocellular carcinoma cells.MethodsThe CTNNB1genes(WT-CTNNB1,G34R-CTNNB1,H36P-CTNNB1)were amplified by PCR amplification.It was cloned into the p-CMV5 plasmid vec-tor with a double digestion method,and the corresponding plasmids were transiently transferred intothe Huh7 and HepG2 cells.The prot
7、ein expression levels were then detected by Western blot-ting.Cells transfected with the target genes were treated with CHX in a time gradient,the degrada-tion time of the H36P-catenin,WT-catenin and G34R-catenin were compared and their sta-bilities were analyzed.The nuclear translocation ability of
8、 H36P-catenin was examined after sepa-ration of the nuclear and cytoplasmic fractions.Finally,the effect of H36P-catenin on the prolifer-ation of hepatocellular carcinoma cells was examined by CCK-8 method.ResultsThe protein ex-pression levels of-catenin mutants(G34R and H36P)were not significantly
9、different from that ofthe wild-type-catenin.In HepG2 cell line,WT-catenin was almost completely degraded byCHX in 8 hours,while the mutants only degraded 75%and 60%in the same timeperiod.Similarly,in the Huh7 cell line,WT-catenin was almost completely degraded in 6 hours,while the mutants were only
10、degraded about 40%in the same time period.The differences in the a-bove results were statistically significant(P0.05).Compared with the WT-catenin,mutant-catenin promoted the proliferation of HepG2 cell.The nuclear translocation ability of H36P mutant-catenin was increased compared with those of WT
11、and G34R mutant-catenin in the hepatocellularcarcinoma cells.Conclusion-catenin H36P mutant protein blocks the protein ubiquitination deg-radation process,promotes the proliferation of HepG2 and Huh7 hepatocellular carcinoma cells,and has an increased nuclear translocation.【Key words】-catenin;mutati
12、on;hepatocellular carcinoma cells;proliferation 肝癌(liver cancer)是一种起源于肝脏的恶性肿瘤,可分为原发性肝癌和继发性肝癌,其中后者更为常见1-3。肝癌在癌症死亡中排名第三,在恶性肿瘤发病中排名第四,严重危害患者生命安全4。既往流行病学调查显示,肝癌与寄生虫、病毒性肝炎、饮酒等因素相关。但这些因素对肝癌发生和发展的影响机制尚未明晰。目前,已有大量针对肝癌发病机制的分子生物学研究,并取得一定成果。研究已证实,肝癌发生发展与 Wnt/-cate-nin、PI3 K/Ras 信号通路异常、P53 调控的细胞周期异常、染色体重组、氧化应激等
13、机制明显相关5-8。Guichard 等9研究结果显示,肝癌中 Wnt/-catenin 信号通路异常的发生率最高,其占比超过 30%。其中,-catenin 隶属 ARM 重复蛋白超家族,由 CTNNB1 基因编码。虽然这种蛋白在进化上高度保守,但能通过 Wnt/-catenin 信号通路输出信号,并对下游效应器功能产生多样且广泛的影响。既往研究表明,这条信号通路被发现在胚胎细胞、体细胞和肝细胞的生长过程中扮演重要角色,保证组织器官正常发育和再生10-11。其通路异常产生一系列连锁反应,引起细胞异常生长发育,甚至发生癌变。近期 Hirotsu 等12研究发现,16 种肝癌突变基因中频率最高的
14、分别为 TP53 和 CTNNB1基因突变,其中 CTNNB1 基因点突变以 G34R 和H36P 为主。但目前鲜有关于 H36P 位点突变的研究,因此本研究拟讨论-catenin 蛋白 H36P 突变与肝癌细胞的增殖的影响。1 材料与方法1.1 材料与试剂人肝 Huh7 和 HepG2 细胞株及突变体 G34R 和H36P 质粒均购于上海雅吉生物科技有限公司。全部引物均由金斯瑞生物科技有限公司。主要实验试剂和药品,包括细胞培养液(上海索莱宝生物科技有限公司)、电泳染料(武汉爱博泰克生物技术有限公司)、甲醇、乙酸等试剂(国药集团)、RNA 逆转录试剂盒(德国 QIAGEN 公司)、兔-cate
15、nin 单克隆 抗 体(clone:ARC0136,武汉爱博泰克生物技术有限公司)、分子克隆试剂(美国 Invitrogen 公司)、TaqDNA 聚合酶(美国 Invitrogen 公司)、CCK-8 试剂盒(上海索莱宝生物科技有限公司)等。1.2 细胞复苏及培养取出保存的 Huh7、HepG2 细胞株后置于冰上解冻,完全解冻后 1 000 r/min 离心 5 min 移除上清,加入灭菌的新鲜培养基,吹打混合,混匀后移至 6 cm 培养皿,细胞融合度达到 80%后传代培养。传代培养时,使用 DMEM 培养液(含 10%15%胎牛血清)培养,调整密度为 3 106个/mL,置于 37 5%C
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