自然环境与人工环境下大白杜鹃根内真菌的比较_张正权.pdf

收稿日期：修回日期：基金项目：国家自然科学基金项目“横断山南段三江并流区水生真菌地理分布格局及形成机制”（）；云南省教育厅科学研究基金研究生项目“海拔对苍山杜鹃属植物内生菌根真菌多样性及群落结构的影响研究”（）；云南省教育厅科学研究基金项目“苍山杜鹃属植物菌根真菌多样性研究”（）、“苍山七种珍稀濒危杜鹃根基微生物调查分析”（）。第一作者简介：张正权（），男，硕士研究生，从事微生物生态学研究。：。通信作者：罗宗龙（），男，副教授，博士，从事真菌多样性，分类及系统发育研究。：。：自然环境与人工环境下大白杜鹃根内真菌的比较张正权，苏锡钧，沈洪苇，王 琦，王安娜，罗宗龙（大理大学农学与生物科学学院，云南 大理；泰国皇太后大学卓越真菌研究中心，泰国 清莱）摘要：为明确大白杜鹃（）在基于种子开展的人工繁育过程中与其生长发育相关的关键根内真菌类群，采用高通量测序技术，对大白杜鹃的野生植株和人工繁育植株（人工植株）根内真菌群落组成进行比较。结果显示：野生植株根内真菌的 指数、指数、指数和指数均大于人工植株，指数则相反；野生植株的根内真菌以子囊菌门（）和担子菌门（）真菌为主，人工植株的根内真菌则以子囊菌门真菌为主；在属和物种水平上，野生植株和人工植株根内真菌的优势类群具有显著差异（）；野生植株根内真菌组内离散程度开放科学标识码（码）高于人工植株；树粉孢属（）及 属真菌作为重要的杜鹃花类菌根真菌，仅在野生植株根系中分布。野生植株的根内真菌多样性、丰富度及均匀度均高于人工植株；采自景东和鲁甸的野生植株的根内真菌群落组成无显著差异，但其真菌功能存在较大差异；野生植株和人工植株的真菌群落结构和优势类群均存在显著差异（），人工植株根内真菌主要为广布型的腐生真菌和病原真菌，缺乏菌根真菌。关键词：高通量测序；大白杜鹃；菌根真菌；群落结构；优势类群中图分类号：文献标识码：文章编号：（），（，；，）：，（），（），：；野生的杜鹃属（）植物作为亚高山及高山植被景观重要的建群种类，在植物群落组成、物种共存及生物多样性维持等方面具有重要作用，但其野外生长环境往往较为恶劣，植株根系细弱森林与环境学报，（）：第 卷 第 期 年 月且无根毛，难以从环境中吸收足够养分。该科植物根系与土壤微生物形成特殊的杜鹃花类菌根（，），是其在恶劣生境中健康生长的必要条件。植物根系真菌能够显著的影响植物的养分利用效率，继而影响植物的生长状态，其中杜鹃花类菌根真菌（，）对杜鹃属植物的生长具有明显的促进作用，部分菌根真菌能产生多种水解酶和氧化酶，降解多种有机物如纤维素、木质素等，一些真菌还能分泌多铜氧化酶，促进生物胺转化，进而促进植物的养分吸收，特别是氮和磷的吸收。除此之外，根系真菌还能够提高宿主植物抵抗逆境如重金属污染、盐胁迫的能力，增加对水分胁迫的耐受性和光合效率。大白杜鹃（）是杜鹃花科（）杜鹃属物种，常绿灌木，主要分布于四川西部至西南部、贵州西部、云南西北部和西藏东南部，多生于海拔 的灌丛或森林，分布较为广泛，但对其根内真菌的研究目前主要以野生植株作为研究对象。例如：高博提取了大白杜鹃毛根中的总，经过实验分析得到了伞菌目（）、柔膜菌目（）和蜡壳耳目（）个目中的 个真菌种类（）；龙毅的研究表明，大白杜鹃的菌根真菌优势类群为子囊菌门（）真菌；对丽江玉龙雪山和昆明植物园的大白杜鹃根系进行菌株分离纯化得到了 种真菌，都属于子囊菌门，并将得到的部分菌株进行侵染实验，从合成菌根中分离得到的菌株菌落与原菌株菌落一致，对西南地区的大白杜鹃进行相关研究，指出其菌根真菌受到宿主遗传组成的影响。相较于人工培育的大白杜鹃植株，野生植株菌根真菌的研究走在前列，人工繁育植株作为实验材料开展的菌根研究较少，大白杜鹃的野生植株和人工植株根内真菌多样性及群落结构是否存在差异这一问题并未得到解决。因此，本研究将结合野生植株和人工繁育植株根系样品进行二者之间根内真菌多样性和群落组成的比较，探寻大白杜鹃人工繁育中的关键真菌类群，以期为大白杜鹃人工繁育，尤其是种子繁育提供科学依据。材料与方法 样品采集与处理云南是大白杜鹃的主要分布地之一，全省除热带外的大部分地区均有大白杜鹃分布，为使野生植株样本更具代表性，此次研究选取了纬度较高的昭通市的鲁甸县（，海拔 ）和纬度较低的普洱市景东县（，海拔 ）作为野生植株的样本采集地。分别于 年 月 和 日采集了两地的野生大白杜鹃植株根系样品，每个采样地采集 棵长势接近且健康的植株，为避免由于植株根系的联系导致根际微生物的交流，结合大白杜鹃根系的分布特征，取样的植株间距离不小于 ，沿树干和主根找到发根，对发根进行采集，样品采集后用无菌采样袋密封，生物冰袋保存运输，带回实验室后置于 冰箱冷藏保存。人工繁育植株（以下简称人工植株）是课题组 年通过种子漂浮育苗并移栽成活的健康植株，植株使用营养土（云南顺丰洱海环保科技股份有限公司，主要原料为泥炭土、椰糠、珍珠岩和腐熟秸秆；含水量，值，总氮含量 ，总磷含量 ，总钾含量 ）作为栽培基质，单株单盆于大棚中培养，于 年 月 日采集 株人工植株的根系样品，用无菌采样袋密封后置于 冰箱备用。样品在流水下冲洗 ，将表面泥土清洗干净，并用纱布再次对其清洗。清洗后的样品用无菌水冲洗 次，无菌滤纸吸干水分；置于体积分数为 乙醇溶液中浸泡 ，无菌水冲洗 次，吸干水分；置于质量分数为 升汞溶液中浸泡 ，无菌水冲洗 次，吸干水分，以此方法进行根系表面彻底灭菌，用新的无菌袋封装备用，最后一次冲洗后的无菌水涂布于 培养基，培养一周后若无菌落产生，便视为表面灭菌彻底。试验方法 总 提取群落总基因组提取使用的是 试剂盒（，），后用质量分数为 的琼脂糖凝胶电泳检测 质量，最后使用超微量分光光度计 测定 浓度和纯度。扩增和测序文库构建 以上述提取的 为模板，使用携带 序列的上游引物 森 林 与 环 境 学 报第 卷（）和下游引物 （）对 基因进行扩增。扩增条件如下：，；，；，；，；次循环，最后在 进行保存（仪：型）。反应体系为：，上游引物（），下游引物（），模板 ，补足至 。每个样本 个重复，混合后使用质量分数为 的琼脂糖凝胶回收产物，并利用 试剂盒（，）进行纯化，质量分数为的琼脂糖凝胶电泳检测，回收产物用 荧光计进行检测定量。委托上海美吉生物医药科技有限公司使用 试剂盒（，）建库，并基于 公司的 平台测序。原始数据上传至 数据库（登录号：）。高通量测序数据分析 使用（）软件对双端原始测序序列进行质控，数据拼接使用（）软件，基于默认参数，优化各样本序列，进行操作单元分类（，）聚类（相似性大于 的非重复序列），并去除嵌合体，得到 的代表序列。为了尽量减少测序深度对后续 多样性和 多样性数据分析的影响，将所有样本序列数抽平。基于真菌数据库（：）和 中的 分类器进行 物种分类学分析。使用 （）软件进行 功能预测分析。统计分析 所有的数据分析均在美吉生信云分析平台（：）上进行，具体如下：、指数等 多样性指数采用 软件（：）计算，并采用 秩和检验进行 多样性的组间差异分析；使用主坐标分析（）检验样本间微生物群落结构的相似性（基于 距离算法），并结合 非参数检验分析样本组间微生物群落结构差异是否显著。基于文献及权威数据库，对真菌进行功能分类，根据 对样本中真菌进行功能分类，并分析其丰度信息。结果与分析 真菌高通量测序结果将采集得到的 个样本分为（采自景东，野生植株）、（采自鲁甸，野生植株）及（人工植株）组，质控后得到 条高质量目标片段，对 相似性水平的 聚类分析后，共得到有效 数量为 ，、的样本 数分别为、（表），可见人工植株中根内真菌的 数量少于野生植株。基于 水平进行组间差异显著分析，两组野生植株样本之间的差异显著小于野生植株与人工植株之间的差异（）。表 大白杜鹃根部真菌的 聚类结果 样本 检测 数 聚类 数 样本 检测 数 聚类 数 样本 检测 数 聚类 数 合计 合计 合计 注：表中合计的数值后不同小写字母表示不同分组检测的 总数差异显著（）。：（）多样性分析对 组样本的根内真菌 多样性进行分析，包括，和 指数（表）。，和 指数呈现：，指数 ，第 期张正权，等：自然环境与人工环境下大白杜鹃根内真菌的比较且这些数据差异较大，说明不论是真菌的多样性、丰富度还是均匀度，大白杜鹃的野生植株均高于人工植株。对 多样性指数进行差异显著分析发现，两组野生植株样本的各指数无显著差异，人工植株组与野生植株组（）的，和 指数存在显著差异（）。表 大白杜鹃根内真菌 多样性分析 分组样本 指数 指数 指数 指数 指数 均值 均值 均值 注：表中均值的数值后不同小写字母表示不同分组中各 多样性指数的均值差异显著（）。：（）群落结构分析 根内真菌在门水平上存在显著差异通过对 份样本进行聚类分析，所检测到的 分属于 门 纲 目 科 属 种，主要属于子囊菌门、担子菌门（）和被孢霉门（）（图）。在野生植株中，大白杜鹃根内真菌主要分属于子囊菌门和担子菌门；而人工植株中基本是子囊菌门真菌，其在人工植株根内真菌中占据绝对优势。通过 秩和检验发现：子囊菌门和担子菌门真菌在野生和人工植株根系中丰度具有显著差异（）（图）。图 基于门水平的真菌群落结构 森 林 与 环 境 学 报第 卷图 组间 秩和检验 ，根内真菌优势属存在显著差异 在属水平上，大白杜鹃野生植株根内真菌的组成较人工植株更为复杂，优势类群也不一样。在野生植株中，、古根菌属（）、树粉孢属（）和红菇属（）等作为优势类群，两组野生样本的根内真菌群落组成差异不大，且优势类群在两组野生样本中无显著差异。在人工植株中，根内真菌的优势类群为古根菌属和镰刀菌属（）的真菌，尤其是镰刀菌属真菌，主要分布在人工植株菌根中，野生植株根系中丰富度极低甚至没有分布。并且，不论是采集自景东还是鲁甸的野生植株样本，其根内真菌的优势类群都与人工植株存在显著差异（，图）。从物种水平来看，野生和人工植株根内真菌的组成是截然不同。、和 基 利 恩 帚 枝 霉（）等真菌分布在人工培育的大白杜鹃植株中，未在野生植株中检测到这些真菌；相反，、大孢树粉孢菌（）、和 等真菌主要分布于野生植株中，在人工植株中仅有极低的丰度甚至检测不到。除此之外，和 等真菌在两种生境的大白杜鹃植株中均有分布，但是丰度都不高（图）。大白杜鹃根内真菌的群落结构是复杂的，有许多真菌的分类地位仅用 区段难以准确鉴定，而且其中不乏分类地位本就不明确的真菌和未知的菌群，加之数据库信息更新完善的滞后性，部分真菌无法鉴定到更精确的分类水平。人工植株根内真菌组成更为单调 通过主坐标对样本进行组内和组间分析（，分析），发现两组野生植株根系样本的真菌群落结构相似性高于野生植株与人工植株的相似性。野生植株的各样本分布较为离散，而人工植株各样本分布较为集中（图）。这说明自然生境下，各植株的根内真菌群落组成更为复杂，这也从侧面印证了自然生境下的大白杜鹃根内真菌具有较高的多样性；人工生境下植株的根内真菌类群在植株间并没有明显的差异，这也印证了人工植株根内真菌多样性较低的现象。（）各样本中真菌群落组成 第 期张正权，等：自然环境与人工环境下大白杜鹃根内真菌的比较（）两组野生植株样本根内真菌优势类群比较 （）采集自鲁甸的野生植株与人工植株根内真菌优势类群比较 （）采集自景东的野生植株与人工植株根内真菌优势类群比较 注：表示，表示。：，图 真菌优势类群分析（属水平）森 林 与 环 境 学 报第 卷 注：仅展示丰度前 的物种，以丰度的对数作为着色值。：，图 物种组成热图 （）各组在 上的分布范围 （）各样本在 和 上的分布位置，椭圆表示 置信区间 ，图 三组样本的主坐标分析 第 期张正权，等：自然环境与人工环境下大白杜鹃根内真菌的比较 真菌功能预测基于目前已发表的文献或权威网站数据，预测具有相同或相似序列的真菌功能，对真菌进行功能分类。预测结果显示，有很大一部分大白杜鹃根内真菌的功能是未知的；而已知功能的真菌中，野生植株的菌根中存在多种类型的真菌，例如外生菌根真菌、内生菌根真菌、杜鹃花类菌根真菌、植物腐生真菌等；而人工植株中并未检测到鹃花类菌根真菌，更多的是土壤腐生真菌等多种类型的腐生型真菌，且真菌功能类型单一（图）。图 真菌功能预测 不同自然环境中大白杜鹃植株的根内真菌功能组成也存在一定的差异，采自普洱景东的大白杜鹃，其根内真菌以杜鹃花类菌根真菌、内生真菌和外生菌根真菌为主，而采自昭通鲁甸的植株根内真菌主要为外生菌根真菌和内生真菌，杜鹃花类菌根真菌的丰度较景东的植株低得多（图）。讨论与结论本研究发现野生的大白杜鹃植株根内真菌较为多样，且丰富度和均匀度都高于人工植株，即野生植株菌根真菌的 指数、指数、指数和 指数都大于人工植株，指数则相反（本研究采用的 指数计算公式是 于 年提出的，值越大，表明样本的多样性越低），这与 对杜鹃花科植物菌根真菌多样性的研究是一致的。诸多研究表明，根内真菌通过菌丝帮助宿主植物获取土壤中的养分，促进植株的生长发育，在恶劣的自然环境下，植株需要通过与更多的真菌形成共生结构，才能从环境中获取足够的物质保证自身的生长发育，因此，同样是采集自同一环境中的样本，组内也存在较大的差异；相较野生植株来说，人工培育对养分、水分、温度及杂草等环境进行了严格的控制，因此，植株获取环境中真菌从而形成共生菌根的来源较少，加之人工提供了较为舒适的生存环境，植株协同微生物从而获取营养物质的能力也可能有所下降。研究表明大白杜鹃野生植株的丰富度最高的根内真菌是子囊菌门真菌，其次是担子菌门真菌，这与 及 对大白杜鹃的研究结果是一致的，然而人工植株的根内真菌主要为子囊菌门真菌，很少有甚至没有担子菌门真菌参与大白杜鹃菌根的形成。纵观大白杜鹃、红棕杜鹃等杜鹃属植物，根系真菌群落组成中丰度最高的都是子囊菌门真菌，然而，在板栗（）等植物根系真菌群落结构中丰度最高却是担子菌门真菌，这或许能够告诉我们子囊菌门真菌更容易与杜鹃属植物形成共生菌根，而担子菌门真菌更易与其他类群的植物形成菌根。野生植株和人工植株的根内真森 林 与 环 境 学 报第 卷菌群落结构存在显著差异，而不同地方的野生植株间差异并不显著，这可能与生境中植物的物种组成有关系，野生的大白杜鹃植株生存在复杂的森林生态系统中，这样的生态系统中具有丰富的植物资源，其中不乏能够形成菌根的植物，因此野生植株能从环境中获得相似的菌群；而人工植株所处环境为温室大棚，栽培的土壤也是人工发酵而成的营养土，植株能够从土壤中找到的合作真菌种类是有限的，人工植株在培育过程中严格控制杂草等植物的生长，因此人工植株很难通过其他菌根植物的菌根真菌迁移获得更多真菌类群，这也导致了组内差异远小于野生植株。树粉孢属真菌是常见的鹃花类菌根真菌类群，尤其以大孢树粉孢菌最为典型和常见，从杜鹃属植物中分离出的杜鹃花类菌根真菌多为大孢树粉孢菌，在野生大白杜鹃植株中，树粉孢属真菌占有较高的丰度，而在人工植株中，没有检测到该属真菌，这可能是人工环境中缺乏这类真菌所导致的；大孢树粉孢菌在大白杜鹃野生植株中的丰度高于同属的 ，而且这一物种在野生植株中占据优势地位，这与 的研究结果一致。值得注意的是，柔膜菌目（）真菌也只存在于大白杜鹃野生植株菌根中，该类群曾在美国杜鹃（）菌根中分离得到，一度被认为是最容易培养并形成杜鹃花类菌根的菌群之一，这类真菌具有较高的菌根侵染能力，与宿主形成菌根后可以帮助宿主植物提高对氮的吸收能力；在大白杜鹃人工植株中，镰刀菌属占有较高的丰度，该属真菌广泛分布于自然界中，部分物种能产生赤霉素，可使农作物增产，但该属大多数真菌会引起多种植物的根腐、茎腐、茎基腐、花腐和穗腐等多种病害，在大白杜鹃菌根中发现该类真菌的存在，其功能尚未明确，有待后续研究。同时，人工植株中检测到该属的茄病镰刀菌（），该真菌为我国烟草根腐病主要病原菌之一，其在大白杜鹃植株根中的分布是否会对植株造成类似的根腐病尚未可知。古根菌属、枝孢属（）和被孢霉属（）等属的真菌作为土壤真菌，广泛分布于世界各地，不论在野生植株还是人工植株根内真菌都具有较高的丰度，这类真菌的存在可以帮助宿主植物提高吸收土壤中氮、磷的能力，提高植物的抗病性促进植物的生长。从真菌功能来看，两组野生植株的根内真菌的功能组成存在较大差异，但从根内真菌的群落结构来看，两组优势菌群不存在显著差异，所以，非优势菌群的功能以及未知功能的菌群都会影响到大白杜鹃根内真菌的功能组成。综上所述，不论从根内真菌群落结构还是功能来看，大白杜鹃野生植株与人工植株之间都存在显著差异。推测造成这一现象的原因是多方面的，例如两种生境下土壤微生物的差异和植被类型的差异；两种生境稳定性不同，自然生境容易受到气候等不确定因素的影响，稳定性较人工生境差。至于其他可能影响到大白杜鹃菌根真菌群落结构的因素，有待通过更多的研究来探索发现。同时，本研究证明了人工植株根内缺乏杜鹃花类菌根真菌，这类真菌作为杜鹃花生长发育至关重要的合作伙伴，可以考虑在杜鹃花培育过程中通过人工干预使其与杜鹃花合成菌根，帮助杜鹃花克服镰刀菌等病原真菌造成的压力，促进植株在人工环境下的生长发育，也可以通过生物、物理或者化学的手段对相应的病原真菌进行控制，以减小植株生长压力。参考文献 兰熙，张乐华，张金政，等 杜鹃花属植物育种研究进展 园艺学报，（）：龙毅 三种杜鹃属植物菌根真菌的研究 贵阳：贵州大学，刘振华 杜鹃花菌根真菌分离鉴定及多样性分析 北京：中国林业科学研究院，（）：，：，（）：，（）：，（），（）：汪远秀，李快芬，丁贵杰，等 铝对马尾松菌根苗生长及营养元素吸收的影响 森林与环境学报，（）：第 期张正权，等：自然环境与人工环境下大白杜鹃根内真菌的比较 熊丹 黔中地区马尾松杜鹃群落杜鹃菌根和根围真菌多样性 贵阳：贵州大学，中国科学院中国植物志编辑委员会 中国植物志：第 卷：第 分册 北京：科学出版社，：高博 龙池地区杜鹃花属 种杜鹃花菌根真菌多样性的研究 哈尔滨：东北林业大学，（）：，（）：，：，：，：，（）：，：，（）：，；（）：，（）：，：，（）：，（）：，：孙立夫 大白花杜鹃菌根真菌多样性的研究 北京：中国科学院博士后出站报告，彭黎明，蒋显锋 红棕杜鹃根系真菌群落组成与多样性分析 西南农业学报，（）：徐碧林，王政，罗周瑜，等 罗田板栗外生菌根真菌多样性研究 西南农业学报，（）：，（）：张艳华，孙立夫 杜鹃花科植物菌根的研究进展 菌物学报，（）：，（）：，：，（）：，：，（）：姚和金，金宗来，杨伟斌，等 浙西南红黄壤果园杂草种群消长动态及生态位的研究 江苏农业学报，（）：，（），（）：（责任编辑：卢凤美）森 林 与 环 境 学 报第 卷