猪瘟病毒PCR-ELISA检测方法的初步应用_王利平.pdf
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1、第4 4卷 第7期家畜生态学报V o l.4 4N o.72 0 2 3年7月A c t aE c o l o g i a eA n i m a l i sD o m a s t i c iJ u l.2 0 2 3猪瘟病毒P C R-E L I S A检测方法的初步应用 收稿日期 2 0 2 1-0 7-0 8修改日期:2 0 2 1-1 1-2 4 基金项目 河南省重点研发与推广专项(科技攻关)(2 0 2 1 0 2 1 1 0 0 9 4,2 1 2 1 0 2 3 1 0 3 3 5);新乡市科技攻关项目(G G 2 0 1 9 0 1 8,G G 2 0 2 0 0 1 8)作者简
2、介 王利平(1 9 8 0-),女,河南临颍人,博士,讲师,主要从事动物抗病性研究与遗传资源开发利用及评价工作。E-m a i l:9 3 6 1 2 0 2 0q q.c o m*通讯作者 李 鹏(1 9 7 6-),男,河南新乡人,博士,副教授,主要从事预防兽医、微生物学研究。E-m a i l:1 7 7 0 3 5 5 1q q.c o m王利平1,金前跃2,刘兴友1,王选年1,谭东鹤1,李 鹏1*(1.新乡学院 生命科学与基础医学学院,河南 新乡4 5 3 0 0 3;2.河南省农业科学院 动物免疫学重点实验室,河南 郑州4 5 0 0 0 2)摘 要 猪瘟(c l a s s i
3、c a l s w i n e f e v e r,C S F)是危害猪健康的重要传染病之一,具有急性、热性和高度接触性等特性,给世界养猪业造成了巨大的经济损失。P C R-E L I S A检测方法是在P C R和E L I S A基础上创新的一种新技术,其灵敏性和准确性都高于单纯的P C R检测和E L I S A检测。根据G e n B a n k中猪瘟石门株序列,设计特异性引物,分别在5 端标记生物素和地高辛,经过P C R扩增后,加入到包被有链霉亲和素的E L I S A反应板上,然后通过D I G-HR P抗体进行显色反应,建立P C R-E L I S A检测方法。结果表明:P
4、C R-E L I S A最低检测到1.8 11 04拷贝/L,普通P C R最低检测到1.8 11 06拷贝/L,因此P C R-E L I S A灵敏性比普通P C R高约1 0 0倍;对2 7份未知样品进行检测,普通P C R检测出阳性样品1 5份,阳性率为5 5.5%,P C R-E L I S A检出2 0份阳性样品,阴性7份,阳性率为7 4%,阳性检出率增加1 8.5%;用建立的R e a l-T i m eP C R进行验证,检测结果与P C R-E L I S A一致,两者的符合度为1 0 0%;然后用P K 1 5细胞对普通P C R未检测出的阳性样品进行病毒分离培养,通过间
5、接免疫荧光(I F A)及普通P C R检测,结果显示该5份样品均为阳性。说明本研究所建立的P C R-E L I S A方法具有灵敏、特异、准确、快速、安全等优势,可应用于C S F V的快速诊断,为C S F V的流行病学监测提供有力保障。关键词 猪瘟病毒;P C R-E L I S A;荧光定量P C R;间接免疫荧光 中图分类号 S 8 5 8.2 8 文献标识码 A 文章编号 1 0 0 5-5 2 2 8(2 0 2 3)0 7-0 0 6 4-0 8d o i:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 6 7 3-1 1 8 2.2 0 2 3.0 7.0 1 0 猪瘟(c
6、 l a s s i c a ls w i n ef e v e r,C S F)又称猪霍乱(h o gc h o l e r a),是由猪瘟病毒(c l a s s i c a l s w i n ef e v e rv i r u s,C S F V)引起的一种高度接触性传染病,具有急性、高传染性、高致死率等特性,是严重威胁猪健康的重要传染病之一1。目前常用的检测方法有酶联免疫吸附试验2(e n z y m e-l i n k e d i mm u n os o r b e n ta s s a y,E L I S A)、聚合酶链式反应(p o l y m e r a s ec h a i
7、 nr e a c t i o n,P C R),而P C R又包含常规R T-P C R3、多重R T-P C R4、R e a l-T i m e-P C R5-6等多种P C R技术。其中,E L I S A方法操作简单,不需要昂贵的仪器,适合大规模临床样品的检验检疫,但其特异性低、灵敏性差,容易出现假阳性或者假阴性结果;普通P C R凝胶电泳敏感性较低,实时荧光定量P C R虽可以进行定量检测,但需要特殊的设备和探针,试验费用昂贵。P C R-E L I S A7-8将P C R与E L I S A高灵敏性的特性有效的结合,消除了P C R凝胶电泳灵敏度低和E L I S A样品制备复
8、杂等过程,降低了试验难度,有效提高了检测的特异性和灵敏性。本试验针对C S-F VE2基因高度保守序列设计特异性引物,分别标记生物素和地高辛标,利用链霉亲和素与生物素之间特异性结合的原理,使P C R产物牢固地结合在酶标板上,建立了C S F VP C R-E L I S A方法,为该病的预防与控制提供一定的技术支撑。1 材料与方法1.1 材料猪瘟病毒(C S F V)、P K 1 5细胞、猪圆环病毒2型(p o r c i n e c i r r o v i r u s t y p e 2,P C V 2)、猪伪狂犬病毒(p o r c i n ep s e u d o r a b i e
9、sv i r u s,P R V)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(p o r c i n er e p r o d u c t i v ea n dr e s p i r a t o r ys y n d r o m ev i r u s,P R R S V)、猪 细 小 病 毒(p o r c i n ep a r v o v i r u s,P P V)由新乡学院动物疫病分子诊断河南省工程实验室保存提供。1.2 试剂P r e m i x E x T a q,p MD 1 9-T V e c t o r C l o n i n gK i t,T a K a R aM i n i B E S T
10、V i r a lR NA/D NA E x t r a c-t i o nK i tV e r.5.0,E.c o l iDH 5 C o m p e t e n tC e l l s,D L 2 0 0 0D NA M a r k e r等购自T a K a R a。DMEM培养基、胎牛血清购自G I B I C O。1.3 方法1.3.1 引物设计 根据G e n B a n k猪瘟石门株序列(登录号:AY 7 7 5 1 7 8.2),设计特异性引物C S F V-F、C S F V-R,用于普通P C R扩增,然后在上下游引物的5 端分别标记地高辛(D I G)和生物素(B I O)
11、,同时设计1对特异性引物C S F VI F、C S F VI R,用于荧光定量P C R扩增,引物由上海生工生物工程股份有限公司合成并标记,如表1所示。表1 引物序列T a b l e1 T h ep r i m e r s e q u e n c e s引物P r i m e r序列(5 3)S e q u e n c e位置L o c a t i o n i nS h i m e nHV R I长度/b pS i z eC S F V-FC T G C AAG G AA G A T T A C A G G T A C G C1 1 5 01 1 6 95 1 1C S F V-RT T
12、C C A C T G T G G T G G T C A C A C AA T C2 4 4 82 9 5 9C S F V D I G-FD I G-C T G C AAG GAA GA T TA C AG G TA C G C1 1 5 01 1 6 95 1 1C S F V B I O-RB I O-T T C C A C T G T G G T G G T C A C A C AA T C2 4 4 82 9 5 9C S F VI FAG C C C A C C T C G AG A T G C TA2 0 92 3 11 1 4C S F VI RC T A T C A G G
13、 T C G T A C T C C C A T C A C4 2 64 4 51.3.2 C S F V普通P C R扩增 从-8 0冰箱取出实验室保存的猪瘟病毒组织病料,取大约1 0m g淋巴 结,根 据T a K a R a M i n i B E S TV i r a l R NA/D NA E x t r a c t i o n K i t V e r.5.0说 明 书 提 取 病 毒R NA,然后反转录c D NA。以C S F Vc D NA为 模板,C S F V-F、C S F V-R为引物进行P C R扩增。P C R程序为9 4预变性4m i n;9 4 3 0s,5 5
14、 3 0s,7 24 0s,3 0个循环;7 2延伸5m i n,结束后取5L的P C R产物进行琼脂糖凝胶电泳9。1.3.3 阳性质粒的构建 将上述P C R产物与克隆载体p MD 1 9-TV e c t o r连接。连接体系为PMD 1 9-TV e c t o r0.5L,目的基因4.5L,S o l u t i o n5.0L,总体积1 0.0L,混匀后放于1 6 恒温槽中过夜连接。次日,从-8 0 冰箱取出大肠杆菌DH 5 感受态细胞放置冰水混合物中溶解,加入连接产物5L,冰浴3 0m i n,4 2 热击9 0s立即取出,冰上放置12m i n,加入9 0 0L不含抗性的L B液
15、体培养基,放入3 7 培养箱中振荡培养4 5m i n,40 0 0r/m i n离心5m i n,保留约1 0 0L上清,均匀涂布在含Am p抗性(1 0 0g/m L)的L B固体培养基平板上,将平板倒置于3 7恒温培养箱过夜培养。以上述得到的菌液为模板,进行P C R扩增,反应体系是E xT a qD NA P o l y m e r a s e1 2.5L,C S-F V-F0.5L,C S F V-R0.5L,菌液1.0L,d d H2O1 0.5L,总体积为2 5L。P C R程序:9 4预变性4m i n;9 43 0s,5 53 0s,7 25 0s,运行3 0个循环;7 2延
16、伸1 0m i n。结束后取5L的P C R产物进行电泳检测。选P C R正确的菌株,用OME GA质粒提取试剂盒提取阳性质 粒,进行双酶 切 鉴 定(重 组 质 粒D NA3L,1 0Q.C u tG.B u f f e r1L,Q.C u tK p n0.5L,Q.C u tH i n d 0.5L,d d H2O5L,总体积为1 0L)。瞬 时 离 心 后3 7 恒 温 水 浴3 0m i n,将双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳1 0。1.3.4 C S F VP C R-E L I S A方法的建立 以构建的C S F Vc D NA为模板,C S F V D I G-F、C S F V
17、B I O-R为引物进行P C R扩增。P C R反应条件为9 4 预变性4m i n;9 43 0s,5 53 0s,7 24 0 s,3 0个循环;7 2延伸5m i n。然后进行E L I S A反应,具体操作如下:(1)包被:将链霉亲和素用C B S液从15 0倍比稀释到116 0 0,5 0L/孔,4 包被过夜,弃去孔中液体,P B S T洗涤6次,3 0 0L/孔;(2)封闭:用5%脱脂奶粉,2 0 0L/孔,置3 7 恒温培养箱2h,弃去孔中液体,P B S T洗涤6次,3 0 0L/孔;(3)加一抗:以P C R产物作为一抗,5 0L/孔,置3 7恒温培养箱1h,弃去孔中的P
18、C R产物,P B S T洗涤6次,3 0 0L/孔;(4)加酶标二抗:加入120 0 0稀释HR P标记的抗地高辛抗体,5 0L/孔,置3 7恒温培养箱1h,P B S T洗涤6次,3 0 0L/孔;(5)TMB显色:加入TMB显色液,5 0L/孔,避光显色5m i n,然后加入硫酸终止液,5 0L/孔;(6)读数:在波长为4 5 0n m的酶标仪中读取结果。56第7期 王利平,等:猪瘟病毒P C R-E L I S A检测方法的初步应用将链霉亲和素用C B S倍比稀释15 0116 0 0,P C R产物作为一抗,120 0 0HR P标记的抗地高辛抗体为二抗,5 0L/孔,进行P C R
19、-E L I S A检测,确定P C R-E L I S A链霉亲和素最佳包被浓度。根据筛选出来的最佳包被浓度与时间,将HR P标记的抗地高辛抗体从110 0 0依次倍比稀释到11 60 0 0,5 0L/孔,进 行P C R-E L I S A检 测,得 到P C R-E L I S A二抗最佳浓度。将3 0份C S F V阴性样品进行P C R-E L I S A检测,确定P C R-E L I S A的临界值,形成P C R-E L I S A的阳性判断结果1 1。1.3.5 普通P C R与P C R-E L I S A灵敏性试验 将构建好的C S F V阳性质粒按1 0倍梯度稀释,进
20、行P C R-E L I S A和普通P C R检测,比较其灵敏性。将构建好的C S F V阳性质粒(质粒浓度为5 5.8 3n g/L,换算成拷贝数为1.8 11 01 0拷贝/L)按1 0倍梯度依次稀释为1.8 11 09、1.8 11 08、1.8 11 07、1.8 11 06、1.8 11 05、1.8 11 04、1.8 11 03、1.8 11 02、1.8 11 01和1.8 11 00拷贝/L,并分别作为模版进行P C R-E L I S A和P C R检测。1.3.6 C S F V荧光定量P C R检测方法的建立 根据G e n B a n k中C S F V基 因 序
21、列(序 列 号:A F 0 9 2 4 4 8.2),用D NAm a n进行序列比对,设计1对特异性引物,基因长度为1 1 4b p,C S F VI F:a g c-c c a c c t c g a g a t g c t a,C S F V I R:c t a t c a g g t c g t a c t c c c a t-c a c。以C S F Vc D NA为模板,C S F V-I F、C S F V-I R为引物进行P C R扩增,质粒构建参照1.2.3。将标准质粒浓度换算成拷贝数,然后按照1 0倍梯度稀释1 0-11 0-1 0,制作标准曲线,然后进行C S F V荧光
22、定量P C R灵敏性、特异性、重复性分析1 2-1 3。1.3.7 临床病料检测 从本地周边疑似感染猪瘟的猪场采集口腔粘液和肛门粘液2 7份,分别用本试验构建好的普通P C R、P C R-E L I S A、荧光定量P C R3种检测方法对2 7份样品进行临床检测。1.3.8 病毒分离 为进一步验证P C R-E L I S A的灵敏性和准确性,选取普通P C R检测为阴性而P C R-E L I S A检测为阳性 的5份 临 床 样 品 进 行 病 毒 分离,分别加入灭菌的P B S1m L,1 20 0 0r/m i n离心5m i n,取上清液用0.2 2m滤膜进行过滤。接种P K 1
23、 5细胞,7 2h后 收 获 病 毒,进 行 普 通P C R检测1 4。1.3.9 间接免疫荧光检测(I F A)将生长状态良好的P K 1 5细胞平铺于9 6孔细胞培养板中,待细胞生长至8 0%,接种上述试验收获的病毒液,设立阳性对照。置于3 75%C O2的培养箱中培养7 2h,进行I F A检测。具体方法:(1)固定:用预冷的3%H2O2甲醇固定,4 2 0m i n,5 0L/孔,弃去固定液,P B S T洗6遍。(2)封闭:用5%脱脂奶粉,3 0 0L/孔,3 7恒温培养箱温育1h,P B S T洗涤6遍。(3)加一抗:加入11 0 0C S F V阳性血清,5 0L/孔,3 7恒
24、温培养箱作用1h,P B S T洗涤6遍。(4)加二抗:加入1 1 0 0兔抗猪l g G-F I T C,5 0L/孔,3 7恒温培养箱作用1h,P B S T洗涤6遍。(5)每孔加入5 0L的P B S,在荧光显微镜下观察结果1 5-1 6。2 结果与分析2.1 C S F VP C R扩增结果以C S F Vc D NA为模板,C S F V-F、C S F V-R为引物,P C R扩增出大小约为5 1 1b p的目的条带,与预期目的片段大小一致,见图1。2.2 C S F V阳性质粒的构建结果以菌液为模板进行P C R扩增,扩增出的条带与预期目的片段5 1 1b p大小一致。将目的片段
25、连接p MD 1 9-T载体,构建重组质粒,用Q.C u tK p n和H i n d双酶切鉴定,与预期结果一致(图2)。图1 C S F V普通P C R扩增结果M.D NA M a r k e rD L 2 0 0 0;1.目的基因;2.阴性对照F i g.1 C S F Vc o mm o nP C Ra m p l i f i c a t i o nr e s u l t sM.D NA M a r k e rD L 2 0 0 0;1.T a r g e tg e n e;2.N e g a t i v ec o n t r o l图2 重组质粒双酶切结果M.D NA M a r k
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