猪裸卵母细胞体外成熟方法研究.pdf

科学研究I组稿Email：n m g x m y 2 0 0 8 s in a.c o m猪裸卵母细胞体外成熟方法研究徐叶12,李思佳12,贾茹茹1-2,陈莫斯楠1.2,王云1.2,周东平1.2,石德顺12,陆凤花1.2*（1.亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，广西南宁530 0 0 5；2.广西大学动物育种、疾病防治重点实验室，广西南宁530 0 0 5)摘要：本试验旨在研究猪裸卵母细胞体外成熟的方法。试验设为裸卵组（对照组）、裸卵+卵丘细胞铺底共培养组、裸卵+卵丘细胞同时共培养组,检测猪成熟卵母细胞的存活率、极体率、孤雌激活后的卵裂率和囊胚率。结果表明：体外成熟培养44h后，裸卵+卵丘细胞同时共培养组的存活率显著高于裸卵组(P0.05);裸卵+卵丘细胞同时共培养组的第一极体排出率显著高于裸卵组(P0.05)，同时裸卵+卵丘细胞同时共培养组的卵裂率及囊胚率均高于裸卵组(P0.05)。因此,选择裸卵+卵丘细胞同时共培养的方式对猪裸卵母细胞进行体外成熟。关键词：裸卵共培养；卵母细胞；卵丘细胞；体外成熟中图分类号：S828卵母细胞体外成熟是指卵母细胞在体外环境下从第1次减数分裂前期(GV期)到第2 次减数分裂中期(MII期)的减数分裂过程,它是胚胎体外生产技术的一大关键，对后续受精或胚胎发育起决定性作用1-2。通过卵母细胞体外成熟技术可以为动物克隆、转基因动物以及人类异种器官移植提供优秀且充足的卵母细胞来源。因此,深人研究猪卵母细胞体外成熟机制，具有极其重要的现实意义。卵母细胞体外成熟是一个复杂的生物学过程。研究表明，卵丘细胞通过缝隙链接、物质运输和介导激素等方式对卵母细胞的成熟发挥作用 3-5。然而,在研究猪卵母细胞体外成熟机制时，由于卵母细胞特有的透明带结构，使得构建的载体无法转染卵母细胞，需要借助显微注射技术将目的载体注入卵母细胞胞质内,并在卵母细胞内直接发挥作用。如果直接用卵丘卵母细胞复合体（cumulus-oocytecomplexes,COCs）注射,COCs上的卵丘细胞容易堵针,因此需要对GV期COCs进行脱卵丘处理,对裸卵进行成熟培养。众所周知，卵母细胞的成熟离不开卵丘细胞的作用 6-7。因此,本试验对猪裸卵母细胞的体外成熟方法进行研究，以期解决后续显微注射试验卵丘细胞堵针的问题。1材料与方法1.1试验设计试验分为裸卵组（对照组）、裸卵+卵丘细胞铺底基金项目：国家自然科学基金项目（32 16 0 7 8 8)作者简介：徐叶（1997 一）,女，硕士研究生，研究方向为胚胎生物工程。通讯作者：陆风花（197 3一），女，博士，研究员，研究方向为胚胎生物工程。文献标识码：A文章顺序编号：10 0 5-5959(2 0 2 3)0 3-0 0 3-0 3共培养组、裸卵+卵丘细胞同时共培养组,分别检测猪成熟卵母细胞的存活率、极体率、孤雌激活后的卵裂率和囊胚率。1.2试剂和药品卵母细胞成熟、胚胎培养基所用试剂均购自美国Sigma公司。组织培养基(TCM199)、胎牛血清（FBS)购自美国Gibico公司。卵母细胞洗液(CCM):9.5g TCM199+2.2gNaHCOg+1.2 g Hepes+3%FBS+0.06 g 青霉素+0.1 g链霉素，溶于1L三蒸水。卵母细胞成熟液（PM):50mLTCM199+0.550g葡萄糖+0.0 6 9g半胱氨酸+0.10 0 g丙酮酸钠+1x10*gECF+16IU孕马血清促性腺激素（PMSG)+8IU人绒毛膜促性腺激素(HCG)+10%FBS+10%卵泡液。胚胎培养液(NCSU23):0.62 g NaCI+0.035 gKCl+0.025 g CaCl 2H,0+0.21 g NaHCO;+0.016 gKH,PO4+0.029 g MgS04-7H,0+0.099 g葡萄糖+0.0 15 g谷氨酰胺+0.0 8 7 g牛磺酸+0.0 7 g亚牛磺酸+0.4g牛血清白蛋白,溶于1L三蒸水。离子霉素（Ion)：称取适量Ion，二甲基亚矾(DMSO)溶解,用CCM将其稀释至5 mol/L。6-二甲基氨基嘌呤（6-DMAP)：称取适量6-DMAP,DMSO溶解,用CCM将其稀释至2 mmol/L。0.1%透明质酸酶（HYT):100 mg HYT+100 mLCCM过滤保存。1.3试验材料的采集和挑选猪卵巢取自南宁市鲁班路屠宰场，存放于30 左右经高温灭菌的生理盐水保温壶中,收集好的卵巢快速送往实验室。用10 mL一次性注射器抽取中等大小的卵泡,挑选卵丘包裹完整及胞质均匀的卵丘卵母细胞复合体进行体外成熟。202303当代畜禽养殖业3组稿VEmail：n m g x m y 2 0 0 8 s in a.c o m|科学研究100um1.4卵丘细胞的制备参考黄承俊等8 卵丘细胞对牛卵母细胞体外的方法，将收集的COCs放到0.1%HYT中消化，脱去卵丘细胞,将裸卵移出，剩余液体离心,再用PM离心洗涤2 次，加入成熟液使其终密度为110 2 10 个/mL。1.5卵母细胞体外成熟和孤雌激活1.5.1卵丘细胞铺底与裸卵共培养。采用微滴培养法进行培养,取之前制备好的卵丘细胞6 0 L,加入平衡过的6 0 L成熟培养滴中，盖上石蜡油，继续平衡4h，待卵丘细胞贴壁后，采用半换液方式，换新鲜成熟的液体，然后放入裸卵，每滴中放40 50 个卵母细胞。1.5.2卵丘细胞与裸卵同时接种共培养。取之前制备好的卵丘细胞6 0 L,加人平衡过的6 0 L成熟培养滴中，然后放人裸卵（卵丘细胞未贴壁），每滴中放4050个卵母细胞。1.5.3裸卵培养。将COCs放入到透明质酸酶中轻轻吹打，待卵丘细胞脱落后，获得裸卵后用成熟洗滴洗2次，随后放入到成熟培养滴中，每滴中放40 50 个卵母细胞，将成熟盘放入38.5、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养。1.5.4孤雌激活。将进行44h体外成熟的卵母细胞放于透明质酸酶中轻轻吹打，消化周围卵丘细胞后，在体式显微镜下用针挑选出排有第一极体的卵母细胞。成熟的卵母细胞置于离子霉素5min，后在NCSU23洗液中洗涤2 3次移至6-DMAP中培养箱培养3.5 4h。培养盘按每滴30 LNCSU23液（10 20个卵母细胞/滴)覆盖上3mL石蜡油。置于38.5、5%COz培养条件下,观察48 h的卵裂率和16 8 h的囊胚率。1.6统计分析采用SPSS26统计学软件对数据进行单因素ANOVA分析，使用LSD法进行多重比较，并用GraphPad Prism8软件进行图片制作。结果以“平均值标准误”表示,P0.05作为差异显著性判断标准。每组试验重复3次。2结果与分析2.1卵丘细胞形态观察图1为卵丘细胞铺底与裸卵共培养时贴壁生长的卵丘细胞。在倒置显微镜下观察,接种4h后,猪卵培养方式裸卵裸卵+卵丘细胞铺底共培养裸卵+卵丘同时共培养注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P0.05)。下表同。4当代畜禽养殖业202303丘细胞贴壁生长，由圆形变成长梭形或不规则三角形。卵丘细胞贴壁生长良好，可以用于后续试验，50m图1卵丘细胞铺底与裸卵共培养时贴壁生长的卵丘细胞2.2养猪裸卵母细胞获取图2 为脱卵丘后的猪GV期卵母细胞（猪裸卵母细胞）。在倒置显微镜下观察，猪裸卵母细胞透明带清晰,胞质均匀,周围卵丘细胞基本脱落,说明获得的裸卵母细胞可以用于后续试验。图2 脱卵丘后的猪GV期卵母细胞(猪裸卵母细胞)2.37不同成熟方法对猪裸卵母细胞存活率的影响由表1和图3可知共培养组存活率均显著高于裸卵组的59.6 2%(P0.05）。表1不同成熟方法对猪裸卵母细胞体外存活率的影响总卵母细胞数（重复数）个存活数/个213(3)137286（3)241445(3)378存活率/%59.62 2.48b84.27 1.01a84.95 1.20a科学研究|组稿VEmail：n mg x my 2 0 0 8 s i n a.c o m10080Fb604020F0不同小写字母表示差异显著（P0.05)。下图同图3不同成熟方法对猪裸卵母细胞存活率的影响2.4不同成熟方法对猪裸卵母细胞第一极体率的影响由表2 和图4可知，共培养组第一极体排出率显著高于裸卵组(P0.05）。培养方式裸卵裸卵+卵丘细胞铺底共培养裸卵+卵丘同时共培养培养方式裸卵裸卵+卵丘细胞铺底共培养裸卵+卵丘同时共培养3讨论缝隙连接是卵丘细胞之间以及卵丘细胞与卵母细胞之间的信息交流桥梁和物质传送纽带。这种缝隙连接使卵母细胞、卵丘细胞和壁层颗粒细胞共同形成一个结构和功能上的统一体3。鲁金花 9研究发现,兔卵母细胞在没有卵丘细胞的支持下无法进行体外成熟。本试验通过透明质酸酶将猪COCs进行脱卵丘处理,得到裸卵母细胞，此时缝隙连接已经受到损坏,因此裸卵母细胞的成熟效果也随之下降。为了能提高裸卵的成熟效果,重新建立起卵丘细胞与卵母细胞的信息交流，本研究采用卵丘细胞与卵母细胞共培养的方式，对裸卵培养模式进行探索。本研究表明,共培养组的存活率、第一极体率、成熟率以及后续孤雌激活的胚胎卵裂率、囊胚率都显著高于裸卵组。因此，在猪卵母细胞体外成熟过程中,卵丘细胞与卵母细胞的连接机制扮演了重要角色。利用卵母细胞与卵丘细胞进行共培养可以促进卵母细胞四裸卵aa试验分组四裸卵80裸卵+卵丘细胞铺底共培养一裸卵+卵丘细胞同时共培养表2 不同成熟方法对猪裸卵母细胞体外第一极体排出率的影响总卵母细胞数（重复数）个极体数/个213(3)67286（3)164445(3)259表3不同成熟方法对猪裸卵母细胞孤雌激活后胚胎发育的影响培养总胚胎数（重复数）个卵裂率/%67(3)32164(3)112259(3)180的成熟和后期胚胎发育能力 10-12。任文娟等 3研究表明，与卵丘颗粒细胞复合体共培养可以提高卵胞浆内单精子注射（ICSI）治疗周期中所获未成熟卵的体外成熟率。也有研究表明,在绵羊和牛中利用颗粒细胞与卵母细胞共培养,可以提高胚胎发育的卵裂率 4-15。在本研究中，裸卵+卵丘细胞同时共培养组的各项指标均高于裸卵+卵丘细胞铺底共培养组，但差异不显著。其原因可能是提前铺底的卵丘细胞在裸卵放人之前就已经开始代谢，进行半换液后将培养基中利于建立缝隙链接的代谢物质置换出去，导致裸卵+卵丘细胞铺底共培养组虽然显著高于裸卵培养组，但略低于裸卵+卵丘细胞同时共培养组。4结论在猪卵母细胞体外成熟液中添加适当密度分散的卵丘细胞,可以提升猪裸卵母细胞的发育潜能。因此，可以选择裸卵+卵丘细胞同时共培养的方法对猪(下转第16 页）202303当代畜禽养殖业5裸卵+卵丘细胞铺底共培养a6040$20F0图4不同成熟方法对猪裸卵母细胞第一极体排出率的影响2.5卵丘细胞对猪孤雌激活效果的影响由表3可知，共培养组卵裂率和囊胚率均显著高于裸卵组(P0.05。卵裂总数/个47.61 4.46b68.39 1.18a69.30 0.54a一裸卵+卵丘细胞同时共培养b试验分组极体率/%31.46 2.04b57.343.12a58.202.64a囊胚总数/个囊胚率/%39.60 1.01b1614.181.39a2715.43 1.41a组稿VEmail：n m g x m y 2 0 0 8 s in a.c o m|科学研究本研究结果表明,瑞典长白猪和新美系长白猪的初生窝重基本相同。Shostak等 9研究发现,品系对多瑙河白母猪的初生窝重无显著影响。Yen等用最小二乘法对美国约克夏猪、杜洛克猪、切斯特白猪、汉普夏猪、花斑猪、长白猪以及杂种猪共10 9 7 6 窝的2 1日龄仔猪平均重和2 1日龄窝重进行研究发现，品种和品种内猪群均极显著影响2 1日龄仔猪平均重和2 1日龄窝重。姜志华等12 报道，大白猪初生个体重比二花脸猪高0.46 kg，2 0 日龄个体重高1.36 kg，6 0 日龄个体重高2.09kg,差异均达到极显著水平。Chung等 13报道，母猪品种显著影响仔猪初生的窝重和断奶窝重。参考文献：1罗海彬,李平华.长白猪不同胎次对繁殖性状的影响 禽业,2 0 10,2 3(2 49):2 0-2 1.2王怀中，付言军.大约克、杜洛克及长白猪第1胎仔猪初生重分析 J.养猪,2 0 10,4(45):2 8-2 9.3任丽琴,芦春莲，曹洪战,等.影响斯格猪繁殖性能的因素分析.畜牧与兽医,2 0 10,42(4):39-41.4陈海燕，朱海平，吕鸿,等.影响外来猪种早期生长的固定效应浙江大学学报(农业与生命科学版),2 0 0 3,2 9(4):42 9-432.5储明星,吴常信张建生，等.猪总产仔数的方差分析和多重比较 J.黑龙江畜牧兽医,2 0 0 0,5(14)：7-8.6 GAUGLER H R,BUCHANAN D S,HINTZ R L.Sow(上接第5页）裸卵母细胞进行体外成熟。参考文献：1 ALMUBARAK A M,KIM E,YU I J,et al.Supplementationwith Niacin during in vitro maturation improves the qualityof porcine embryosJJ.Theriogenology,2021,169(5):36-46.2 FERRE L B,KJELLAND M E,STROBECH L B,et al.Review:recent 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