猪流行性腹泻病毒纤突蛋白S...位的串联表达及免疫原性分析_刘阳坤.pdf
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1、2023(15):1-7,129试验研究编者按:猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)属于冠状病毒科冠状病毒属,主要引起仔猪的剧烈腹泻、呕吐、脱水甚至死亡。2010 年后,PEDV 发生明显的基因变异,导致传统毒株疫苗难以应对流行毒株传播,给全球养猪业造成巨大的经济损失。加强对 PEDV 毒株的进化检测和疫苗研发对于防治猪流行性腹泻具有重要意义。本栏目编辑组织 2 篇关于 PEDV 分子流行病学和基因工程疫苗方面的文章,以期为猪流行性腹泻的综合防控奠定基础。收稿日期:2022-06-07;修回日期:2023-03-28基金项目:国家自然科学
2、基金项目(32002302;31870917);河南省科技攻关项目(202102110097);河南省“疫苗工程”高校科技创新团队项目(20IRTSTHN024);南阳师范学院高层次人才启动专项(2017ZX012)作者简介:刘阳坤(1986),男,讲师,博士,研究方向为动物病原及基因工程疫苗,lyk19861211 .通信作者:姚伦广(1974),男,教授,博士,研究方向为分子病毒学,lunguangyao .DOI:10.13881/ki.hljxmsy.2022.06.0069 猪流行性腹泻病毒纤突蛋白 S1 抗原表位的串联表达及免疫原性分析 刘阳坤1,2,王国川1,韩雪英3,冷超粮1,
3、姚伦广1(1.南阳师范学院 生命科学与农业工程学院,河南 南阳 473061;2.河南省畜禽保健品工程技术中心,河南 南阳 473061;3.西北农林科技大学 动物医学院,陕西 杨凌 712100)中图分类号:S852.65文献标识码:A文章编号:1004-7034(2023)15-0001-08摘 要:为了获得猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)纤突蛋白 S1 抗原表位的串联重组蛋白并评价其免疫原性,试验将 S1 蛋白的抗原表位 COE 和 S1D 连接起来组成串联表位S1CD,合成相应的基因片段后克隆至转移载体 pFastBac1 上
4、,然后转化到大肠杆菌 DH10Bac 感受态细胞中,通过蓝白斑和 PCR 扩增筛选重组杆状病毒穿梭质粒 Bacmid-S1CD,再转染 Sf9 昆虫细胞获得重组杆状病毒,采用间接免疫荧光试验和 Western-blot 检测方法鉴定重组蛋白 S1CD 的表达情况。将小鼠随机均分为 S1CD 蛋白组、PEDV 灭活疫苗组和 PBS 组,分别经背部皮下多点注射重组蛋白S1CD、PEDV HeN170821 灭活病毒和 PBS 与弗氏佐剂等体积混合制成的抗原,检测特异性 IgG 抗体水平及白细胞介素-4(IL-4)和 干扰素(IFN-)含量以评价重组蛋白 S1CD 的免疫原性。结果表明:重组蛋白 S
5、1CD 成功在 Sf9 昆虫细胞中表达,并能与鼠抗 His 单克隆抗体和 PEDV 阳性血清发生特异性反应;首次免疫后第 28 天,S1CD 蛋白组的特异性 IgG 抗体水平极显著高于 PBS 组(P0.01);首次免疫后第 42 天,S1CD 蛋白组的特异性 IgG 抗体水平及 IL-4 和 IFN-含量均极显著高于 PBS组(P90%的 Sf9 昆虫细胞铺到 24 孔细胞培养板中,细胞浓度为 2105个/mL,1 mL/孔。利用脂质体转染试剂 Cellfectin 将重组杆状病毒穿梭质粒 Bacmid-S1CD 转染至 Sf9 昆虫细胞中,27 培养 5 d,待出现明显的细胞病变后1 00
6、0g 离心 5 min,收集上清液,即为 P1 代病毒,命名为 rBV-S1CD。将 rBV-S1CD 传至第 3 代,收集 P3代病毒作为种毒,4 保存,备用。2.4 重组蛋白的检测取用 P3 代病毒感染 48 h 的 Sf9 昆虫细胞,经 1PBS 轻轻洗涤 2 次后用甲醇固定细胞 10 min;加入含0.5%TritonX-100 的 PBST,室温孵育20 min;以 PEDV22023(15):1-7,129试验研究图 2 重组杆状病毒穿梭质粒 Bacmid-S1CD 的制备示意图Fig.2 Diagram of the preparation of recombinant bacu
7、lovirus shuttle plasmid Bacmid-S1CD阳性血清(按照 1 40 比例稀释)为一抗,FITC 标记的羊抗猪 IgG 抗体(按照 150 比例稀释)为二抗,室温避光孵育 1 h;在倒置荧光显微镜下观察并拍照。2.5 重组蛋白的纯化及鉴定取对数生长期、细胞活率90%的 Sf9 昆虫细胞接种于 1 L 摇瓶中,细胞浓度为 5105个/mL,每瓶400 mL,共接种 5 瓶,27、125 r/min 培养 3 d;加入P3 代病毒,待细胞活率下降到 30%左右时,12 000g离心 10 min;收集沉淀,用平衡缓冲液(0.01 mol/L PBS、20 mmol/L 咪
8、唑、1%苯甲基磺酰氟,pH 值为7.4)重悬;利用超声波细胞粉碎机将其破碎并收集上清液,按照 Ni-NTA 蛋白纯化试剂盒说明书进行纯化;取纯化的重组蛋白 S1CD 进行 SDS-PAGE 分析,以 PEDV 阳性血清(按照 1 500 比例稀释)、鼠抗 His单克隆抗体(按照 16 000 比例稀释)为一抗,并分别以 HRP 标记的羊抗猪 IgG 抗体(按照 1 2 000 比例稀释)和 HRP 标记的羊抗鼠 IgG 抗体(按照 1 5 000比例稀释)为二抗进行 Western-blot 检测,用 DAB 显色试剂盒进行显色,观察并拍照。2.6 重组蛋白的免疫原性检测将 15 只小鼠随机均
9、分为 S1CD 蛋白组、PEDV 灭活疫苗组和对照组,分别将纯化的重组蛋白 S1CD、PEDV HeN170821 灭活病毒和 PBS 与等体积弗氏佐剂混合制备成抗原,给 S1CD 蛋白组和 PEDV 灭活疫苗组经背部皮下多点注射。首次免疫剂量为纯化的重组蛋白 S1CD 50 g、PEDV HeN170821 灭活病毒1106TCID50,佐剂为弗氏完全佐剂;首次免疫后第14,28 天分别加强免疫 1 次,抗原不变,佐剂为弗氏不完全佐剂。首次免疫后第 0,14,28,42 天各组小鼠尾尖采血,首次免疫后第 42 天小鼠眼球采血,分离血清,均置-20 冰箱中保存,备用。按照相应 ELISA快速检
10、测试剂盒说明书测定小鼠血清中 IgG 抗体水平和白细胞介素-4(IL-4)、干扰素(IFN-)含量。2.7 数据的统计分析采用 GraphPad Prism 5.0 统计软件对小鼠免疫试验数据进行分析,采用 t 检验进行样本间的显著性分析,P0.05 表示差异显著,P0.05 表示差异不显著。3 结果与分析3.1 重组质粒 pFastBac1-S1CD 的鉴定密码子优化的 S1CD 基 因 克 隆 到 转 移 载 体pFastBac1 后,所得重组质 粒 pFastBac1-S1CD 经BamH和 Xho双酶切鉴定,得到大小约为4 700 bp和 675 bp 的酶切条带(见图 3),与预期大
11、小相符。测序分析可知目的基因插入正确,表明重组质粒pFastBac1-S1CD 构建成功。M.Trans2K Plus DNA Marker;1.重组质粒 pFastBac1-S1CD;2,3.重组质粒 pFastBac1-S1CD 的双酶切产物。图 3 重组质粒 pFastBac1-S1CD 的双酶切鉴定结果Fig.3 Results of double enzyme digestion identification of recombinant plasmid pFastBac1-S1CD3.2 重组杆状病毒穿梭质粒 Bacmid-S1CD 的 PCR鉴定将重组质粒 pFastBac1-S
12、1CD 转化到大肠杆菌DH10Bac 感受态细胞中,筛选后获得带有 S1CD 基因的重组杆状病毒穿梭质粒 Bacmid-S1CD。分别以Bacmid-S1CD 菌液和大肠杆菌 DH10Bac 感受态细胞(阴性对照)作为模板,M13(-40)Forward 和 M13 Reverse 为引物进行 PCR 扩增,结果(见图 4)显示,32023(15):1-7,129试验研究M.Trans2K Plus DNA Marker;1.Bacmid-S1CD 菌液;2.阴性对照。图 4 重组杆状病毒穿梭质粒 Bacmid-S1CD 的 PCR 鉴定结果Fig.4 PCR identification r
13、esults of recombinant Baculovirus shuttle plasmid Bacmid-S1CD Bacmid-S1CD 菌液扩增出 1 条大小约为 2 900 bp 的条带(2 600 bp+270 bp),而阴性对照扩增出 1 条大小约为 270 bp 的条带,说明 S1CD 基因已经成功整合到杆状病毒基因组中。3.3 重组杆状病毒的获得及鉴定用重组杆状病毒穿梭质粒 Bacmid-S1CD 转染Sf9 昆虫细胞,转染后第 96 小时出现细胞变圆变大、停止生长、贴壁不牢固等细胞病变,部分细胞发生裂解死亡(见图 5A),而正常细胞无变化(见图 5B),说明重组杆状病毒
14、包装成功。3.4 重组蛋白的检测将 P3 代病毒接种到 Sf9 昆虫细胞中,48 h 后利用 PEDV 阳性血清进行间接免疫荧光检测。结果(见 129 页彩图 6)显示,感染 P3 代病毒的 Sf9 昆虫细胞出现了特异性的绿色荧光,而正常 Sf9 昆虫细胞未出现绿色荧光,表明在 Sf9 昆虫细胞中成功表达重组蛋白 S1CD。图 5 Sf9 昆虫细胞转染后的细胞病变情况(200)Fig.5 Cytopathic condition of Sf9 insect cells after transfection(200)3.5 重组蛋白的纯化及鉴定SDS-PAGE 分析结果(见图 7)表明,在 24
15、 ku 处得到特异性条带,与目的蛋白大小相符且纯度较高。使用 PEDV 阳性血清和鼠抗 His 单克隆抗体对重组蛋白 S1CD 进行 Western-blot 检测,结果(见图 8)显示纯化的重组蛋白在 24 ku 处均有明显印记条带,表明利用杆状病毒表达系统成功表达了携带 His 标签的重组蛋白 S1CD,其与 PEDV 阳性血清反应良好,具有良好的反应原性。3.6 重组蛋白的免疫原性检测3.6.1小鼠血清 IgG 抗体水平的检测结果见图 9。由图 9 可知:与 PBS 组相比,首次免疫后第 28,42 天,S1CD 蛋白组、PEDV 灭活疫苗组小鼠血清中特异性 IgG 抗体水平均极显著提高
16、(P0.05),而首次免疫后第 42 天小鼠血清中特异性 IgG 抗体水平极显著降低(P0.01)。3.6.2 小鼠血清 IL-4 和 IFN-含量的检测 结果见图 10。由图 10 可知:与 PBS 组相比,S1CD 蛋白组和PEDV 灭活疫苗组小鼠血清中 IL-4 和 IFN-含量均极显著提高(P0.01);另外,与 S1CD 蛋白组相比,PEDV 灭活疫苗组小鼠血清中 IL-4 含量显著提高(P0.05)。4 讨论与结论自 2010 年以来 PEDV 在全球范围内不断暴发,已成为危害仔猪健康的最严重病原之一。目前,市场上正在使用的 PEDV 疫苗主要是灭活疫苗和弱毒疫苗,但灭活疫苗产生免
17、疫力较慢,而弱毒疫苗存在毒力返强和潜在感染的风险2,已经难以有效控制病42023(15):1-7,129试验研究M.蛋白质 Marker;1.P3 代病毒感染的 Sf9 昆虫细胞;27.第 16 次洗脱液。图 7 重组蛋白 S1CD 的 SDS-PAGE 分析结果Fig.7 SDS-PAGE analysis results of recombinant protein S1CDM.蛋白质 Marker;1.Sf9 昆虫细胞对照;2.纯化的重组蛋白 S1CD。图 8 重组蛋白 S1CD 的 Western-blot 检测结果Fig.8 Western-blot determination re
18、sults of recombinant protein S1CD注:同一时间点柱标大小写字母相同表示差异不显著(P0.05),大小写字母不同表示差异极显著(P0.01)。图 9 血清中特异性 IgG 抗体水平的检测结果Fig.9 Determination results of specific IgG antibody in serum毒的传播。为保证养猪业的健康发展,对 PEDV 新型疫苗的研究力度正逐渐加大13-15。亚单位疫苗因具有抗原成分明确、免疫持续时间长、安全稳定等优势而受到研究者的广泛关注,已成为开发 PEDV 疫苗的主要方向。PEDV 的 S1 蛋白或者 COE 抗原表位作
19、为亚单位疫苗预防猪流行性腹泻(PED)已有大量的52023(15):1-7,129试验研究注:柱标大小写字母均不同表示差异极显著(P0.01),大写字母相同、小写字母不同表示差异显著(P0.05)。图 10 血清中 IL-4 和 IFN-含量的检测结果Fig.10 Determination results of IL-4 and IFN-levels in serum研究报道,动物免疫试验证实这两种蛋白质均具有良好的免疫原性,但至今 PEDV 亚单位疫苗仍未成功上市16-17,推测原因可能是 S1 蛋白含有许多冗余的非抗原区域,而 COE 抗原表位过于单一,因此两者均未能达到最好的免疫原性。
20、朱利塞等18研究发现,与单一抗原表位相比,串联多个抗原表位可以增强抗原的免疫原性,本研究将 S1 蛋白的抗原表位 COE 和S1D 通过 GGGGS 串联起来得到 S1CD 基因,将其在杆状病毒表达系统中表达并分析免疫原性,以期为PEDV 亚单位疫苗的研制提供参考。目前常用的大肠杆菌、乳酸杆菌和酵母细胞等表达系统在生产 PEDV 亚单位疫苗时都存在一定的挑战性,经常出现包涵体表达的情况,因此需要使用更高效的表达系统。杆状病毒表达系统是一种优秀的真核表达系统,其主要特点是表达产物经过良好的翻译后修饰,免疫原性和生物活性更接近天然蛋白质,免疫应答的激活更加高效,目前被广泛用于亚单位疫苗研发、药用蛋
21、白质制备等领域19-21。基于此,本研究通过杆状病毒表达系统对 S1CD 蛋白进行了重组表达和纯化,结果重组蛋白 S1CD 在杆状病毒表达系统中实现了可溶性表达。通过间接免疫荧光试验和Western-blot 检测发现,表达的重组蛋白 S1CD 可以被鼠抗 His 单克隆抗体和 PEDV 阳性血清特异性识别,表明重组蛋白 S1CD 在杆状病毒表达系统中成功表达,并具有很好的反应原性,满足了后续试验需要。为了评价重组蛋白 S1CD 的免疫原性,本研究用纯化的 S1CD 蛋白、PEDV 灭活疫苗和 PBS 分别对 6周龄 Balb/c 小鼠进行 3 次免疫。特异性 IgG 抗体水平检测结果显示,在
22、第 2,3 次免疫后,重组蛋白 S1CD均能刺激小鼠产生高水平的 IgG 抗体,与 PBS 组相比差异极显著,这表明重组蛋白 S1CD 具有良好的免疫原性。另外,IL-4 和 IFN-作为重要的细胞因子,其表达水平可以直接反映机体免疫功能22-23。IL-4在抗原递呈和淋巴细胞激活过程中发挥重要作用,是体液免疫的重要调节因子;IFN-能直接增强自然杀伤(NK)细胞抗病毒的能力,在细胞免疫中起关键作用。为了研究重组蛋白 S1CD 对小鼠免疫状况的影响,检测 3 次免疫后小鼠血清中 IL-4 和 IFN-含量,结果表明,与 PBS 组相比,S1CD 蛋白组 IL-4 和IFN-含量极显著提高,表明
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