藻蓝蛋白粗提工艺研究_盛晶梦.pdf

收稿日期:2 0 2 3-0 2-1 2;修回日期:2 0 2 3-0 2-2 8基金项目:2 0 1 7年度安徽高校自然科学研究重点项目(K J 2 0 1 7 A 6 0 4);2 0 1 9年度安徽高校自然科学研究重点项目(K J 2 0 1 9 A 1 0 1 1)。作者简介:盛晶梦(1 9 9 1-),女,安徽淮南人,硕士,从事水污染治理方向的教学与研究。第2 3卷第2期安徽水利水电职业技术学院学报V o l.2 3N o.22 0 2 3年6月J O U R N A LO FA NHU IT E C HN I C A LC O L L E G EO FW A T E R R E S O U R C E SA N DHY D R O E L E C T R I CP OWE RJ u n.2 0 2 3藻蓝蛋白粗提工艺研究盛晶梦,张祥霖,尹 程(安徽水利水电职业技术学院,安徽 合肥 2 3 1 6 0 3)摘 要:以新鲜蓝藻藻泥为实验材料,通过设置单因素及正交实验来研究利凡诺沉淀法和活性炭吸附法2种粗提工艺的提纯效果和最优参数。结果发现:在利凡诺添加量为2 m l、处理次数为2次,活性炭粒径为7 5m5 0m、添加量为1.2g时,粗提效果较好,可为蓝藻规模化处理扩展思路。关键词:利凡诺;活性炭;粗提;藻蓝蛋白D O I:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 6 7 1-6 2 2 1.2 0 2 3.0 2.0 0 8中图分类号:X 5 2 4 文献标识码:A 文章编号:1 6 7 1-6 2 2 1(2 0 2 3)0 2-0 0 3 2-0 6S t u d yo nc r u d e e x t r a c t i o no fC-p h y c o c y a n i nf r o mc y a n o b a c t e r i aS HE NGJ i n g m e n g,Z HANGX i a n g l i n,Y I NC h e n g(A n h u iT e c h n i c a lC o l l e g eo fW a t e rR e s o u r c e sa n dH y d r o e l e c t r i cP o w e r,H e f e i 2 3 1 6 0 3,C h i n a)A b s t r a c t:I nt h i sp a p e r,f r e s hc y a n o b a c t e r i am u d i su s e da se x p e r i m e n t a lm a t e r i a l,a n dt h ee x t r a c t i o ne f f e c ta n do p t i m a l p a r a m e t e r so fR i v a n o l p r e c i p i t a t i o nm e t h o da n da c t i v a t e dc a r b o na d s o r p t i o nm e t h o da r es t u d i e db ys e t t i n gs i n g l e f a c t o ra n do r t h o g o n a l e x p e r i m e n t s.T h er e s u l t ss h o wt h a t t h ec r u d ee x-t r a c t i o ne f f e c t i sb e t t e rw h e n t h ed o s a g eo fR i v a n o l i s 2m lw i t hs e c o n d a r y t r e a t m e n t,w h i l e t h ed o s a g eo f 7 5m5 0ma c t i v a t e dc a r b o n i s1.2g,w h i c hc a ne x p a n dt h e i d e a f o r t h es c a l e t r e a t m e n to f c y a-n o b a c t e r i a.K e yw o r d s:R i v a n o l;a c t i v a t ec a r b o n;c r u d ee x t r a c t i o n;C-p h y c o c y a n i n蓝藻含有丰富的营养物质,其中藻蓝蛋白具有显著的资源化利用潜力。纯度越高价值也越高,通常可分为食品级(纯度0.7)、反应级(纯度3.9)和分析级(纯度4.0)三类1。藻蓝蛋白属于胞内蛋白质,藻细胞破碎后的溶液中除了藻蓝蛋白外还含有大量其他的蛋白质、多糖和脂质等物质2,其提纯通常包括细胞破碎、粗提和纯化3个步骤,传统的方法有超滤法、盐析法、柱层析法等3,4。同时,一些新型的提纯方法如双水相萃取法、利凡诺沉淀法、活性炭吸附法等也为藻蓝蛋白的提纯拓宽了思路。藻蓝蛋白提纯技术的关键是在兼顾纯度和回收率的基础上探索多种方法的组合使用,以实现简化操作、缩减成本和缩短周期等目的。利凡诺是一种有机阳离子絮凝剂,在特定条件下通过控制其含量、p H等条件可以选择性的沉淀某些蛋白质5。而活性炭作为一种常见的吸附剂,在水处理中的使用也较多。2种方法所需要用到的仪器设备简单、操作性强且成本可控。因此,本文选择通过设置单因素及正交实验,探究这2种粗提方法的最佳工艺条件,为简化藻蓝蛋白提纯操作、实现蓝藻规模化处理和改善湖泊富营养化情况提供新的思路。1 材料与方法1.1 材料蓝藻:采用野外新鲜蓝藻藻泥(取自巢湖水域),藻体用清水洗净,然后密封放置于-4 冰箱冷冻保存。常用试剂:活性炭、HC l、N a OH、P B S缓冲液(浓度为0.0 0 25m o l/L)、利凡诺等。1.2 分析方法(1)藻蓝蛋白纯度(P)。用紫外可见光分光光度计测定蓝藻蛋白溶液吸光度(A)可发现,藻蓝蛋白在6 2 0n m处有最大特征吸收峰,总蛋白则在2 8 0n m处有最大吸收峰。由此可以参考H e r r e r a等6推荐的公式来计算藻蓝蛋白纯度。P=A6 2 0A2 8 0(1)其中,A2 8 0、A6 2 0分别为波长2 8 0n m、6 2 0n m处的吸光度。(2)藻蓝蛋白回收率(Y)。先根据S o n i等7推荐的公式,计算出藻蓝蛋白的质量浓度(C),然后就可以得出藻蓝蛋白的回收率。C=(A6 2 0-0.7A2 8 0)/7.3 8(2)Y=(C V/C0V0)1 0 0%(3)其中,C为样品中的藻蓝蛋白质量浓度;C0为粗提液中的藻蓝蛋白质量浓度;V为样品溶液的体积;V0为粗提液的体积。1.3 蓝藻细胞破碎与初步处理1.3.1 蓝藻细胞破碎先将-4冷冻保存的蓝藻藻泥置于室温(2 5)下融解,再置于-4环境下冷冻,重复2次,完成蓝藻细胞冻融破壁操作。最后,用4层普通纱布滤去藻渣,即获得蓝藻细胞破壁液。1.3.2 利凡诺与活性炭处理效果初步验证将上一步所得蓝藻细胞破壁液取4 0m l分成2组,分别进行如下操作,然后测量所得粗提液的吸光度,初步验证利凡诺与活性炭的处理效果:第1组:向细胞破壁液中加入1m l质量浓度为4g/L的利凡诺溶液,搅拌均匀,于4条件下静置过夜,滤去沉淀后测量吸光度;然后,再加入1g粉末活性炭,搅拌均匀,静置5m i n后滤去沉淀,取上清液测量吸光度。第2组:向细胞破壁液中先加入1g粉末活性炭,搅拌均匀,静置5m i n后滤去沉淀,取上清液测量吸光度;然后,再加入1m l质量浓度为4g/L的利凡诺溶液,搅拌均匀,于4条件下静置过夜,滤去沉淀后测量吸光度。1.4 利凡诺处理单因素实验通过单因素实验设计,分别考察不同利凡诺添加量和处理次数对于藻蓝蛋白粗提效果的影响。1.4.1 利凡诺添加量对藻蓝蛋白提纯效果的影响取步骤1.3.1所得蓝藻细胞破壁液1 2 0m l,分成6组,向每组中分别加入质量浓度为4g/L的利凡诺溶液0.5m l、1m l、1.5m l、2m l、2.5m l、3m l,搅拌均匀,于4条件下静置过夜,滤去沉淀后测量吸光度。1.4.2 利凡诺处理次数对藻蓝蛋白提纯效果的影响取步骤1.3.1所得蓝藻细胞破壁液1 0 0m l,分成5组,分别进行如下操作:第1组向溶液中加入质33第2期 盛晶梦,等:藻蓝蛋白粗提工艺研究量浓度为4g/L的利凡诺溶液2m l(步骤1.4.1中得出),搅拌均匀,于4条件下静置过夜,滤去沉淀后测量吸光度;第2组重复第1组的操作2次;后面各组以此类推第5组重复第1组的操作5次。1.5 活性炭处理单因素实验取适量步骤1.3.1所得蓝藻细胞破壁液,按照步骤1.4所得利凡诺沉淀条件4g/L的利凡诺溶液2m l,处理2次)处理之后,通过活性炭单因素实验设计,分别考察不同粉末活性炭粒径、添加量对于藻蓝蛋白粗提效果的影响。1.5.1 活性炭粒径对藻蓝蛋白提纯效果的影响取上一步骤所得藻蓝蛋白粗提液1 0 0 m l,分成5组,向每组中分别加入粒径为(1 5 0m7 5m),(7 5m5 0m),(5 0m3 8m),(3 8m3 1m),(BA。其中,A因素(利凡诺添加量)的均值对于纯度指标影响大小的顺序为k3k2k1,即A3(利凡诺添加量2.5m l)是A影响因素的优水平;B因素(利凡诺处理次数)的均值对于纯度指标影响大小的顺序为k3k2k1,即B3(处理3次)是B影响因素的优水平;C因素(活性炭添加量)的均值对于纯度指标影响大小的顺序为k3k2k1,即C3(2.0g)是C影响因素的优水平。所以对于藻蓝蛋白纯度指标而言,最佳水平组合为A3B3C3。对于对于藻蓝蛋白的回收率而言,由极差R的大小可知影响因素的主次顺序为:CBA。其中,A因素(利凡诺添加量)的均值对于纯度指标影响大小的顺序为k2k1k3,即A2(利凡诺添加量2m l)是A影响因素的优水平;B因素(利凡诺处理次数)的均值对于纯度指标影响大小的顺序为k2k1k3,即B2(处理2次)是B影响因素的优水平;C因素(活性炭添加量)的均值对于纯度指标影响大小的顺序为k1k2k3,即C1(1.2 g)是C影响因素的优水平。所以对于藻蓝蛋白纯度指标而言,最佳水平组合为A2B2C1。由于两个指标的最佳水平组合有所区别,所以需要对试验结果综合分析。对于粗提操作来说,无论是利凡诺处理还是活性炭处理,随着处理次数或试剂添加量的增加,藻蓝蛋白的纯度只能在一定程度内有所提高,回收率则会持续下降。粗提操作的目标主要是初步去除杂质,为后续的提纯操作打好基础,所以在追求提高纯度的同时更应注重藻蓝蛋白的回收率,避免藻蓝蛋白的总体产量不高。同时,粗提操作的次数、药剂添加的量也应优选更少的工艺。所以,本实验最终选定以藻蓝蛋白的回收率为优先考虑指标,在简化操作、缩短周期、降低成本的考虑下,确定最优工艺参数为:利凡诺添加量2m l,处理次数为2次,活性炭添加量为1.2g。在上述蓝藻破壁液粗提操作最优工艺条件(利凡诺添加量为2m l,处理次数为2次;活性炭粒径为7 5m5 0m,添加量为1.2g)下进行验证试验,结果表明:粗提处理后,藻蓝蛋白的纯度提升至1.6 7,回收率是6 1%。3 结 论由实验结果可知,利凡诺和活性炭对于藻蓝蛋白的提纯均有一定效果。且对单因素和正交实验结果分析可以得出,蓝藻破壁液粗提操作的最优工艺条件是利凡诺添加量为2m l,处理次数为2次;活性炭粒径7 5m5 0m,添加量为1.2g。相比盐析、双水相、柱层析等提纯方法,本研究工艺所需设备简单、试剂较少、操作性强,易于规模化扩大,这为治理水体富营养化、进行蓝藻规模化处理开阔了思路。参 考 文 献1 俞丽燕.藻蓝蛋白的性质和提取技术研究进展J.福建轻纺,2 0 2 0(5):4 6-5 1.2 包国良,王茵.螺旋藻中营养成分检测及其生物学活性研究J.中国卫生检验杂志,2 0 1 2,2 2(5):1 0 3 4-1 0 3 6.3 刘鑫阳,郜晋楠,段开红,等.2步盐析法纯化螺旋藻中藻蓝蛋白J.内蒙古农业大学学报(自然科学版),2 0 1 9,4 0(1):6 0-6 6.4 于淑坤,岳思君,李敏,等.钝顶螺旋藻藻蓝蛋白分离纯化J.食品科技,2 0 1 9,4 4(5):2 4 8-2 5 2.5 宋炳生,薛艳龙,屈步华.利凡诺结合盐析法制备丙种球蛋白的工艺改进J.中国生化药物杂志,1 9 9 4(1):4 9-5 1.6 HE R R E R AA,B OU S S I B AS,NA P O L E N ON EV,e t a l.R e c o v e r yo fp h y c o c y a n i nf r o mt h ec y a n o b a c t e r i u mS p i r u l i n am a x i m aJ.J o u r n a l o f a p p l i e dp h y c o l o g y,1 9 8 9,1(1):3 2 5-3 3 17 S ON IB,KA L AVA D I A B,T R I V E D IU,e ta l.E x t r a c t i o n,p u r i f i c a t i o na n dc h a r a c t e r i x a t i o no fp h y c o c y a n i nf r o m O s c i l l a t o r i aq u a d r i p u n c t u l a t a-I s o l a t e df r o mt h e r o c k ys h o r e so f b e t-D w a r k a,G u j a r a t,I n d i aJ.P r o c e s sb i o c h e m i s t y,2 0 0 6,4 1(9):2 0 1 7-2 0 2 3.(责任编辑 秦丽)73第2期 盛晶梦,等:藻蓝蛋白粗提工艺研究