直投式护色食窦魏斯氏菌产品的制备_曲红叶.pdf

http:/Email:jlndxb 吉林农业大学学报 2023，45（2）：228-236Journal of Jilin Agricultural University直投式护色食窦魏斯氏菌产品的制备*曲红叶1，刘超然1，董雨露1，胡瑞峰2，刘学军3*1.通化师范学院食品科学与工程学院，通化134002；2.辣小鸭食品有限公司，长春130000；3.吉林农业大学食品科学与工程学院，长春130118摘 要：为探究护色乳酸菌替代亚硝酸盐在低温腌制肉中的护色作用，通过温度梯度驯化和添加相容性溶质驯化获得可耐低温的护色食窦魏斯氏菌，以脱脂乳粉、甘油、甜菜碱、蔗糖为冻干保护剂，制备高活力的直投式护色食窦魏斯氏菌产品。结果表明：脱脂乳粉添加量6.63%，甜菜碱添加量3.20%，甘油添加量3.20%，蔗糖添加量5.30%，细胞存活率最高，为96.48%，经12个月储藏后，细胞存活率可达75%。关键词：直投式食窦魏斯氏菌；相容性溶质；亚硝酸盐中图分类号：TS201.3 文献标志码：A 文章编号：1000-5684（2023）02-0228-09DOI：10.13327/j.jjlau.2021.5565引用格式：曲红叶，刘超然，董雨露，等.直投式护色食窦魏斯氏菌产品的制备 J.吉林农业大学学报，2023，45（2）：228-236.Preparation of Direct-Vat Weissella cibaria Products*QU Hongye1，LIU Chaoran1，DONG Yulu1，HU Ruifeng2，LIU Xuejun3*1.College of Food Science and Engineering，Tonghua Normal University，Tonghua 134002，China；2.Laxiaoya Food Co.，Ltd.，Changchun 130000，China；3.College of Food Science and Engineering，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，ChinaAbstract：In order to investigate the color protection effects of replacing nitrite substitute with lactic acid bacteria in low temperature cured meat,the low temperature-resistant color-protecting W.cibaria was obtained by temperature gradient acclimation and adding compatible solute acclimation.Using skim milk powder,glycerin,betaine,and sucrose as lyoprotectants,a highly active direct-vat W.cibaria was prepared.The results showed that the addition of skim milk powder was 6.63%,the addition of betaine was 3.20%,the addition of glycerin was 3.20%,the addition of sucrose was 5.30%,and cell survival rate was 96.48%.After 12 months of storage,cell survival rate could reach 75%.Key words：direct-vat Weissella cibaria；compatible solute；nitrite亚硝酸盐一直是肉制品加工中的安全隐患，特别是在肉制品的成熟和贮存过程中，亚硝酸盐在酸性环境如胃中可转化形成N-亚硝胺类化合物，该类物质具有强烈的致癌、致畸及致突变作用1-2。因而，降低肉制品中的亚硝酸盐含量十分必要。乳酸菌作为公认安全的微生物（Generally recognized as safe，GRAS）已广泛应用于发酵肉制品中3-10，可改善产品风味，提高产品色泽，抑制病原性微生物，已作为多功能发酵剂应用于发酵肉制品中，并逐渐替代亚硝酸盐，如清酒乳杆菌*基金项目：通化师范学院学生创新与技能训练项目（CS2022131），吉林省重大科技计划项目（20170203011NY）作者简介：曲红叶，女，硕士，研究方向：动物食品科学与质量控制。收稿日期：2019-12-25*通信作者：刘学军，Email:曲红叶，等：直投式护色食窦魏斯氏菌产品的制备吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural UniversityCMRC15、植物乳杆菌 CMRC6、TN8、木糖葡萄球菌等11-12。魏斯氏菌属（Weissella）作为乳酸菌的新成员13，广泛分布在发酵制品中，是韩国发酵泡菜的优势菌株。因魏斯氏菌具有抗癌、抗致病菌、抗氧化、抗炎、提高免疫力等益生功能，引起研究者的关注14。Ammor 等15将 Weissella 作为发酵剂应用于肉制品中，发现Weissella 能促进肌肉蛋白的水解，赋予产品特殊的风味，并促进人体对营养物质的吸收。本课题组也将自行筛选的食窦魏斯氏菌作为发酵剂应用于发酵肉制品及广式腊肠中，均表现出良好的护色效果16。然而，目前尚未见将已筛选出的护色乳酸菌应用于低温腌制肉中以替代亚硝酸盐的报道。直投式乳酸菌产品，因其安全性好、活菌数高、保质期长、菌种不易退化而在市面上广泛应用。本研究将实验室自行筛选出的具有护色能力的食窦魏斯氏菌X31（W.cibaria X31），通过温度梯度驯化和添加相容性溶质驯化，获得可耐低温的 W.cibaria X31，并制备出高活力的直投式W.cibaria X31 产品。1材料与方法1.1供试材料护色菌株X31分离自中国传统发酵肉制品宣威火腿，并由生工生物工程（上海）有限公司经16S rDNA鉴定为食窦魏斯氏菌。猪瘦肉购自吉林华正农牧业股份有限公司。1.2试剂与仪器MRS培养基、甜菜碱（Sigma公司）、左旋肉碱（Sigma公司）、吐温-80、脱脂乳粉、甘油、蔗糖、亚硝酸钠（分析纯）。色差仪（美国 ColorFlex公司）、真空冷冻干燥机。1.3温度梯度驯化将 W.cibaria X31 从-80 冰箱中取出，室温复苏后，各取1 mL菌液接种到100 mL MRS液体培养基中，置于30 恒温培养摇床中培养24 h，连续培养 3 代后，取 X31 菌株对数生长期菌液1 mL 接种到新配制的 MRS 液体培养基中，置于20 恒温培养摇床中培养，连续培养10代。按照此步骤依次进行15，10，8，6，4 低温驯化。30，20，15，10 培养时，每2 h检测1次OD600值（紫外分光光度计在600 nm处测得光密度值），8，6，4 培养时，每1 d检测1次OD600值。1.4添加相容性溶质驯化将 W.cibaria X31 从-80 冰箱中取出，室温复苏后，各取1 mL菌液接种到100 mL MRS液体培养基中，置于30 恒温培养摇床中培养24 h，连续培养 3 代后，取 X31 菌株对数生长期菌液1 mL接种到改良MRS培养基（MRS培养基+1 g/L甜菜碱+0.5 g/L 左旋肉碱+3 g/L 吐温-80，记为MRS-1）中，置于15 恒温培养摇床中诱导培养48 h，再取 X31 菌株 15 培养液 1 mL，接种到MRS-1培养基中，置于4 恒温培养摇床中培养，连续培养10代。30，15 培养时，每2 h检测1次OD600值，4 培养时，每1 d检测1次OD600值。1.5响应面法优化相容性溶质添加量相容性溶质甜菜碱、左旋肉碱、吐温-80添加量因素水平见表1。选取甜菜碱添加量（A）、左旋肉碱添加量（B）、吐温-80添加量（C）3个因素为优化试验的变量，保护效果为响应值，进行响应面试验。保护效果主要依据菌株在4 下生长速度和护色效果确定，根据测定的OD600值，以OD600值对时间作图，得到直线斜率为K，K100即为生长速度。护色效果主要依据肉糜的红度值。1.6护色作用检测猪瘦肉去除筋腱、筋膜，切碎后，制成肉糜备用。将 30，20，15，10，4 培养好的食窦魏斯氏菌 W.cibaria X31，以106cfu/g接种到肉糜中，培养24 h，检测护色作用。称肉糜样品5.0 g，平铺于色差测定标准杯中。使用ColorFlex在Daylight模式下，D65 100测定样品的色差值L*表示黑白，a*表示红绿，b*表示黄蓝。使用前色差仪需预热30 min并使用标准板校准。1.7直投式护色乳酸菌产品制备1.7.1护色乳酸菌富集培养将驯化好的W.cibaria X31 以 1%接种量接种于 MRS 液体培养基中，置于4 摇床中培养。培养至对数生长期末表1相容性溶质添加量因素水平表g/LTable 1Factor levels of compatible solute addition水平-101因素甜菜碱A1.001.251.50左旋肉碱B0.100.300.50吐温-80C2.03.04.0229吉林农业大学学报 2023 年 4 月Journal of Jilin Agricultural University 2023，April稳定期前期，菌体浓度达到1011cfu/mL。1.7.2菌体收集本研究采用冷冻离心法，将高密度培养后的菌液在 10 000 g下离心 15 min，菌体用0.85%生理盐水洗涤2次备用。1.7.3保护剂配方的优化本研究选取脱脂乳粉、甘油、甜菜碱、蔗糖作为冻干保护剂。以这4 个因素的添加量为优化试验的变量，细胞存活率为响应值，进行响应面优化试验。1.7.4预冻及真空冷冻干燥离心好的护色食窦魏斯氏菌菌体细胞与复合保护剂进行混合，于-20 冷冻8 h，-80 冷冻4 h后，真空冷冻干燥12 h。1.7.5直投式护色剂细胞存活率检测取真空冷冻干燥后的乳酸菌产品 0.1 g，溶解在 20 mL PBS中，混匀2 h。加入生理盐水，在 37 水浴锅中水浴20 min，测定活菌数。活菌数测定方法使用平板倾注法17：将复水后的发酵剂样品 1 mL 加入到含有 9 mL 无菌水的试管中，振荡混匀成 1 10的稀释液（即 10-1）；从10-1稀释液中吸取 1 mL，注入含有 9 mL 无菌水的试管内，振荡混匀成 1 100的稀释液（即 10-2）；以此类推，稀释到 10-6；将灭菌的MRS琼脂培养基融化后冷却至约 45，倒入无菌平皿中，每个平皿中约15 mL。待培养基凝固后，分别吸取各稀释度的菌悬液 0.1 mL进行涂布，每个稀释度做2次重复，不同稀释度之间需要更换枪头。同时以 0.1 mL 无菌水进行涂布作为空白对照；将平板倒置于 37 恒温培养箱中进行培养，48 h后计算平板内菌落数。每毫升样品中菌落形成单位数（cfu）=同一稀释度3次重复的平均菌落数稀释倍数10。冷冻干燥细胞存活率（%）=（等量生理盐水重悬冻干菌粉后 1 mL的活菌数/1 mL冻干前样品的活菌数）100。1.7.6直投式护色剂储藏稳定性检测冻干后的护色乳酸菌细胞经真空包装后放在4 储藏。每 1 个月检测 1 次乳酸菌活力，共检测 12 个月。检测方法参考本文“1.7.5”。2结果与分析2.1温度梯度驯化后 W.cibaria X31护色能力检测由表3可知，经过不同温度梯度驯化后，W.cibaria X31的红度值明显高于阴性对照组MRS，与阳性对照组NaNO2接近，说明W.cibaria X31仍具有稳定的护色能力。表2保护剂添加量因素水平表Table 2Factor levels of protector addition%水平-101因素脱脂乳粉A2.507.5012.50甘油B1.003.005.00甜菜碱C2.03.04.0蔗糖D2.05.08.0表3不同温度下W.cibaria X31护色效果分析Table 3Effects of W.cibaria X31 on color protection at different temperatures项目L*值a*值b*值W.cibaria X31NaNO2MRSW.cibaria X31NaNO2MRSW.cibaria X31NaNO2MRS/3056.760.62Db66.761.21Aa60.261.11Cc8.390.16Ba9.330.06Aa5.390.10Ea18.270.36Aa17.440.19Ba16.620.31Cb2062.260.53Aa61.420.63Bb63.320.93Ba6.100.11Bd7.090.11Ad5.050.16Dc14.950.20Ba16.220.17Ac14.380.13Cb1552.290.67Bc52.661.03Bd58.510.97Ab6.880.08Bc7.390.16Bc5.330.11Cab16.330.31ABa16.620.32Ab17.140.26Aa1052.210.68Cd55.520.93Bc56.440.58Ac7.420.14Bb8.390.15Ab4.190.07Ed14.570.26Ca15.560.30Bc16.770.28Ab453.750.24Bc54.570.83Ad53.720.77Bd6.870.11Acd7.190.14Bd5.210.10Db17.430.32Aa15.720.27BCbc16.780.31Ab注：大写字母表示同列差异显著；小写字母表示同行差异显著（P0.05）。每组结果表示为平均值加减标准偏差（n=3）。L*表示黑白，a*表示红绿，b*表示黄蓝。表6同230曲红叶，等：直投式护色食窦魏斯氏菌产品的制备吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University2.2相容性溶质添加量响应面优化设计试验结果2.2.1回归方程及方差分析通过 Design-Expert分析，得到相容性溶质保护效果（Y）与甜菜碱添加量（A）、左旋肉碱添加量（B）、吐温-80添加量（C）之间的回归方程：Y=4.42-0.026A+0.078B-0.036C-7.510-3AB-510-3AC+7.510-3BC-0.086A2-0.15B2-0.051C2。由表4和表5可知，回归模型P0.05（不显著），说明该方程拟合程度良好；R2为0.980 7表明模型与试验数据有98.07%符合度。校正系数R2Adj 为0.975 9，表明该模型可以用来预测分析试验。一次项A、C与二次项A2、B2、C2 为极显著，一次项B、交互项AB、AC为显著，各因素间的影响关系为A（甜菜碱添加量）C（吐温-80添加量）B（左旋肉碱添加量）。表4相容性溶质添加量响应面试验结果Table 4Response surface test results of compatible solute addition试验号1234567891011121314151617181920因素A.甜菜碱/（gL-1）1.251.251.251.002.002.511.250.500.502.002.001.200.50-0.010.502.001.251.251.251.25B.左旋肉碱/（gL-1）0.300.300.300.500.30-0.040.300.000.100.100.101.000.300.500.300.500.300.300.300.64C.吐温-80/（gL-1）2.502.50-0.021.002.502.505.024.001.004.001.002.501.002.504.004.002.502.502.502.50保护效果6.006.002.004.005.704.004.501.801.006.004.006.002.000.502.866.005.805.905.905.00表 5回归方程方差分析结果Table 5Results of regression equation variance analysis方差来源模型ABCABACBCA2B2C2残差失拟项误差项总和R2=0.980 7；R2Adj=0.975 9平方和68.8832.740.997.040.500.72014.623.7813.120.0490.0160.03368.93自由度9111111111105519均方7.655.512E-0030.0480.0112.250E-0041.000E-0042.250E-0040.0310.0990.0116.150E-0048.083E-0044.700E-004F值1 556.106 656.75201.811 431.14101.66146.39050.64768.942 667.980.48P值0.000 10.000 10.044 40.002 00.034 40.018 80.564 40.000 20.000 10.003 90.300 3显著性*不显著注：“*”表示显著；“*”表示极显著。下表同231吉林农业大学学报 2023 年 4 月Journal of Jilin Agricultural University 2023，April2.2.2响应曲面图分析利用Design Expert对二次回归方程模型进行分析，各因素间相互作用响应面见图1。响应面中曲面陡，说明影响显著，平缓则影响不显著。由Design-Expert软件得出，甜菜碱添加量1.24g/L，左旋肉碱添加量0.25 g/L，吐温-80添加量3.68g/L时，保护效果最好，为6.839。2.3相容性溶质驯化后魏斯氏菌护色能力检测结果由表 6 可知，经过相容性溶质驯化后，W.cibaria X31的红度值均接近甚至高于阳性对照组，这与温度梯度驯化结果一致。图1甜菜碱、左旋肉碱和吐温-80添加量交互影响响应面Fig.1Response surface of the interaction between betaine，carnitine and tween-80表6相容性溶质驯化 W.cibaria X31护色效果分析Table 6Color-protecting effect of compatible solute domesticated W.cibaria X31项目L*值a*值b*值W.cibaria X31NaNO2MRSW.cibaria X31NaNO2MRSW.cibaria X31NaNO2MRS/3061.760.42Bb66.761.21Aa60.261.11Ca9.350.16Aa9.330.06Ba5.390.10Ea16.270.36Ca17.440.19Ba16.660.31Bb1562.260.53Aa52.661.03Db58.510.97Cb7.850.14Bb7.390.16Bb5.330.11Da15.950.20Ba16.620.32Ab17.140.26Aa460.210.58Bc54.570.83Cb53.720.77Db8.420.17Ab7.190.14Cb5.210.10Da14.570.26Cb15.720.27Bc16.780.31Aa232曲红叶，等：直投式护色食窦魏斯氏菌产品的制备吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University2.4保护剂配方响应面优化试验结果2.4.1回归方程及方差分析通过Design-Expert分析，得到细胞存活率（Y）与脱脂乳粉添加量（A）、甘油添加量（B）、甜菜碱添加量（C）、蔗糖添加量（D）之间的回归方程：Y=76.97-2.87A+1.53B+2.00C+0.18AB-1.32AC-1.71BC-10.59A2-7.36B2-11.15C2。由表7和表8可知，回归模型P0.05（不显著），说明该方程拟合程度良好；R2为0.988 0表明模型与试验数据有98.8%符合度。校正系数R2Adj为0.976 8，表明该模型可以用来预测分析试验。一次项、交互项AD、BD、CD、二次项为极显著，交互项AB为显著，各因素间的影响关系为A（脱脂乳粉添加量）C（甜菜碱添加量）B（甘油添加量）D（蔗糖添加量）。2.4.2响应曲面图分析利用Design Expert对二次回归方程模型进行分析，各因素间相互作用响应面见图2。响应面中曲面陡，说明影响显著，平缓则影响不显著。由Design-Expert软件得出，脱脂乳粉添加量在6.63%，甜菜碱添加量3.20%，甘油添加量3.20%，蔗糖添加量5.30%，细胞存活率最高，为96.48%。表7保护剂配方响应面试验结果Table 7Response surface test results of protector%试验号123456789101112131415161718192021222324252627282930因素A.脱脂乳粉6.256.252.5010.002.506.256.252.506.2513.7510.0010.00-1.2510.002.506.2510.006.256.252.506.252.506.2510.0010.006.252.502.5010.006.25B.甘油3.003.005.001.001.00-1.003.001.003.003.005.005.003.005.005.007.005.003.003.001.003.005.003.001.001.003.001.005.001.003.00C.甜菜碱3.003.005.005.001.003.00-1.001.003.003.005.001.003.001.001.003.005.003.003.005.003.005.007.001.005.003.005.001.001.003.00D.蔗糖5.005.008.002.008.005.005.002.005.005.008.002.005.008.002.005.002.005.0011.002.001.002.005.008.008.005.008.008.002.005.00细胞存活率95.7796.0080.2189.0075.6875.0076.8955.4595.6989.7688.0088.0061.0085.5476.0082.0095.6693.0089.5670.0080.3580.4590.9788.7988.0095.7280.4576.3280.0095.45233吉林农业大学学报 2023 年 4 月Journal of Jilin Agricultural University 2023，April表8回归方程方差分析结果Table 8Results of regression equation variance analysis方差来源模型ABCDABACADBCBDCDA2B2C2D2残差失拟项误差项总和R2=0.988 0；R2Adj=0.976 8平方和2 999.951 147.48134.47229.0991.4624.985.4468.435.14147.0840.10659.99466.79210.12173.0251.4645.116.353 051.41自由度14111111111111111510529均方214.281 147.48134.47229.0991.4624.985.4468.435.14147.0840.10659.99466.79210.12173.023.434.511.27F值62.46334.4739.2066.7826.667.281.5919.951.5042.8711.69192.37136.0661.2550.433.55P值0.000 10.000 10.000 10.000 10.000 10.016 50.227 20.000 50.239 80.000 10.003 80.000 10.000 10.000 10.000 10.087 1显著性*不显著图2保护剂添加量对细胞存活率交互影响响应面图Fig.2Response surface of the interaction between protector addition and cell viability234曲红叶，等：直投式护色食窦魏斯氏菌产品的制备吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University2.5直投式护色乳酸菌储藏稳定性结果由图3可见，本研究制备的直投式W.cibaria X31护色剂在 4 条件下12 个月的存储时间里，细胞存活率一直在下降，但是W.cibaria X31的存活率还保持在75%以上，说明本研究采用的复合保护剂具有提高细胞存活率，延长储藏期等优点，贮藏性能良好。3讨论本研究结果表明，护色食窦魏斯氏菌经温度梯度和添加相容性溶质驯化后，仍具有稳定的护色能力，并且添加脱脂乳粉、甘油、甜菜碱、蔗糖做保护剂，经冷冻干燥后，细胞存活率为96.48%，经12个月储藏后，细胞存活率可达75%。因而，在未来的研究中可将直投式护色食窦魏斯氏菌产品应用在低温腌制肉制品中以替代亚硝酸盐。参考文献：1 Hammes W P.Metabolism of nitrate in fermented meats：the characteristic feature of a specific group of fermented foods J.Food Microbiology，2012，29（2）：151-156.2 Wang X H，Ren H Y，Liu D Y，et al.Effects of inoculating Lactobacillus sakei starter cultures on the microbiological quality and nitrite depletion of Chinese fermented sausagesJ.Food Control，2013，32（2）：591-596.3 Li P J，Luo H T，Kong B H，et al.Formation of red myoglobin derivatives and inhibition of spoilage bacteria in raw meat batters by lactic acid bacteria and Staphylococcus xylosusJ.LWT-Food Science and Technology，2016，68：251-257.4 Oh C K，Oh M C，Kim S H.The depletion of sodium nitrite by lactic acid bacteria isolated from kimchi J.Journal of Medicinal Food，2004，7（1）：38-44.5 Tompkin R B，Christiansen L N，Shaparis A B.Enhancing nitrite inhibition of Clostridium botulinum with isoascorbate in perishable canned cured meat J.Applied and Environmental Microbiology，1978，35（1）：59-61.6 Paik H D，Lee J Y.Investigation of reduction and tolerance capability of lactic acid bacteria isolated from kimchi against nitrate and 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