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PD-1抑制剂通过STAT6介导肿瘤相关巨噬细胞极化抑制前列腺癌细胞的增殖和侵袭.pdf
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1、医学分子生物学杂志,2023,20(5):382-389 J Med Mol Biol,2023,20(5):382-389DOI:10.3870/j.issn.1672-8009.2023.05.002资助项目:海南省自然科学基金(No.822RC851)通讯作者:谢亚彬(电话:18689858956,E-maill:)This work was supported by a grant from the Natural Science Foundation of Hainan Province(No.822RC851)Corresponding author:XIE Yabin(Tel:8
2、6-18689858956,E-mail:)PD-1 抑制剂通过 STAT6 介导肿瘤相关巨噬细胞极化抑制前列腺癌细胞的增殖和侵袭曲军,陈科,陈宋林,冯湖文,谢亚彬海南省肿瘤医院泌尿外科 海口市,570311【摘要】目的 探究 PD-1 抑制剂对肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAM)极化和前列腺癌细胞增殖和侵袭的作用及其相关机制。方法 采集 25 例前列腺癌患者肿瘤及癌旁组织,实时定量荧光PCR(qRT-PCR)检测程序性死亡因子 1(programmed death-1,PD-1)、巨噬细胞甘露糖受体(macrophagemannose rece
3、ptor,CD206)和信号转导和转录激活因子 6(signal transduction and transcription activator 6,STAT6)表达水平并进行斯皮尔曼(Spearman)相关性分析。将人单核细胞白血病细胞(human monocyticleukemia cells,THP-1)细胞诱导为 TAM,期间加入 PD-1 抑制剂 Camrelizumab,分组为 M0 组、M0+Camre-lizumab 组、TAM 组、TAM+Camrelizumab 组;THP-1 细胞诱导为 TAM 期间加入 STAT6 抑制剂 AS1517499,分组为 M0 组、M0+
4、AS1517499 组、TAM 组、TAM+AS1517499 组。通过 qRT-PCR 和蛋白质印迹法检测STAT6 和 CD206 表达水平,酶联免疫吸附反应检测白介素 13(interleukin-13,IL-13)、转化生长因子-(transforming growth factor-,TGF-)和一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase,iNOS)分泌水平。将各组细胞分别与前列腺癌细胞 DU145 共孵育,通过 CCK8 检测 DU145 细胞增殖水平,Transwell 检测 DU145 细胞侵袭水平。结果 与癌旁组织相比,前列腺肿瘤组织中 PD-1、CD206
5、和 STAT6 表达水平升高,并在肿瘤组织中呈正相关(P均0.05)。与 M0 组相比,TAM 组 CD206 和 STAT6 表达水平升高,IL-13、TGF-分泌水平增加,iNOS 分泌水平减少,与其共孵育的 DU145 细胞增殖水平升高,侵袭能力增强(P均 0.05)。与TAM 组相比,TAM+Camrelizumab 组 CD206 和 STAT6 表达水平降低,IL-13、TGF-分泌水平减少,iNOS分泌水平增加,与其共孵育的 DU145 细胞增殖水平降低,侵袭能力减弱(P均 0.05)。与 TAM 组相比,TAM+AS1517499 组 CD206 表达水平降低,IL-13、TG
6、F-分泌水平减少,iNOS 分泌水平增加,与其共孵育的 DU145 细胞增殖水平降低,侵袭能力减弱(P均0.05)。结论PD-1 抑制剂通过抑制巨噬细胞向 TAM极化从而降低前列腺癌细胞的增殖和侵袭,其作用机制可能是通过抑制巨噬细胞 STAT6 通路实现。【关键词】肿瘤相关巨噬细胞;巨噬细胞极化;前列腺癌;PD-1 抑制剂【中图分类号】R737.25PD-1 Inhibitor Inhibits Prostate Cancer Cell Proliferation and Invasionthrough STAT6 Mediated Tumor-associated Macrophage Po
7、larizationQU Jun,CHEN Ke,CHEN Songlin,FENG Huwen,XIE YabinDepartment of Urology,Hainan Cancer Hospital,Haikou,570311,China【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of PD-1 inhibitors on tumor-associated macro-phage(TAM)polarization and proliferation and invasion of prostate cancer,and the related
8、 mech-anisms.Methods The tumor and adjacent tissues of 25 patients with prostate cancer were collect-ed.The expression levels of programmed death factor 1(PD-1),macrophage mannose receptor(CD206)and signal transduction and transcription activator 6(STAT6)were detected by real-time quantitative fluor
9、escent PCR(qRT-PCR),and Spearman correlation analysis was then per-formed.Human monocytic leukemia cells(THP-1)were induced to TAM,during which the PD-1inhibitor Camrelizumab or the STAT6 inhibitor AS1517499 was added.The above cells were dividedinto 4 groups of M0,M0+Camrelizumab,TAM and TAM+Camrel
10、izumab,or 4 groups of M0,M0+AS1517499,TAM and TAM+AS1517499.The expression levels of STAT6 and CD206 weredetected by qRT-PCR and Western blotting,and the concentration of interleukin-13(IL-13),transforming growth factor-(TGF-)and nitric oxide synthase(iNOS)were detected by en-zyme-linked immunosorbe
11、nt assay(ELISA).Each group of cells were co-cultured with prostatecancer cells(DU145).The proliferation level of DU145 cells were detected by CCK8,and the in-vasion level were detected by Transwell assay.Results The expression levels of PD-1,CD206 andSTAT6 in the prostate tumor tissues were elevated
12、 when compared with those in the adjacent tissues,and the expressions of PD-1,STAT6 were positively correlated with the expression of CD206 intumor tissues respectively(all P0.05).The expression levels of CD206 and STAT6 and the secre-tion levels of IL-13 and TGF-were increased,while the level of iN
13、OS was decreased in the TAMgroup,when compared with those in the M0 group,and the proliferation and invasion ability ofDU145 cells co-cultured with the TAM were increased(all P 0.05).The expression levels ofCD206 and STAT6 were reduced in the TAM+Camrelizumab group when compared with the TAMgroup,in
14、 addition,the secretion levels of IL-13 and TGF-were also decreased,the secretionlevels of iNOS was increased.Meanwhile,the proliferation and invasion ability of DU145 cells co-cultured with cells in the TAM+Camrelizumab group were decreased(all P0.05).The cells inthe TAM+AS1517499 group also had th
15、e reduced expression level of CD206,decreased secretionlevels of IL-13 and TGF-and increased secretion levels of iNOS when compared with those in theTAM group.Meanwhile,the proliferation and invasion ability of DU145 cells co-cultured with cellsin the TAM+AS1517499 group were decreased(all P0.05).Co
16、nclusionPD-1 inhibitors re-duce the proliferation and invasion of prostate cancer cells by inhibiting the polarization of macropha-ges to TAM,which may be achieved by inhibiting the STAT6 signaling pathway in macrophages.【Key words】tumor-associated macrophages;macrophage polarization;prostate cancer
17、;pro-grammed death-1 inhibitors 据统计,前列腺癌是全球第二大致命的男性恶性肿瘤,也是全球第五大癌症死亡原因1。由于前列腺癌具有早期不易察觉,预后性差等特点,其死亡率一直居高不下2,因此探索前列腺癌的发病机制,寻找有效的分子标记物或药物治疗的靶点对于前列腺癌的治疗至关重要。肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macro-phages,TAM)可以通过多种途径促进肿瘤细胞的生长及转移,约占前列腺肿瘤总免疫浸润细胞的30%3,通过发挥其免疫抑制作用,驱动肿瘤细胞耐药性并促进其逃逸、转移、侵袭和上皮细胞间质转化4。一般来说,前列腺癌组织中的 TAM 密度
18、越高,预后越差并且患者的总生存期越差5。研究表明,在前列腺癌组织中存在大量的 M2 型TAM 浸润,可能与抑制肿瘤免疫微环境、促进肿瘤耐药有关6。STAT6 是 M2 型巨噬细胞活化过程中的关键因子7,Tariq 等8发现,STAT6 磷酸化介导 TAM 的 M2 型极化在促进肺癌细胞生长、侵袭、转移和血管生成中发挥着关键作用,抑制STAT6 的磷酸化将抑制肿瘤的生长。PD-1/PD-L1 通路是目前肿瘤免疫治疗的研究热点,与肿瘤的免疫逃逸有关,研究表明 PD-1 可以影响免疫细胞在肿瘤中的浸润从而影响肿瘤的发展9。但是通过抑制 PD-1 是否改变 TAM 极化,从而影响前列腺癌的发展目前仍不
19、清楚,STAT6 磷酸化在 TAM 极化中发挥关键作用,抑制 PD-1 是否改变 STAT6 的活化状态尚待阐明。在本研究中,我们旨在研究 PD-1、STAT6 与 M2 型 TAM 标志物CD206 在前列腺癌组织中的表达,并进一步探索抑制 PD-1 对于肿瘤免疫微环境的影响,为将来进一步探索前列腺癌的治疗方法提供参考依据。1 材料与方法1.1 临床样本收集了 2020 年 7 月至 2022 年 5 月在我院就诊的 25 例前列腺肿瘤患者的癌组织及其癌旁组织(距肿瘤边缘3 mm),患者此前均未接受放疗和化疗。取样后立即放在冻存管并置于液氮中。所有患者术前均已签署知情同意书。本研究在海南省肿
20、瘤医院伦理委员会的监督下获得批准和实施。1.2 细胞和主要试剂人前列腺癌细胞 DU145、THP-1 细胞购自中科院上海细胞库;AS1517499 与 Camrelizumab 购自美国 MedChemexpress 公司;CD206、STAT6 和 GAP-DH 抗体购自 proteintech 公司;胎牛血清和 RPMI1640 培养基均购自美国 Giboco 公司;IL4、佛波酯(PMA)购自 sigma 公司;qRT-PCR 试剂盒(RNA提取试剂、逆转录试剂盒和 SYBR Green 试剂)、383医学分子生物学杂志,2023,20(5):382-389 J Med Mol Biol
21、,2023,20(5):382-389IL-13、TGF-和 iNOS ELISA 试剂盒购自南京建成生物工程研究所;CCK8 试剂盒购自 Vazyme 公司;Transwell 小室购自 Corning 公司;磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、PD-1、CD206 和 STAT6 引物由上海生工生物工程有限公司合成;台式低温高速离心机购于美国 Thermo Fisher Scientific 公司;ATC 实时荧光定量自动化 PCR 仪购于美国 Applied Biosys-tems 公司。1.3 实验方法1.3.1 细胞培养 在 37、5%CO2恒温的湿润细胞培养箱中,使用含 10%胎牛血清
22、的 RPMI1640 培养基对人 THP 细胞进行培养。每 3 天更换一次新鲜的培养基,并根据细胞生长密度和培养基的颜色变化及时更换新鲜的培养基,以确保细胞得到充足的营养和细胞毒性物质的清除。每日观察细胞生长状态是否正常,当细胞的生长密度达到70%80%时进行传代培养,实验时选取对数生长期的细胞。1.3.2 THP-1 细胞分化和给药将 THP-1 接种至6 孔细胞培养板,按照 1 mL 细胞悬液含 4 105个THP-1 细胞,添加20 L PMA(100 ng/mL),将经PMA 刺激贴壁转化后的细胞根据后续实验要求更换培养基。以上细胞分别加入 Camrelizumab(50nmol/L)
23、共孵育,同时加入 IL-4(45 ng/mL)刺激 48 h,分组为 M0 组、M0+Camrelizumab 组、TAM 组、TAM+Camrelizumab 组;以上细胞分别加入 AS1517499(200 nmol/L)共孵育,同时加入IL-4(45 ng/mL)刺激48 h,分组为 M0 组、M0+AS1517499 组、TAM 组、TAM+AS1517499 组。1.3.3 qRT-PCR 检测 mRNA 的表达 依照产品说明书,分别采用 Trizol 试剂从前列腺癌患者的肿瘤、癌旁组织以及细胞中提取总 RNA,通过逆转录试剂盒将 RNA 逆转录为 cDNA,按照 SYBRqPCR
24、检测试剂盒说明书指示,制备 qRT-PCR 预混液。采用 2-Ct法计算基因的相对表达量。所用引物由上海生工生物工程有限公司设计并合成,引物序 列 如 下:GAPDH-F,5-GAAAGCCTGCCGGT-GACTAA-3,GAPDH-R,5-TTCCCGTTCTCAGCCT-TGAC-3;PD-1-F,5-TGGATTTCCAGTGGCGA-GAG-3,PD-1-R,5-TGACCTTGGGACCGTAGGAT-3;CD206-F,5-GCAGAAGGAGTAACCCACCC-3,CD206-R,5-TGGCAAATGAAGGCGTTTGG-3;STAT6-F,5-CTCGCTGGACAGA
25、GCTACAGA-3,STAT6-R,5-CAACCCCTCACCTCGGCAA-3。1.3.4蛋白质印迹检测蛋白的表达使用 RIPA裂解液提取各组细胞的总蛋白质,接着使用 10%的 SDS-PAGE 预制胶对蛋白质进行电泳分离,电泳条件:120 V 恒压,60 min,提前使用甲醇活化PVDF 膜,使用恒流300 mA,50 min 将蛋白转移至PVDF 膜上。为了消除非特异性结合,对 PVDF 膜采用 5%脱脂奶粉室温封闭 1 h,加入一抗 CD206(1 1 000),STAT6(1 1 000),GAPDH(1 2 500)置于 4 冰箱中孵育过夜。第二天,使用TBST 缓冲液清洗 P
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