淫羊藿与附子治疗膝骨关节炎的网络药理学作用机制研究_侯佳瑶.pdf

生物信息学 ：网络首发 ：（）淫羊藿与附子治疗膝骨关节炎的网络药理学作用机制研究侯佳瑶，张亚奇，王小钢，邢光艳，赵子义（北京中医药大学东直门医院，北京 ；北京中医药大学第一临床医学院，北京 ）摘要目的以网络药理学方法为基础分析淫羊藿与附子治疗膝骨关节炎（）的潜在作用机制。方法采用中药系统药理学分析平台（）获取药物的活性成分及其潜在靶点，根据药物的吸收、分布、代谢、排泄（）属性对药物活性成分进行筛选，并结合相关文献进行补充；通过 数据库检索活性成分的 结构式和 结构，经 筛选后将符合标准的化学成分传入 数据库预测药物作用靶点；选用关键词“”或“”在 、在线人类孟德尔遗传（）、数据库检索与 相关的主要靶点；绘制韦恩图，获取淫羊藿附子与 的交集靶点；基于 数据库构建药物与疾病共同靶点的蛋白互作（）网络；利用 软件构建“药物活性成分靶点”网络及 网络中关键靶点信息图。利用 平台对药物与疾病交集靶点进行基因本体（）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（）通路富集分析。结果通过 检索及文献补充共获取药物活性成分 个，主要为槲皮素、山奈酚、木犀草素、淫羊藿苷、乌头碱、次乌头碱、中乌头碱等，药对相关靶点 个；作用于的潜在治疗靶点 个，关键靶点有白细胞介素（）、肿瘤坏死因子（）、基质金属蛋白酶（）、血管内皮生长因子（）等；功能富集分析表明关键基因主要参与细胞对脂类和缺氧的反应、细胞正反馈等生物过程；通路富集分析获得 条信号通路，主要涉及晚期糖基化终产物（）信号通路、脂质和动脉粥样硬化、磷脂酰肌醇激酶蛋白激酶（）信号通路等。结论淫羊藿与附子主要通过、等关键靶点与 、脂质和动脉粥样硬化、等信号通路产生交互作用，达到抑制炎症因子释放和软骨细胞破坏的目的，从而治疗。关键词淫羊藿；附子；信号通路；膝骨关节炎；网络药理学 中图法分类号 文献标识码 文章编号 （），（.，；.，）（）（），（），（）（），“”“”重庆医学 年月第 卷第期基金项目：北京中医药大学东直门医院科技创新专项（）。作者简介：侯佳瑶（），在读硕士研究生，主要从事中西医结合治疗脊柱关节外科疾病研究。通信作者，：。，（）（）“”（）（），（），（），（），（），（），（），；膝骨关节炎（，）是一种涉及透明关节软骨、软骨下骨、韧带、关节囊、滑膜和关节周围肌肉的全关节疾病。病变最终为软骨下区的钙化，临床表现主要为膝关节疼痛、僵硬、活动受限。流行病学资料显示，的发病率高达，女性高于男性。非甾体类清炎药是治疗 的首选药物，但不能延缓病情进展。有研究表明，膝关节镜治疗 收效甚微，且存在明显损伤风险。在接受全关节置换术的终末期 患者中，术后年仍存在疼痛和残疾的比例高达。中医学将 归于“骨痹”“历节病”等范畴，病机总属“本虚标实”，以补益肝肾、益气养血治本，以温经散寒、通络止痛治标。李亮等认为，关节为多气多血之节，年老体弱，肝肾亏虚，又易感外邪，肝肾致筋弛，肾虚使骨弱，肝肾亏虚则精血乏源，故治疗多以补肾填精，祛风除湿为主。刘立萍等研究发现，补肾填精法能通过调节型胶原的合成和分解代谢过程，促进骨形成，降低骨吸收，抑制卵巢切除（）后大鼠的高转化状态。本文以网络药理学为基础，从整体上分析淫羊藿与附子配伍治疗 的可能作用靶点及途径，为今后药物的研发和临床应用提供参考。资料与方法 数据库及应用的软件本研究主要使用的数据库和分析软件包括中药系统药理学分析平台（）数据库（：）、数据库（：）、数据库（：）、数 据 库（：）、在线人类孟德尔遗传（）数据库（：）、数据库（：）、数 据 库（：）、数据库（：）、在线作图（：）、微生信在线作图（：）等平台。方法 淫羊藿附子的活性成分及其靶点的筛选使用 数据库，分别以“淫羊藿”“附子”为关键词进行检索，获取药物的活性成分，并结合相关文献进行补充。利用 平台对主要化合物的吸收（，）、分 布（，）、代 谢（，）、排泄（，）进行评估，传统中药口服进入人体必然经过 才能发挥药效，因此引用口服生物利用度（，）和类药性（，）两个参数对化合物进行筛选。筛选后分别挖掘两种药物活性成重庆医学 年月第 卷第期分对应的药物靶点。通过 数据库、化源网（：）平台检索补充化合物的 结构式和 结构，经 筛选后将符合标准的化学成分传入 数据库预测药物的作用靶点。蛋白与基因信息校正由于数据库检索到的靶点可能存在命名不规范或来源于不同物种的情况，需将整合后的靶点信息进行规范化处理。进入 数据库，使用 功能，首先限定搜索条件为“”“”，然后输入蛋白名称，检查校对并摘录检索到的“”和“”，获取药物准确的靶点信息。相关靶点的收集通过 、数 据 库，以“”或“”为关键词获取相关基因，将以上数据库的结果合并后去重，得到相关基因。药物疾病交集靶点、药物活性成分作用靶点的构建将淫羊藿附子的活性成分作用靶点与靶点分别导入 在线作图工具，获得药物疾病的交集靶点及韦恩图；将交集靶点、药物活性成分导入 软件，构建“药物活性成分靶点”网络。蛋白互作（，）网络的构建将药物疾病共同靶点导入 数据库中，选择“”进行 分析，物种限定“（人类）”，选择置信度评分 。下载 文件，导入 软件对数据进行可视化分析，以各靶点的 值为指标筛选出 网络的核心基因，并利用微生信在线绘制 值排列在前 的水平柱状图。生物学功能与京都基因与基因组百科全书（）通路的富集分析将交集靶点导入 平台后，分别进行基因本体（）功能和 通路分析，下载数据并利用微生信在线作图平台绘制气泡图。结果 淫羊藿附子有效活性成分及靶点的筛选应用 平台，分别搜索关键词“淫羊藿”“附子”，依据 ，进行筛选，共获得 个有效活性成分，其中淫羊藿 个，附子 个，基本信息见表；再利用 数据库搜索各活性成分对应的靶 点 信 息，整 合去重，共获 得 个相关靶点。表淫羊藿附子有效成分信息表药物编号 主要活性成分（）淫羊藿 ，（），（），（）重庆医学 年月第 卷第期续表淫羊藿附子有效成分信息表药物编号 主要活性成分（）附子 ，疾病靶点的筛选结果通过 、等数据库并结合相关文献，共获得疾病靶点 个，上述数据库得到的靶点数分别为 、和，去除重复值后，最终获得疾病靶点 个。药物疾病交集靶点、药物活性成分作用靶点的构建将淫羊藿附子及的靶点导入 在线作图，共获得基质金属蛋白酶（）、肿瘤坏死因子（）、血管内皮生长因子（）、白细胞介素（）等交集靶点 个，见图。建立药物疾病的属性文件和网络文件，导入 软件构建药物活性成分靶点网络图，见图。利用 软件中的 工具计算有效成分的 值，排名前位的分别为槲皮素、山奈酚、木犀草素，后依次为淫羊藿苷、乌头碱、次乌头碱、中乌头碱等。网络结果分析将 个交集靶点导入 数据库中，择置信度 评 分 ，导 出 文 件 后，导 入 软件，得到 个节点，条边。中节点的面积大表示 值越高，作用越强，见图。其次，使用软件中 应用中的 算法获取 网络的核心基因，有、丝氨酸苏氨酸蛋白激酶（）、血管内皮生长因子（）、肿瘤蛋白（）、前列腺素内过氧化物合酶（）、表皮生长因子受体（）、雌激素受体（）等。生物学功能和 通路的富集分析应 用 数 据 库 对 淫 羊 藿 与 附 子 治 疗的相关靶点进行生物功能富集分析，时获得的功能条目 条，其中生物过程（）条，分子功能（）条，细胞组分（）条。主要参与的 包括细胞对脂质的反应、细胞对缺氧的反应、细胞迁移的正反馈等；主要富集在细胞因子活性、信号受体调节活性、细胞因子受体结合等；主要富集在膜阀、细胞外基质、膜微区等，见图。分析结果显示，共有 条通路，根据值利用微生信在线作图平台对前 条信号通路绘制气泡图，见图。其中主要涉及晚期糖基化终产物（）信号通路、磷脂酰肌醇激酶蛋白激酶（）信 号 通 路、脂 质 和 动 脉 粥 样 硬化等。图淫羊藿附子治疗膝骨关节炎靶点的韦恩图重庆医学 年月第 卷第期圆形：活性成分；矩形：值；：淫羊藿；：附子；：孕激素受体；：羟色胺转运蛋白基因；：一氧化氮合酶；：雄激素受体；：过氧化物酶体增殖物激活受体；：二肽基肽酶；：凝血因子；：血管内皮生长因子受体；：溶质载体家族；：原癌基因；：细胞淋巴瘤白血病基因；：黄嘌呤脱氢酶；：信号转导子和转录激活子；：细胞色素 ；：细胞间黏附分子；：选择素；：血管细胞黏附分子；：核受体亚家族；：谷胱甘肽硫转移酶 ；：细胞周期蛋白；：细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂；：胱天蛋白酶；：抑制剂；：淀粉样前体蛋白；：受体酪氨酸激酶；：酪氨酸酶；：干扰素；：配体；：尿激酶；：超氧化物歧化酶；：热休克蛋白家族亚型；：原癌基因；：凝血因子；：缝隙连接蛋白；：基序趋化因子配体；：基序趋化因子配体；：转化生长因子；：纤溶酶原激活物；：血栓调节素；：丝氨酸蛋白酶抑制剂家族成员；：型胶原蛋白 链；：磷酸酶和张力蛋白同源物；：聚腺苷二磷酸核糖聚合酶；：过氧化物酶体增殖物激活受体；：反应蛋白；：分泌型磷蛋白；：家族转录因子；：胰岛素样生长因子；：己糖激酶。图淫羊藿附子干预的药物活性成分靶点网络图 ：孕激素受体；：羟色胺转运蛋白基因；：一氧化氮合酶；：雄激素受体；：过氧化物酶体增殖物激活受体；：二肽基肽酶；：凝血因子；：血管内皮生长因子受体；：溶质载体家族；：原癌基因；：细胞淋巴瘤白血病基因；：黄嘌呤脱氢酶；：信号转导子和转录激活子；：细胞色素 ；：细胞间黏附分子；：选择素；：血管细胞黏附分子；：核受体亚家族；：谷胱甘肽硫转移酶 ；：细胞周期蛋白；：细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂；：胱天蛋白酶；：抑制剂；：淀粉样前体蛋白；：受体酪氨酸激酶；：酪氨酸酶；：干扰素；：配体；：尿激酶；：超氧化物歧化酶；：热休克蛋白家族亚型；：原癌基因；：凝血因子；：缝隙连接蛋白；：基序趋化因子配体；：基序趋化因子配体；：转化生长因子；：纤溶酶原激活物；：血栓调节素；：丝氨酸蛋白酶抑制剂家族成员；：型胶原蛋白 链；：磷酸酶和张力蛋白同源物；：聚腺苷二磷酸核糖聚合酶；：过氧化物酶体增殖物激活受体；：反应蛋白；：分泌型磷蛋白；：家族转录因子；：胰岛素样生长因子；：己糖激酶。图淫羊藿附子与靶点的 网络重庆医学 年月第 卷第期横坐标轴从左至右依次为：细胞对脂质的反应；：对激素的反应；：细胞黏附的控制；：细胞迁移的正向调节；：细胞运动的正向调节；：细胞成分移动的正向调节；：运动的正向调节；：细胞分化的负调控；：对细胞因子的反应；：对肽的反应；：膜筏；：膜微区；：薄膜侧面；：细胞外基质；：外膜封装结构；：细胞膜外侧；：转录调节复合体；：细胞质核周区域；：含有胶原的细胞外基质；：内质网腔；：信号受体调节活性；：信号受体激动剂活性；：受体配体活性；：细胞因子活性；：细胞因子受体结合；：转录因子结合；：蛋白质结构域特异性结合；：结合转录因子；：脂质结合；：蛋白质同源二聚化活性。图淫羊藿附子主要成分潜在靶点的富集分析 ：信号通路在糖尿病中的作用；：前列腺癌；：信号通路；：流体剪切应力与动脉粥样硬化；：恰 加 斯 病；：信 号 通 路；：脂 质 与 动 脉 硬 化；：丙 型 肝 炎；：蛋 白 聚 糖 在 癌 症 中 的 作 用；：乙型肝炎；：甲型流感；：人巨细胞病毒感染；：化学致癌作用受体激活；：病毒感染；：卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染；：癌症中的转录调控异常；：癌症通路；：信号通路；：人乳头瘤病毒感染；：癌症中的微。图淫羊藿附子与作用靶点的 富集分析示意图重庆医学 年月第 卷第期讨论药对是中医临床常用的相对固定的两味中药的配伍组合，是历代医家长期医疗实践的经验总结，具有组成简单、疗效确切等优势。而网络药理学是一项基于计算机辅助算法和虚拟模型构建的创新技术，可将化合物映射到疾病基因网络中，用于实现多靶点预测，为 中 药 药 对 的 研 究 提 供 了 一 种 新 的 方 法 和策略。淫羊藿与附子是中医治疗膝痹的常用药对，具有补肾填精、散寒止痛、祛风除湿之效。在 本草纲目中称淫羊藿有“益精气，坚筋骨，补腰膝，强心力”之效，在长期临床实践中常用于肾阳亏虚、寒湿痹痛、筋骨萎软无力等病症。淫羊藿治疗在临床上已使用多年，并取得明确疗效。药理学研究发现淫羊藿苷具有调节骨代谢、抗炎等作用，常用于骨质疏松、等治疗。附子性味辛、甘、大热。伤寒论 云：“少阴病、身体痛、手足寒、骨节痛、脉沉者，附子汤主之”。金匮要略 亦云：“诸肢节疼痛，身体尫羸，脚肿如脱，头眩短气，温温欲吐，桂枝芍药知母汤主之。”综上，张仲景在治疗骨节病常选用附子温阳散寒、止痹痛。本研究利用网络药理学的方法，获得淫羊藿附子药对有效活性成分 个，通过可视化分析及结合相关文献筛选出淫羊藿与附子治疗的关键成分是槲皮素、山柰酚、木犀草素、淫羊藿苷元等。槲皮素是类黄酮类化合物的主要代表，是常见的抗氧化剂，具有抗炎、清除自由基、抗感染等多种生物效应 ，可有效延缓 的病程。研究表明，槲皮素干预有丝分裂原激活蛋白激酶 （）信号通路后 的炎症因子水平明显降低，不仅抑制 、解聚蛋白样金属蛋白酶等因子的表达，而且促进骨胶原蛋白表达，。山柰酚是一种膳食生物类黄酮。动物实验表明，山奈酚抑制脂肪生成、炎症、氧化应激、破骨细胞自噬和成骨细胞凋亡的同时，能激活成骨细胞自噬，实现骨保护作用。在炎症部位环氧化酶（）代谢花生四烯酸（）产生炎症介质前列腺素（）；此外，在炎症和免疫反应中起重要作用并调节途径的酶还有磷脂酶（）和脂氧合酶（）。而山柰酚在体外无细胞检测中对 和 表现出强烈的抑制作用。同时，有研究也报道了山奈酚在体外和体内条件下对 的抑制作用。木犀草素可以降低、等介质的表达，减少巨噬细胞的炎症反应。动物研究发现，通过激活磷酸化信号传导和转录激活因子（）和抑制磷酸化信号传导和转录激活因子（）等蛋白通路，木犀草素使巨噬细胞完成从促炎性 表型到抗炎性 表型的极化，从而发挥抗炎作用。等 研究发现，木犀草素通过抑制诱导软骨细胞死亡、凋亡和炎性介质产生的过氧化氢（），激活磷酸腺苷活化蛋白激酶核因子 相关因子（）信号通路，减轻小鼠软骨细胞炎症反应和氧化损伤从而发挥软骨保护作用。淫羊藿苷通过促进软骨细胞分化、减少软骨细胞凋亡和增加软骨细胞分泌特定细胞外基质（）成分发挥骨保护作用 。此外，在小鼠体内研究中淫羊藿苷能增加软骨厚度，减少软骨细胞肥大和 表达。这一系列研究表明，淫羊藿与附子可能使软骨修复和再生，有效延缓骨关节炎发展的进程。本研究通过 数据库进行 分析，按照 值获得关键靶点、等。流行病学研究表明，关节软骨损伤的进展与反应性或炎症性滑膜的存在明显相关。分泌的促炎因子，如、是关节组织紊乱和分解代谢增强的关键介质。临床试验表明，患者 基线水平与软骨丢失风险呈正相关。由软骨细胞、滑膜组织等产生，能刺激软骨细胞释放出破坏软骨的蛋白水解酶，如、等。研究发现，能抑制软骨细胞中蛋白多糖、连接蛋白和型胶原合成，介导关节软骨损伤，加剧关节退化。还降低了清除活性氧的抗氧化酶表达，包括超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶，加速了活性氧对软骨的破坏。是丝氨酸苏氨酸蛋白激酶之一，主要参与调节代谢、增殖、细胞存活和血管生成在内的许多过程，其在 患者的关节软骨、滑膜、关节液和血清中 表达升高。用 处理大鼠关节软骨细胞降低了关键细胞外基质成分的表达，抗 抗体治疗增加了关节软骨中蛋白聚糖和型胶原的表达。在软骨和滑膜内，能自动刺激自身生成，并诱导软骨细胞产生一氧化氮（）、蛋白酶等分解代谢基质，加剧关节软骨基质退化。因此，、是治疗 疾病的关键基因。本研究通过 富集分析发现，细胞对脂质及缺氧的反应等生物学过程可能与 的发生密切相关。是一种代谢性疾病，在疾病早期阶段可以观察到关节内的脂质沉积。等 研究表明，可以通过调控参与胆固醇代谢的胆固醇 羟化酶氧固醇 羟化酶视黄酸相关受体轴（）抑制软骨细胞的分解代谢，减少 产生。氧气水平的调节抑制了软骨表型的表达和软骨特异性基质的形成，减少了细胞死亡和基质退化。通过对药物与疾病交集靶点进行 分析并重庆医学 年月第 卷第期结合相关文献发现，淫羊藿与附子治疗骨关节炎的通路主要有 信号通路（）、信 号 通 路（）、脂 质 和 动 脉 粥 样 硬 化（）。软骨退变的一个显著特征是软骨胶原等蛋白质中积累 。的生物活性是由特定的 受体（）介导的。的激活涉及相关的促炎症反应信号通路，进而导致各种炎症基因的激活。中 的激活可刺激软骨细胞和滑膜细胞，导致的产生增加。研究发现，肥胖患者的脂肪组织分泌与 相关的脂肪因子（瘦素、脂联素）和促炎细胞因子（、），这表明脂质代谢紊乱和骨代谢紊乱是相关的。脂质和动脉粥样硬化通路可通过抑制脂肪组织分泌的脂肪因子，降低血浆中促炎介质的水平，进而缓解的症状。患者软骨组织中的 通路下调，通路通过阻断 和脂多糖（）减少软骨细胞凋亡，故推测淫羊藿与附子可以通过激活 信号通路从而抑制炎性介质释放和维持软骨内稳态。综上所述，药物的同一活性成分可以调控不同靶点，同一靶点干预不同生物学过程和信号通路，这体现了淫羊藿附子治疗多成分、多靶点、多通路的特点，为临床运用淫羊藿附子治疗提供了科学依据。但限于该研究以生物信息学和现有网络数据库为基础，后期在此基础上还需进一步实验验证。参考文献 ，（）：王斌，邢丹，董圣杰，等中国膝骨关节炎流行病学和疾病负担的系统评价中国循证医学杂志，（）：，：，（）：中华中医药学会骨伤科分会膝痹病（膝骨关节炎）临床诊疗指南制定工作组 中医骨伤科临床诊疗指南：膝痹病（膝骨关节炎）康复学报，（）：李亮，曹日隆，刘安平，等 膝痹病的中医认识及治疗研究概况 中医药临床杂志，（）：刘立萍，李然，李雪峰，等 补肾填精方对快速老化模型小鼠活化的 细胞转录核因子蛋白表达的影响 时珍国医国药，（）：，：，（）：顾俊菲，刘培，陶伟伟，等 药对配伍策略及其内在机制研究述评 中华中医药杂志，（）：解静，高杉，李琳，等网络药理学在中药领域中的研究进展与应用策略中草药，（）：李睿，杨信信，张小辉，等 淫羊藿苷治疗骨性关节炎的研究进展中国骨质疏松杂志，（）：傅文录张仲景应用附子的经验河南中医，（）：，：，：，（）：王象鹏，谢文鹏，毕亦飞，等 基于 信号通路分析槲皮素保护骨性关节炎关节软骨的机制 中国实验方剂学杂志，（）：应建伟，叶承锋，余锋平 附子汤对三种骨关节炎 大 鼠、表达的实验研究浙江中医杂志，（）：，：，：，：，：，重庆医学 年月第 卷第期 ，（）：，（）：，：，：，（）：，：，（）：，：（），（）：，：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，：（收稿日期：修回日期：）重庆医学 年月第 卷第期