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益气定眩饮通过Nod样受体.性脑卒中大鼠炎症因子的研究_王思雨.pdf
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1、探讨益气定眩饮调节糖尿病合并缺血性脑卒中大鼠Nod样受体蛋白-3(NLRP3)炎性小体及白介素-18(IL-18)、IL-1炎症因子的作用及机制。方法:将130只SD雄性大鼠复制糖尿病合并缺血性脑卒中动物模型并进行研究,成模后采用随机数字表法分为空白组、模型组、益气定眩饮组、丁苯酞胶囊组、益气定眩饮联合丁苯酞胶囊组。分别给予蒸馏水及相应药物干预3 d后,收集大鼠血清及脑组织。采用神经功能评分法评估大鼠神经功能变化;苏木精-伊红染色法观察脑组织形态结构;酶联免疫吸附测定检测血清炎症因子IL-18、IL-1水平;逆转录PCR检测NLRP3炎症小体及半胱天冬酶-1(Caspase-1)表达。结果:与
2、空白组比较,模型组均可改变大鼠脑组织结构,神经功能评分、IL-18水平、IL-1水平、NLRP3 mRNA及Caspase-1 mRNA表达升高(P0.05);与模型组比较,用药组均可改善大鼠脑病变组织结构,神经功能评分、IL-18水平、IL-1水平、NLRP3 mRNA及Caspase-1 mRNA表达降低(P0.05),且与单一用药比较,联合用药组IL-18水平、IL-1水平、NLRP3 mRNA及Caspase-1 mRNA表达降低(P16.7 mmol/L且33.3 mmol/L为造模成功。130只大鼠均造模成功,随机分为大脑中动脉栓塞造模组(110只)和假手术组(20只)。大脑中动脉
3、栓塞(MCAO)模型:110只糖尿病模型大鼠右下腹腔注射麻醉,充分暴露颈部皮肤并在气管右侧切口,分离并暴露颈内、外、总动脉,夹闭颈总、结扎颈外动脉,并在暴露的颈内动脉中下段开口置线栓,扎紧线栓上下两端,取下动脉夹,缝合皮肤,创面予以青霉素,术后常规处理。假手术组:操作同上,在暴露颈内、外、总动脉后直接缝合皮肤,创面予以青霉素,术后常规处理。术后2 h进行神经功能评分,根据Zea-Longa评分法,评分13分为造模成功。MCAO造模过程中10只大鼠死亡,100只大鼠造模成功。将造模成功大鼠随机分为模型组、益气定眩饮组、丁苯酞组、益气定眩饮联合丁苯酞组,每组25只。1.5实验给药根据人与动物体表面
4、积折算,人用剂量200g/d,大鼠等效剂量为200 g/d0.018/0.2 kg=18 g/(kg d)。将中药材以清水浸泡30 min后,水煎煮2次,每次煎得药液200 mL,合并药液,煎煮浓缩至100 mL,冷却后置于4冰箱冷藏备用。药液所含生药为2g/mL。丁苯酞软胶囊:根据人与动物体表面积折算,人用剂量600 mg/d,大鼠等效剂量为600 mg/d0.018/0.2 kg=54 mg/(kg d),具体给药剂量见表1。连续给药3 d。给药过程中55只大鼠死亡,其中假手术组5只、模型组11只、益气定眩饮组12只、丁苯酞胶囊组14只、益气定眩饮联合丁苯酞组13只,考虑术后感染导致。给药
5、3d后,每组大鼠随机选取13只大鼠进行检测。neural function score,the content of IL-18 and IL-1,the expression of NLRP3 mRNA and Caspase-1 mRNAwere increased(P0.05).Compared with the model group,the expression of NLRP3 mRNA and Caspase-1mRNA,the content of IL-18 and IL-1,the expression of NLRP3 mRNA and Caspase-1 mRNA in
6、 druggroups were decreased(P0.05),and compared with the single drug group,the content of IL-18 and IL-1,theexpression of NLRP3 mRNA and Caspase-1 mRNA in the combined drug group decreased(P0.05).Conclusion:Yiqi Dingxuan Decoction can improve the brain damage of diabetic rats with ischemic srtoke,dec
7、rease theexpression of NLRP3,Caspase-1 protein and serum IL-18,IL-1,relieve the inflammatory state,and play atherapeutic role,and the combination of butylphthalide has better effect.Keywordsdiabetic;ischemic strok;Yiqi Dingxuan Decoction;butylphthalide;NLRP3 inflammasome;rat152023年2月第29卷第2期February.
8、2023 Vol.29 No.2表 1大鼠分组及给药分组动物数(只)处理方式给药剂量假手术组20无等体积蒸馏水模型组25MCAO+STZ注射等体积蒸馏水益气定眩饮组25MCAO+STZ注射9 mL/kg,按体积给药丁苯酞组25MCAO+STZ注射54 mL/kg,按体积给药益气定眩饮联合丁苯酞组25MCAO+STZ注射同上,联合给药1.6观察指标1.6.1神经功能学评分分别于给药24、72 h后对各组大鼠采用Zea-Longa评分法检测神经功能。标准:(1)无神经功能损伤,大鼠行为活动、摄食进水无障碍,为0分;(2)提起大鼠尾巴悬空,有左侧前肢屈曲,为1分;(3)大鼠放在水平平板上,左侧转圈,
9、为2分;(4)大鼠放在水平平板上,轻推即向左侧倾倒,为3分;(5)大鼠左侧偏瘫,不能自发行走,或丧失意识,为4分。1.6.2HE染色采血完成后,用滴管从左心房依次滴入生理盐水及多聚甲醛,2 h后断头取全脑放入含多聚甲醛的标本瓶内低温浸泡2 d,隔天换液。梯度蔗糖溶液脱水3 d后用冰冻切片机切片(厚度1.5 mm),进行HE染色观察脑组织情况。1.6.3Westen blotting检测NLRP3、Caspase-1蛋白表达麻醉后腹腔采血,用适量生理盐水灌注,断头取脑,离心、分离、提纯,检测NLRP3、Caspase-1蛋白相对表达量。1.6.4RT-qPCR检测NLRP3 mRNA、Caspa
10、se-1 mRNA表达麻醉后腹腔采血,用适量生理盐水灌注,断头取脑,离心、分离、提纯,检测血清NLRP3 mRNA、Caspase-1 mRNA含量。1.6.5ELISA检测血清IL-1、IL-18水平麻醉后腹主动脉采血,采血管在室内常温下静置0.5 h,离心后提取血清,参照试剂盒提示步骤完成操作,检测血清IL-1、IL-18水平。1.7统计学方法采用SPSS 25.0软件进行分析。多组间比较采用单因素方差分析,若方差齐,组间采用LSD-t检验,若不齐,采用Tamhane s T3检验。P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1神经功能评分结果给药24、72 h后,各组大鼠进行神经功能学评分,
11、结果发现,假手术组大鼠为0分;24 h后,与模型组相比较,联合用药组评分降低,差异有统计学意义(P0.05);72 h后,给药组评分均有下降(P0.05),且联合用药组效果更为明显(P0.05)。(见表2)2.2脑组织HE染色结果假手术组可见正常细胞形态结构、排列有序,核仁清晰可见,胞质着色较深。模型组细胞肿胀、排列疏松,有空泡形成,核仁固缩,胞质着色较浅,且与72 h相比,24 h更为明显。与模型组比较,给药组细胞形态结构较为完整,排列较为紧密,胞质着色加深;联合用药组与单一给药组比较,细胞形态更为完整,排列更加紧密,空泡较少,且与24 h相比,72 h效果更为明显。(见图1)表 2大鼠神经
12、功能评分结果(xs,分)组别动物数(只)24 h72 h假手术组130a0a模型组133.300.553.400.47益气定眩饮组132.900.731.900.56a丁苯酞组133.000.642.100.52a联合用药组132.600.36a1.500.44abF419.558377.866P0.0000.000注:与模型组比较,aP0.05;与单一用药组比较,bP0.052.3缺血侧脑组织中NLRP3、Caspase-1蛋白表达水平与模型组比较,给药组各时间点NLRP3、Caspase-1蛋白含量均有降低(P0.05);与单一用药相比,联合用药组大鼠各时间点NLRP3、Caspase-1
13、蛋白表达均降低(P0.05),提示联合用药可减轻脑组织炎症损伤。(见图24)注:Sham:假手术组;MCAO:模型组;YQDXY:益气定眩饮组;DBTJN:丁苯酞胶囊组;LHYY:益气定眩饮联合丁苯酞组图 2各组大鼠脑组织中 NLRP3、Caspase-1 蛋白表达Western blotting 图注:Sham:假手术组;MCAO:模型组;YQDXY:益气定眩饮组;DBTJN:丁苯酞胶囊组;LHYY:益气定眩饮联合丁苯酞组图3 各组大鼠脑组织中NLRP3蛋白相对表达量比较(xs,n=13)假手术组模型组益气定眩饮组丁苯酞胶囊组益气定眩饮联合丁苯酞组图 1各组大鼠脑组织形态学表现(HE,200
14、)24 h72 h162023年2月第29卷第2期February.2023 Vol.29 No.2注:Sham:假手术组;MCAO:模型组;YQDXY:益气定眩饮组;DBTJN:丁苯酞胶囊组;LHYY:益气定眩饮联合丁苯酞组图 4各组大鼠脑组织中 Caspase-1 蛋白相对表达量比较(xs,n=13)2.4缺血侧脑组织中NLRP3 mRNA、Caspase-1 mRNA表达情况与模型组比较,用药干预后24 h及72 h均能不同程度降低大鼠海马组织NLRP3 mRNA(P0.05),且相同时间点的联合用药组干预效果更佳(P0.05)。(见图56)注:Sham:假手术组;MCAO:模型组;YQ
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